慢病毒载体在人角质形成细胞基因组中的整合位点分析.doc

慢病毒载体在人角质形成细胞基因组中的整合位点分析
钱卫[基金项目] 国家自然科学基金面上项目（81071575）；国家重点实验室I类课题（SKLZZ200904）
[通讯作者] 彭代智，电话：[phone]，E-mail：dzpengpub@
，彭代智，刘小玲，李睿夫，舒文婷，何传果，刘潇，周新，刘敬
（400038重庆，第三军医大学西南医院全军烧伤研究所，重庆 400038创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室）
[摘要] 目的 探讨应用连接介导PCR（Ligation-mediated PCR，LM-PCR）技术和在线工具GTSG-QuickMap分析检测慢病毒载体(1entiviral vector)在人角质形成细胞基因组中的整合的位置效应。位点，初步分析慢病毒载体在表皮细胞基因组中的整合位点分布规律，为慢病毒载体基因治疗的潜在风险提供实验依据。方法 以本课题组前期研究中构建的慢病毒载体感染后的人永生化角质形成细胞系为研究对象，应用连接介导PCR（Ligation-mediated PCR，LM-PCR）技术克隆慢病毒介导的转基因整合位点宿主-载体连接的DNA序列并测序，测序克隆片段后经在线工具GTSG-QuickMap在人类基因组上定位，从而得到整合位点。再从染色体、基因及其转录起始位点与整合位点分布的关系来分析慢病毒载体在人角质形成细胞基因组中的整合倾向。结果 对1148个阳性转化子DNA测序及定位分析，共得到199个整合位点。与GTSG-QuickMap模拟的随机对照相比，慢病毒载体的整合频率在第4、5、15、16号染色体上、基因转录起始位点上游5 kb至50 kb范围内显示出统计学显著性差异。结论 发现了慢病毒载体倾向于整合在人角质形成细胞基因组中的基因转录起始位点附近区域，而并不偏好整合在基因内部的新的整合模式，为应用慢病毒载体整合外源基因用于基因治疗的风险评估提供了实验依据。慢病毒载体倾向整合于人永生化角质形成细胞系基因组中的基因转录起始位点附近区域，而并不偏好整合在基因内。本研究提示慢病毒载体在人角质形成细胞基因组内呈现出一种新的整合模式。
[关键词] 慢病毒载体；人角质形成细胞；连接介导PCR；整合位点；整合频
率；整合倾向
[中图法分类号]
Analysis of Lentiviral Vector Integration Preference in Human Keratinocytes
Qian Wei, PengDaizhi, Liu Xiaoling, Li Ruifu, ShuWenting, He Chuanguo, Liu Xiao, Zhou Xin, Liu Jing (Institute of Burn Research, Southwest Hospital, State Key Laboratory of Trauma, Burns and Combined Injury, Third Military Medical University, Chongqing, 40038, China)
_____________________________
[基金项目] 国家自然科学基金面上项目（81071575）；国家重点实验室I类课题（SKLZZ200904）
[通讯作者] 彭代智，电话：[phone]，E-mail：dzpengpub@

[Abstract] ObjectiveTodetermine lentiviral vector integration sites in human keratinocytes，to make a preliminary analysis of lentiviral vector integration preference in human epidermal cells and provide experimental evidences for the latent risk of gene therapy. MethodsLigation-mediated PCR(LM-PCR) was used in human immortalized keratinocyte lineinfected by lentiviral vector from our previous study. The corresponding fragments of host-vector DNA junctionswere cloned and sequenced. Thesesequence reads were then inputted into the online tool GTSG-QuickMap as requested and mapped in the human genome to locate the integration sites. The integration preference of lentiviral vector in human keratinocytes was further analyzed in view of the relationship between integration sites distribution and chromosomes, genes and transcription start sites. Results 1148 positive transformants were selected and sequenced, but only 199 unique integration sites were gained. Compared to that of the matched random control simulated by GTSG-QuickMap, the integration frequencies of lentiviral vector in chromosomes 4, 5, 15, 16 and 5 kb ~ 50 kb upstream region of transcription start sites showed statistically significant differences. Conclusion Lentiviralvector preferentially integrates into the vicinity of transcription start sites with no favor for genesin the genome of human immortalized keratinocyte line.This study reveals thata novel integration pattern of lentiviral vector occurs in humankeratinocytes.
[Key words] lentiviral vector;human keratinocyte; ligation-mediated PCR; integration site; integration frequency; integration preference
Supported by the grants from National Natural Science Foundation of China (No. 81071575) and State Key Laboratory of Trauma, Burns and Combined Injury of China (No.SKLZZ200904). Corresponding author: Peng Daizhi, Tel: [phone], E-mail：dzpengpub@

