黄条%28鱼师%29%28Seriola aureovittata%29生长对工厂化养殖密度的微生态适应特性.pdf

第 54 卷 第 4 期 海 洋 与 湖 沼 Vol.54,No.4 2 0 2 3 年7 月 OCEANOLOGIA ET LIMNOLOGIA SINICA Jul.,2023 *国家重点研发计划项目,2022YFD2401102 号;青岛海洋科技中心山东省专项经费,2022QNLM30001-1 号;中国水产科学研究院基本科研业务费,2020TD47 号;农业农村部财政专项-海洋渔业生物资源收集与保藏项目;财政部和农业农村部:国家现代农业产业技术体系,CARS-47 号。周鹤庭,E-mail: 通信作者:徐永江,研究员,E-mail: 收稿日期:2022-12-31,收修改稿日期:2023-03-24 黄条(Seriola aureovittata)生长对工厂化养殖 密度的微生态适应特性*周鹤庭1,2 徐永江1 姜 燕1 崔爱君1 王 滨1 柳学周1(1.中国水产科学研究院黄海水产研究所 深蓝渔业工程联合实验室 山东青岛 266071;2.上海海洋大学 水产科学国家级实验教学示范中心 上海 201306)摘要 研究低(5 kg/m3)、中(10 kg/m3)、高(15 kg/m3)三个养殖密度对工厂化养殖黄条生长的影响,从消化道菌群角度分析了养殖黄条的生长的密度适应性。利用 Illumina MiSeq 平台对不同养殖密度条件下黄条的消化道(胃、肠道、幽门盲囊)菌群进行 16S rRNA 高通量测序,并进行了菌群的多样性、结构特征和菌群基因功能预测的分析。结果显示,相较于中、低密度组,高养殖密度显著(P0.05)抑制了黄条的终末体质量、特定生长率并显著上调了血清应激相关激素水平。消化道微生物群落在属水平上,乳杆菌属(Lactobacillus)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、Faecalibaculum、Ruminococcaceae_UCG 等在中、高密度组中丰度降低,克雷伯氏菌属(Klebsiella)等在中、高密度组中丰度增加,均与低密度组差异显著(P0.05)。KEGG 通路分析发现,各养殖密度组的菌群基因主要集中在代谢、环境信息过程、遗传信息过程三个一级功能通路。该实验设置的中、高密度组相对低密度组,消化道菌群的组成和结构上呈现有益菌(乳酸杆菌属等)显著性减少和条件致病菌(克雷伯氏菌属)显著性增加(P0.05)的趋势。在菌群功能方面,与低密度组相比,中、高密度组消化道特别是在代谢、遗传及环境信息过程的二级功能通路上注释的 tags 数目相对低密度组显著增加(P6 mg/L。实验期间投喂冰鲜玉筋鱼,投喂量为鱼体重的 3%5%,均饱食投喂。每天投喂后 1 h清理养殖水槽,保持底部清洁。1.2 实验样品采集与处理 实验结束后,实验鱼经MS-222 麻醉(80 mg/L)后,测量体重、体长,用一次性注射器于尾部静脉取血,血液样本在室温下静止 10 min后离心(4 C,4 000 r/min,10 min),取血清保存在液氮中,用于皮质醇和葡萄糖等指标分析。消化道菌群样本采集时,先采用 75%酒精棉擦拭体表,随后解剖并快速取胃、幽门盲囊、肠道三个组织,排出组织内残余内容物,采用预冷的生理盐水冲洗后分装保存于液氮中。工厂化养殖车间内每个实验组取样三尾鱼的消化道各个组织部位作为平行样品,故样品命名情况如下:C2AS为低密度(A)组胃部(Stomach),C2BP为中密度(B)组幽门盲囊(Pyloric caecum),C2CG为高密度(C)组肠道(Intestinal),依次类推命名样品。1.3 生长与血清指标计算 生长参数的计算按照下述公式进行:增重率(Weight gain ratio,WGR,%)=(WtW0)/W0100,(1)特定生长率(Specific growth ratio,SGR,%/d)=(lnWtlnW0)/t100,(2)肥满度(Condition factor,CF,g/cm3)=Wt/L3,(3)上述式中,W0、Wt分别为试验初始和结束平均鱼体质量(湿重,g);t为试验天数(d);L为体长(cm)。血清指标包括:皮质醇、葡萄糖。