逆转录病毒载体是常用的外源基因整合性载体，对基因治疗和转基因动物载体研究。利用该类载体将外源基因导入靶细胞，能使该基因获得长期稳定的表达，对转基因基础研究及基因治疗临床应用研究具有重要价值。但是，目前慢病毒载体尚不能将目的基因插入特定位点，当该类载体异位整合于靶细胞染色体基因组中，原病毒（provirus）与宿主（host）之间相互作用，极有可能导致转基因表达沉默及插入性诱变（insertional mutagenesis）等不良事件（adverse events）的发生。由于整合位点的不同而造成的基因治疗效果的差异，因此，分析逆转录病毒及其载体在宿主基因组中的整合位点及其分布倾向，已经成为评价载体应用安全性的一个重要手段之一[1]。以前人们认为逆转录病毒及其载体整合是随机的，无一定的规律性。但是现在的研究已经发现这并不是随机的，其整合位点在某些特定区域显示出一定的分布倾向，并且不同的逆转录病毒及其载体的整合倾向各异[2, 3]。一些研究报道表明，整合倾向不仅与病毒的种类有关，同时与靶细胞组织类型也有关系[4]。
慢病毒载体是以慢病毒（包括人类免疫缺陷病毒I型（HIV-I）、猴免疫缺陷病毒(SIV)、猫免疫缺陷病毒（FV）、马传染性贫血病毒（EIAV）等）为来源的一类特殊逆转录病毒载体，并且与其他逆转录病毒载体（如鼠白血病病毒(MLV)）和腺病毒载体相比，具有稳定整合于靶细胞的基因组感染率高、转移基因片段容量较大、目的基因表达时间较长、不易诱发宿主免疫反应小等优点，弥补了常用逆转录病毒载体（如鼠白血病病毒(MLV)）和腺病毒载体的缺陷，适于细胞基因修饰及体内基因治疗。目前，慢病毒载体在皮肤细胞基因修饰、皮肤遗传病基因治疗中已经得到较好的应用[5, 6]，但其生物安全性问题尚不清楚。国内外有关慢病毒载体在表皮细胞基因组中的整合倾向性并无报道。在本研究应用中，以本课题组前期研究中慢病毒感染后的人永生化角质形成细胞系为研究对象，探索慢病毒载体在表皮细胞基因组中的整合位点分布规律，以预期为慢病毒载体在皮肤病基因治疗表皮细胞研究中应用的生物安全性评价提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 细胞来源、主要试剂
本研究所用实验细胞为本室实验人员先前构建的课题组前期研究中慢病毒感染后的人永生化角质形成细胞系（HaCaT）[5]。HyClone改良型RPMI-1640培养基（赛默飞世尔生物化学制品（北京）有限公司）、优级新生牛血清（兰州民海生物工程有限公司）、DNeasy Blood & Tissue Kit（QIAGEN，Germany），MseI酶、PstI酶、高浓度（5×）T4 DNA 连接酶（NEB，USA），Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity、TOPO TA Cloning Kit for Sequencing（Invitrogen，USA），MseI连接子序列及引物序列，由生工生物工程（上海）有限公司合成。请规范表述

1.2 细胞培养与细胞基因组总DNA的提取
将1.1中所述的细胞培养于含10 %新生牛血清的改良型RPMI- 1640培养基中，置于37 °C、饱和湿度、5 % CO2的培养箱中培养。取刚汇合生长的细胞进行传代，取对数生长期的细胞提取基因组总DNA。DNA提取按照QIAGEN 的DNeasy Blood & Tissue Kit 说明书操作。
1.3 基因组DNA限制性酶切
采用Primer Premier 5.0 软件对前期研究中感染人永生化角质形成细胞系所用的慢病毒载体pHSER-dsRNA-GFP-SIN的序列进行限制性酶切位点分析，确定采用Mse I（NEB公司）和Pst I（NEB公司）对细胞基因组DNA进行酶切消化。具体反应体系如下：：
10 × NEB buffer 3 2.0 μl，
100× BSA 0.2 μl，
DNA 1.0 μg，
Mse I、Pst I 各1.0 μl (10U)，双蒸水补足
H2O 加至总体积20.0 μl，混合后
37 °C恒温水浴2h30min，然后80 °C恒温水浴20 min。 酶切产物如何获取和保存

1.4 Mse I连接子退火
Mse I连接子序列为：
Linker + (5'–GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC-3’)；
Linker - (5'–PO4-TAGTCCCTTAAGCGGAG-NH2-3’)。
于生工生物工程（上海）有限公司合成后，溶于STE缓冲液（10 mmol/LTris pH 8.0, 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA）中，各取5 μl，混匀后置于Bio-Rad DNA Engine型PCR仪上从98 °C至4 °C（每分钟下降1 °C）进行退火，后置于-20 °C冻存30 min。4个溶解-冷冻循环后，按上述条件重复做一次退火。
1.5 Mse I连接子连接
按照NEB公司T4连接酶说明书操作，具体反应如下体系：
1.3中的酶切产物 10.0 μl
10 × NEB ligase buffer 1.4 μl，
1.4 中已退火的100 μmol/L Mse I连接子1.0 μl，
高浓度（5×）T4 DNA 连接酶 1.0 μl，
16 °C恒温水浴3 h后，置于室温临时保存。
1.6 巢式PCR
针对连接子序列和慢病毒载体末端LTR区，参照文献[4, 7]，分别设计两对特异的巢式PCR引物，引物序列如下：
① Mse I linker primer（5'–GTAATACGACTCACTATAGGGC-3’）
② Mse I linker nested primer（5'–AGGGCTCCGCTTAAGGGAC-3’）
③ 5'LTR primer（5'–GAGGGATCTCTAGTTACCAGAGTCACA-3’）
④ 5'LTR nested primer（5'–AGCCAGAGAGCTCCCAGGCTCAGATC-3’）
第一轮PCR：按照Invitrogen公司Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity说明书操作。具体反应如下体系：
10 × High Fidelity PCR Buffer 5.0 μl，
50 mmol/L MgSO4 2.0 μl
1，10 mmol/L dNTP mixture 1.0 μl，
10 μmol/L primer①、③各1.0 μl，
Platinum Taq High Fidelity 0.2 μl，
DNA模板(1.5中的连接产物) 1.0 μl，
H2O 加双蒸水补足至总体积50.0 μl。反应条件：
25个循环：95 °C, 热启动2 min，, (95 °C, 变性15 s，ec, 55 °C退火, 30 sec, ，72 °C延伸, 1 min，)x25个循环。
第二轮PCR：使用第一轮PCR产物1 μl，②、④作引物，其余反应条件反应体系何在？
同上。
将第二轮PCR产物在1 %琼脂糖凝胶上进行电泳, 另将1.2中的细胞基因组总DNA、1.3中的双酶切产物、1.5中的连接产物也在2 %琼脂糖凝胶上进行电泳，用Bio-Rad ChemiDoc XRS+型凝胶图像分析仪采集图片。
1.7 TOPO TA克隆、测序
使用第二轮PCR产物1 μl，按照Invitrogen公司TOPO TA Cloning Kit for Sequencing说明书操作。将筛选所得阳性转化子送北京六合华大基因科技股份有限公司，在ABI3730 DNA测序仪上采用Sanger测序法测序克隆的DNA片段。
1.8 统计学处理与结果分析
使用Microsoft Office Word 2010的“查找”等相关功能将测序结果的DNA序列与上述第二轮PCR的正、反向引物（即MseI linker nested primer、5'LTR nested primer）的序列进行比对分析，从而得到插入的克隆片段的序列，即宿主-载体连接DNA序列（host-vector DNA junctions/LTR-Chromosomal junctions）。再去除该克隆片段两端的相关载体序列和连接子序列，最后将所得的DNA序列经在线工具GTSG-QuickMap[8]进行其在人类染色体基因组（Homo Sapiens（Ens62, Apr 2011, GRCh37.p3 / HG19））上的定位，从而得到整合位点，同时GTSG-QuickMap会自动统计整合位点在各个染色体/基因组特征（chromosomal/genomic features）内的整合频数与整合频率。进一步比较载体整合位点与GTSG-QuickMap模拟产生的随机整合位点之间的整合频率差异时，采用SPSS 13.0统计软件进行c2检验，认为P < 0.05表示认为存在统计学显著性差异。
2 结果
2.1细胞基因组DNA及LM-PCR相关产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定
琼脂糖凝胶电泳结果显示，基因组DNA已被MseI、PstI切开，条带弥散于约50bp~3000bp之间（泳道2）；Mse I连接子条带清晰，基因组DNA双酶切产物条带弥散（泳道3）；第二轮PCR产物众多，且长短不一，电泳并不呈一条或多条特异性条带，弥散于约100 bp ~ 2000 bp之间。如图1A所示，泳道2所示弥散于约50bp~3000bp之间的条带，表明基因组DNA已被MseI、PstI切开；泳道3下方较明亮的清晰条带为MseI连接子，其余较暗的弥散条带为基因组DNA双酶切产物。如图1B所示，泳道4所示弥散于约100bp~2000bp之间的条带，为第二轮PCR产物，表明产物众多，且长短不一，电泳并不呈一条或多条特异性条带。