上述指标均采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒,严格按照其操作说明完成测定。1.4 微生物总 DNA 提取与高通量测序 将黄条消化道样品用DNA抽提试剂盒(DNeasy PowerSoil Kit)提取基因组DNA,之后利用Nano Drop 2000 和琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度,质量合格后将其分离。以基因组DNA为模板,使用带barcode的特异引物Tks Gflex DNA Polymerase(TaKaRa)进行PCR以确保扩增效率,引物使用 343F(5-TACGGR AGGCAGCAG-3)和 798R(5-AGGGTATCTAATCC T-3)扩增区域为 16S V3-V4 区。PCR产物经电泳检测和磁珠纯化后进行二轮PCR并重复上述检测与纯化步骤。最后根据PCR产物浓度进行稀释后等量混样,随后通过Illumina MiSeq PE300 平台进行高通量测序,具体步骤参考该文章(Zhou et al,2023)。1.5 数据处理与统计分析 高通量测序得到的原始图像数据文件经碱基识别分析转化为FASTQ格式的原始测序序列,经过一系列剪切、去杂、拼接、质控和去除嵌合体后得到有4 期 周鹤庭等:鰤黄条(Seriola aureovittata)生长对工厂化养殖密度的微生态适应特性 1229 效序列。根据序列的相似性,将序列归为多个可分类操作单元(OTU),序列相似度97%被归为一个OTU单元。使用QIIME软件包选取每个OTU中丰度最大的序列作为该OTU的代表序列(tags),并将所有代表序列与Silva(version123)数据库进行比对注释,物种比对注释使用RDP classifier软件,保留置信区间大于0.7 的注释结果。采用tax4fun(0.3.1)对微生物群基因参与的KEGG通路进行比对分析。数据处理使用Excel2016,并用SPSS 26.0 软件进行统计分析。数值均采用“平均值标准差”(Means S.D.)表示。分析过程中利用单因素方差分析(One-way ANOVA)方法对不同密度组间的生长指标、血液指标、微生物多样性指标、属水平上优势菌群以及参与KEGG二级通路的tags数目等结果进行统计分析,利用Duncans检验对三个不同密度组黄条样品的差异性进行LSD多重比较,显著差异水平为P0.05。2 结果 2.1 不同密度下黄条的生长与生理指标差异 在工厂化不同养殖密度下,经过 60 d养殖后,低密度组实验鱼终末体质量显著高于高密度组(P0.05),增重率和特定生长率显著高于中、高密度组(P0.05),另外,低密度组实验鱼血清中皮质醇、葡萄糖水平显著高于中、高密度组(P0.05)(图 1、表 1)。2.2 不同养殖密度黄条消化道菌群多样性 共采集到 27 个黄条消化道样品,经测序和生物信息学处理,共得到 1 707 224 条有效数据序列。图 2 显示:在胃中,高密度组OTU数量最多,低密度组同中、高密度组共有的OTU数目分别为 2 018(25.40%)、2 124(25.34%)个;在幽门盲囊中,低、高密度OTU数目相等,低密度组同中、高密度组共有的OTU数目分别为 2 129(25.44%)、2 185(25.79%)个;在肠道中,低密度组OTU数目最多,低密度组同中、高密度组共有的OTU数目分别为 2 163(25.53%)、2 210(25.63%)个。综上发现,不同养殖密度下实验鱼各组织之间共有OTU数目均在 25%26%之间,无明显差异。测序结果显示获得的黄条消化道菌群多样性指数覆盖度均达到 0.98 以上,表明数据测定结果可靠(表 2)。在胃组织中,低密度和高密度组的Chao1 指数显著高于中密度组(P0.05),低密度组的Shannon指数和Simpson指数显著高于中、高密度组(P0.05)。在幽门盲囊组织中,chao1 指数在低密度组中显著高于中密度组(P0.05),低密度组的Shannon指数和Simpson指数显著高于中、高密度组(P0.05),Shannon指数显示低密度组显著高于中、高 图 1 不同密度下黄条的养殖生长指数 Fig.1 Growth index of S.aureovittata in different stocking densities 注:不同上标小写字母表示同一指标不同密度组之间的差异显著性(P0.05);下同 表 1 黄条不同密度养殖下的血液皮质醇和葡萄糖水平 Tab.1 Blood cortisol and glucose levels in S.aureovittata in different stocking densities 血液指标 低密度组 中密度组 高密度组 皮质醇(ng/mL)29.960.31c 34.040.15b 39.590.23a 葡萄糖(mol/L)10.780.24c 13.720.40b 16.030.18a 注:不同小写字母上标表示不同密度组间的显著性差异(P0.05)1230 海 洋 与 湖 沼 54卷 图 2 胃部、幽门盲囊、肠道微生物 OTU 的 Venn 图 Fig.2 Venn diagrams of the OTU of microflora in stomach,pyloric caecum and intestine 注:从左至右依次为胃部、幽门盲囊、肠道;A、B、C 分别代表低、中、高密度组;下同 表 2 消化道样品微生物多样性指数 Tab.2 Diversity index of microorganism in digestive tract samples 样品 序列 分类单元 Chao1 指数 Shannon 指数 Simpson 指数 覆盖度/%C2AS 63 0481 373 1 935103 3 307.47170.41b 7.740.60b 0.970.02b 98.730.10 C2BS 64 8732 563 1 974237 2 889.8290.45a 6.220.11a 0.880.00a 99.010.03 C2CS 63 6352 214 2 170162 3 339.61160.13b 6.490.22a 0.890.01a 98.820.04 C2AP 64 0492 874 2 15693 3 612.54206.83b 8.340.09b 0.980.00b 98.570.07 C2BP 62 1022 871 2 02858 2 982.5818.17a 6.231.13a 0.870.06a 98.920.07 C2CP 63 1772 317 2 129386 3 356.80449.56ab 6.200.15a 0.870.01a 98.770.17 C2AG 62 5273 243 2 203182 3 616.3491.69 8.440.39b 0.980.00b 98.640.07 C2BG 62 6213 915 2 026160 3 051.86194.12 6.270.82a 0.920.09a 98.930.06 C2CG 63 0431 250 2 097226 3 356.85457.50 6.800.87a 0.910.05ab 98.780.23 注:不同上标小写字母表示不同密度组实验鱼同一组织部位之间的差异显著性(P0.05)密度组(P0.05),低密度组的Simpson指数最大,且显著高于中密度组(P1%的属有 11 个(图 4)。属水平上,优势菌属(丰度大于 2%)均出现了显著性差异变化。在胃组织中,乳杆菌属(Lactobacillus)、鞘 4 期 周鹤庭等:鰤黄条(Seriola aureovittata)生长对工厂化养殖密度的微生态适应特性 1231 图 3 基于门水平的黄条消化道菌群结构 Fig.3 Structure of bacteria in digestive tract of S.aureovittata at phylum level 氨 醇 单 胞 菌 属(Sphingomonas)、双 歧 杆 菌 属(Bifidobacterium)、Faecalibaculum和Ruminococcaceae_ UCG的丰度在低密度组中显著高于中、高密度组(P0.05),克雷伯氏菌属(Klebsiella)丰度在低密度组显著低于中、高密度组(P0.05)。此外,幽门盲囊和肠道中的优势菌属变化趋势同胃一致。