A：2 %琼脂糖凝胶电泳图谱；B：1 %琼脂糖凝胶电泳图谱。M：DNA分子量标准DL5000；1：细胞基因组DNA；2：细胞基因组DNA经MseI、PstI双酶切产物；3：双酶切产物与MseI连接子连接产物。4：第二轮PCR产物。
图1细胞基因组DNA及LM-PCR相关产物琼脂糖凝胶电泳图谱
2.2 卡那霉素抗性筛选阳性转化子
将第二轮PCR产物进行TOPO TA 克隆后的反应产物转化入感受态大肠杆菌（TOP10），涂布于6块含50 μg/ml硫酸卡那霉素的LB平板上，37 °C培养过夜，分别长出形态基本一致、大小各异的阳性菌落，见图2。

图2 TOPO TA克隆后反应产物转化感受态大肠杆菌（TOP10）后的阳性菌落
2.3 测序结果在人类染色体基因组上的定位与慢病毒载体整合位点测序、定位与整合频率分析
卡那霉素抗性筛选出的2.3.1测序结果定位共检测了1148个阳性转化子（图2），测序后，，测序结果经GTSG-QuickMap定位于人类染色体基因组上，共得到位于人类染色体基因组上的199个整合位点，再以同时GTSG-QuickMap自动模拟产生1000000个随机整合位点，作为对照，分析整合频率的差异性。结果发现（图3），。
2.3.2整合位点在染色体上的分布如图3所示，只有第4、5、15、16号染色体上的整合频率与随机对照相比，显示出统计学显著性差异（P值分别为0.021， 0.031， 0.024，0.005），且第15、16号染色体上整合频率显著高于对照组（P值分别为0.024，0.005），而第4、5号染色体上整合频率显著低于对照组（P值分别为0.021， 0.031），提示慢病毒载体倾向整合在人永生化角质形成细胞系的第15、16号染色体上，而不偏好整合在第4、5号染色体上。