低密度组的胃组织拟杆菌属(Bacteroides)丰度显著高于中密度组(P0.05),但中密度组,幽门盲囊优势菌属的丰度值高于肠道,趋势与高密度组相反(图 5)。图 4 基于属水平不同密度养殖的黄条消化道优势菌群结构 Fig.4 Structure of dominant bacteria in digestive tract of S.aureovittata at genus level 图 5 基于属水平不同密度养殖的黄条消化道优势菌群差异 Fig.5 Difference of dominant bacteria in digestive tract of S.aureovittata at genus level 注:L、M、H 分别表示低、中、高密度组,*表示该菌属的低密度组和中、高密度组间具有差异显著性(P0.05)1232 海 洋 与 湖 沼 54卷 2.5 基于 KEGG 通路分析黄条消化道微生物菌群功能 通过KEGG分析,在一级通路水平,各密度组消化道中的菌群功能主要集中在代谢(Metabolism)、环境信息过程(Environmental Information Processing)、遗传信息过程(Genetic Information Processing)等三个方面,低密度组中消化道菌群参与功能通路的基因数目远低于中、高密度组,同时中、高密度组在代谢、环境信息过程和遗传信息过程三个通路中注释的tags数目远大于低密度组(图 6)。二级通路中,碳水化合物代谢、氨基酸代谢、能量代谢、辅助因子、维生素的代谢、核苷酸代谢、脂质代谢、膜运输、信号传导、翻译、转录和折叠、分类和降解等通路均出现低密度组显著低于中、高密度组(P0.05)(图 7)。3 讨论 3.1 不同养殖密度下黄条的生长差异 养殖生产过程中,鱼类生长会受到各种环境因子的影响,密度就是其中一个关键因素。有研究表明,大口黑鲈(Micropterus salmoides)(倪金金,2020)的终末体质量随养殖密度升高显著下降,与文章结果一致。中华鲟(Acipenser sinensis)(Long et al,2019)的研究也表明高养殖密度对鱼类的生长性能存在不利的影响。在黄条的终末体质量等生长指标和血清激素指标的差异性变化表明中、高密度养殖组相对低密度养殖组来说,对生长代谢和生理都表现出一定的胁迫抑制作用。图 6 黄条消化道菌群 KEGG 一级通路功能注释 Fig.6 Functional notes of KEGG 1 level pathway of digestive tract bacteria of S.aureovittata 4 期 周鹤庭等:鰤黄条(Seriola aureovittata)生长对工厂化养殖密度的微生态适应特性 1233 图 7 KEGG 通路功能注释(二级)Fig.7 Functional notes of KEGG pathway(Level II)注:*表示该功能通路中,低密度组和中、高密度组间具有差异显著性(P0.05)3.2 不同养殖密度下黄条消化道菌群多样性变化 消化道微生物的多样性被认为是代表宿主机体健康和代谢能力的指标(Jena et al,2018),当多样性下降时,或可表明消化道微生物群落趋于不稳定,微生态功能受影响,容易导致生物患病(金若晨等,2020)。杜 世 聪 等(2019)研 究 认 为 表 示 多 样 性 的Shannon指数下降可以作为凡纳滨对虾(Litopenaeus Vannamei)出现健康分化的标志。微生物菌群多样性的变化会受生存环境和不同消化道区段的影响(Ni et al,2014)。姜 燕 等(2020)在 工 厂 化 养 殖 大 黄 鱼(Larimichthys crocea)的研究中,发现菌群多样性随消化道延伸出现下降趋势。随着消化道延伸,高密度组胃部、幽门盲囊、肠道中的OTU数量呈逐渐减少趋势,低密度组中呈增加趋势;Shannon指数和Simpson指数也在不同密度组间呈现显著性差异,中、高密度组显著低于低密度组。这些都进一步说明中、高密度组的黄条机体消化道微生态环境受到一定程度的胁迫,菌群多样性降低,趋于不稳定状态,对病菌等侵害抵抗力下降,更容易遭受细菌等外源不利因素的侵袭而发生病害。