慢病毒载体整合位点（实验组, n = 199）在不同染色体上的分布以整合位点百分数表示，即整合频率，同时此句去掉并整合到结果中
以模拟的随机整合位点（随机对照组, n = 1000000）作为对照行整合频率分析，并作c2检验。#表示P < 0.01，两者存在统计学显著性差异。
图3 慢病毒载体整合位点的染色体分布图
2.3.34 整合位点整合倾向性分析
对已获得了整合位点信息进行分析发现（表1），整合位点在基因及其转录起始位点的分布如表1所示，慢病毒载体在该细胞基因组中的基因内（包括外显子、内含子）的整合频率与随机对照相比，并无统计学显著性差异，提示其在基因内（包括外显子、内含子）并无整合倾向；而分别在距基因转录起始位点50 kb范围（包括上游及下游，即± 50 kb）、基因转录起始位点上游50 kb范围（即 + 50 kb）、基因转录起始位点上游5 kb至50 kb范围（即+ 5 kb ~ + 50 kb）内的整合频率与随机对照相比，显示出统计学显著性差异（P值均小于0.01），综合提示慢病毒载体倾向整合在人永生化角质形成细胞系基因组中的基因转录起始位点上游5 kb至50 kb范围。
表1 慢病毒载体整合位点在细胞基因及其转录起始位点的分布
整合位点分布情况
随机对照组整合频率（%）(n=1000000)
实验组整合频率
（%）(n=199)
P值
在基因内
在内含子内
在外显子内
44.61(446080)
42.12(421233)
2.48(24847)
47.24(94)
45.23(90)
2.01 (4)
0.456
0.375
0.840
在距基因转录起始位点+5kb内
6.18 (61849)
8.04 (16)
0.277
在距基因转录起始位点-5kb内
4.24 (42405)
5.53(11)
0.368
在距基因转录起始位点±5kb内
10.43(104254)
13.57(27)
0.147
在距基因转录起始位点+50kb内
25.22(252156)
36.18 (72)
0.000**
在距基因转录起始位点-50kb内
44.61(446080)
47.24(94)
0.456
在距基因转录起始位点±50kb内
69.82(698236)
83.42 (166)
0.000**
在距基因转录起始位点+5kb~+50kb内

19.03 (190307)

28.14 (56)

0.001**
在距基因转录起始位点-5kb~-50kb内

40.37(403675)

41.71(83)

0.700
+ 表示整合位点位于基因转录起始位点上游；- 表示整合位点位于基因转录起始位点下游。
** 与模拟的随机整合位点（n = 1000000）比较，作c2检验时P < 0.01，两者存在统计学显著
性差异。

3 讨论
慢病毒载体不仅能感染分裂细胞，同时也能感染非分裂细胞，目前在基因修饰与治疗领域的应用日益增多。然而，外源基因的整合具有明显的位置效应。病毒载体介导的基因转移转导的可能风险之一是其未知的整合倾向可能干扰靶细胞内源基因表达与功能，诱发克隆优势或肿瘤生成，这些潜在的副作用已经引起人们的极大关注[1, 9]。慢病毒载体整合倾向的详细分析对于评估其插入诱变的风险显得非常重要。去掉，或整合于此段末句
先前的既往研究发现[2-4, 7, 10]，逆转录病毒及其载体倾向整合于宿主基因组中的一些染色体/基因组特征区域，例如HIV-1及其载体主要倾向整合于某些细胞基因组中的活跃转录单位（active transcription unit）内 文献
；鼠白血病病毒（MLV）载体主要倾向整合于与宿主基因启动子相关的基因转录起始位点附近区域 文献
。因此，本文就是围绕整合位点分布与染色体、基因、基因转录起始位点这三大染色体/基因组特征之间的关系，来初步阐明慢病毒载体在人角质形成细胞基因组中的整合倾向性至关重要。
逆转录病毒或其载体进入靶细胞后，RNA基因组首先反转录成双链cDNA，再与病毒编码的整合酶（IN，integrase）及来自于靶细胞和病毒自身的一些蛋白共同构成前整合复合体（PIC，preintegration complex），最后整合到染色体上，那么首先由此可见，染色体是否易于接近可能对整合有重要影响[11]。我们获得了经测序的慢病毒介导的人角质形成细胞基因组整合位点序列信息,结果本研究显示，慢病毒载体倾向整合在人永生化角质形成细胞系的第15、16号染色体上，而不偏好整合在第4、5号染色体上，这与之前的研究结果并不完全一致，故不能用慢病毒载体倾向整合于富含基因的染色体上的观点来解释[12]没有很好体现出如何不一致
，我们推测逆转录病毒及其载体（包括慢病毒及其载体）整合可能与该细胞系染色体核型异常[5, 13] 以及染色体不稳定等特性有关，有关逆转录病毒及其载体（包括慢病毒及其载体）整合与靶细胞染色体核型、稳定性之间的关系有待进一步研究。
基因控制着生物体的遗传性状，突变可能引起功能的丧失或获得。在基因转移中，如果载体原病毒恰好整合在靶细胞基因内或其周围区域，尤其是癌基因或者是控制着细胞生长、发育、凋亡等功能基因内或其附近，可能会改变细胞行为或产生细胞恶性转化。以前人们认为逆转录病毒及其载体整合是随机的，无一定的规律性。但是现在的研究已经发现这并不是随机的，其整合位点在某些特定区域显示出一定的分布倾向，并且不同的逆转录病毒及其载体的整合倾向各异[2, 3]。一些研究报道表明，整合倾向不仅与病毒的种类有关，同时与靶细胞组织类型也有关系[4]。先前的大部分细胞内研究提示慢病毒载体倾向整合于转录活跃的基因内，且主要是内含子内[4, 10]。另外，Beard BC等[14]研究发现慢病毒载体在犬CD34+细胞内距基因转录起始位点10 kb和50 kb范围内并无整合倾向。本研究的实验结果与之完全不同，慢病毒载体在人永生化角质形成细胞系的基因（包括外显子、内含子）内并无明显整合倾向，而偏好整合在基因转录起始位点上游5 kb至50 kb范围内。这可能与表皮细胞内存在独特的参与靶向整合的细胞内辅助因子有关，需要进一步研究。现在已知道50 kb是一个非常保守的距离，原病毒只要整合在此范围内的基因附近，其携带的启动子或增强子等元件会反式激活该基因[15]，即使慢病毒载体也不能除外。最近，Sadelain M等[16]又提出了靶细胞基因组中“安全港”（genomic safe harbour，GSH）的概念，即靶细胞染色体上的一个位点处，原病毒在此整合后既能确保转基因稳定可靠的表达，同时又不严重影响内源基因结构或表达。其中一条标准是：该位点离任一基因5’端的距离大于50 kb。只要整合在基因内，当然不属于“安全港”。因此，虽然本研究中的慢病毒载体在人永生化角质形成细胞系的基因内无明显整合倾向，但是其偏好整合在基因转录起始位点上游5 kb至50 kb范围内而且在94个基因内发生整合现象，显然是不安全的，不排除激活或干扰附近基因的可能。不通顺
整合位点附近的基因的表达及功能是否会发生变化需要进一步研究。
此外，本研究中所使用的连接介导PCR（LM-PCR）是常用的染色体步移技术之一[17]，该方法首先是选择合适的限制性内切酶消化基因组DNA，再在酶切后的基因组DNA片段上连接成双链、单链或者部分双链的接头，用序列特异引物和接头引物引发PCR扩增，得到与已知序列相邻的未知序列，从而应用于外源DNA插入位点的鉴定。本研究选择了退火的双链接头，而且接头上有氨基、磷酸基修饰，来抑制接头引物的单引物扩增，设计了两对巢式PCR特异性引物，提高了PCR产物的特异性，故确保了扩增目的DNA的高效性和特异性。与之相比，先前应用的反向PCR（Inverse PCR）环化反应难以控制、扩增效率低，Alu-PCR、TAIL-PCR（Thermal Asymmetric Interlaced PCR）等特异引物PCR无法有效控制由随机引物引发的非特异产物的产生。另外，Wu X等[7]研究发现连接介导PCR（LM-PCR）中不同限制性内切酶的引入并不会导致整合位点倾向研究结果出现偏差。由此可见，连接介导PCR（LM-PCR）是鉴定病毒载体整合位点的一种理想而可靠的方法。作为讨论第二段，续整合位点趋向性分析重要性之后，分析本文应用方法的可行性。同时做简要修改，如为建立外源基因的整合位点趋向性分析的一系列技术体系，我们应用……。

综上所述，慢病毒载体在人角质形成细胞基因组内呈现出一种新的整合模式，即倾向整合于基因转录起始位点附近区域，而并不偏好整合在基因内。这一整合模式与前述的HIV-1及其载体的整合模式并不相同，而与鼠白血病病毒（MLV）载体的整合模式有相似之处，但也并不完全相同。本研究丰富了慢病毒载体在表皮细胞基因组内整合位点分布规律的认识，为评价和改良安全有效的低遗传毒性的慢病毒载体提供了重要实验依据，为寻找表皮细胞基因组内的“安全港”奠定了实验基础。
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