3.3 不同养殖密度下黄条消化道菌群结构特性 有学者提出肠道微生物核心菌群的概念,即环境改变会导致菌群结构改变,但对核心菌群的组成影响不大,菌群区系的相对稳定性成熟,不容易受外界环境影响(涂宗财等,2017;丁红秀等,2021)。结果显示同一密度组的不同组织间OUT及多样性无显著差异,且微生物群落组成相似。工厂化养殖黄条的消化道菌群门水平上的优势群类主要为变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、放线菌门,与先前报道鱼类肠道常见的优势微生物的结果(Kostic et al,2013;Li et al,2013)相似。有研究称,体内菌群中变形菌门的持续增加会打破菌群环境稳态,导致宿主出现体内营养代谢紊乱、免疫功能失调等情况(Carvalho et al,2012),并指出生物体内变形菌门的增加可作为判断有潜在疾病的诊断标志(Shin et al,2015)。姜燕等(2021)关于患病和健康大黄鱼的研究中,认为患病鱼消化道内的变形菌门丰度显著高于健康鱼,拟杆菌门和厚壁菌门显著低于健康鱼。变形菌门在中、高密度中相对低密度养殖环境大幅增加,这一定程度上可能预示着消化道内菌群出现紊乱。拟杆菌门主要与DNA、蛋白质、降解多糖等碳水化合物和脂类的吸收转化有较大关联(朱亦晨等,2020)。拟杆菌门在中、高养殖密度组中相对低密度组大幅减少。厚壁菌门中的部分细菌在多糖发酵和纤维降解中有重要的作用,一定程度上可增强机体免疫力(姬玉娇等,2016),中、高密度组厚壁菌门菌群丰度的降低也反映出机体免疫力的下降。结合结果中门水平菌群结构变化,中、高密度养殖组相对低密度组条件致病菌门的菌群丰度的升高,与养殖鱼生长受到抑制(特定生长率、肥满度等降低)、生理胁迫(皮质醇激素、葡萄糖水平升高)的变化一致,其可能的机制是这些条件致病菌的增加影响了鱼体的营养吸收和生理代谢,并在血清皮质醇激素、葡萄糖代谢等免疫相关指标上体现出来。在属水平的菌群结构上,厚壁菌门的乳杆菌属丰度占比最大,且能定殖在宿主的肠道内,与病原菌竞争肠道上皮的附着点,一方面可以维持微生态环1234 海 洋 与 湖 沼 54卷 境稳定、增强消化道黏膜免疫调节;另一方面可以有效减少宿主感染致病菌。重组植物乳杆菌(L.plantarum)(Soltani et al,2019)、鼠李糖乳杆菌JCM1136(L.rhamnosus JCM1136)(Xia et al,2018)可以显著提高虹鳟(Oncorhynchus mykiss)血清中的IgM,促使免疫基因表达上调,提升宿主免疫力。在养殖生产中,乳杆菌常被用作益生菌添加在水产养殖的饲料中,可以帮助饲料消化、促进生长,如利用添加乳杆菌的饲料投喂大菱鲆(Scophthalmus maximus)后存活率和生长率得到提升(苏晨阳,2015)。有研究表明,乳杆菌和双歧杆菌会影响宿主糖代谢,促进机体生长(Yan et al,2016;Asgharian et al,2020),拟杆菌属在消化道内有分解蛋白质、复杂多糖并促进脂质代谢的作用(Singh et al,2015)。在动物生长过程中需要大量的细胞增殖,需要大量的磷脂和能量来维持细胞快速的增大和分化,而脂代谢产物可以为细胞提供磷脂等脂质,糖代谢则为细胞提供了碳骨架与能量(徐振海,1990;Varki,2017)。乳杆菌、拟杆菌、双歧杆菌、Faecalibaculum等可以产生短链脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFA),SCFA 能够调节机体脂肪、骨骼肌及肝脏等器官的能量代谢,诱导产生胰岛素样生长因子 1(insulin-like growth factor-1,IGF-1),影响动物生长及体重(Holzer et al,2001;Canfora et al,2015;Yan et al,2016;程冉冉,2020;Zagato et al,2020;袁志发等,2021)。结果显示,低密度组黄条消化道各组织中乳杆菌属、双歧杆菌属、Faecalibaculum等的丰度值均显著高于中、高密度,但是中密度组中幽门盲囊内丰度值高于肠道,在高密度组中,肠道内丰度值高于幽门盲囊,这可能是由于肠道微生物的多样性更丰富,中密度的胁迫下仍能一定程度保持菌群相对平衡,但在更高密度的胁迫下产生紊乱。以上讨论的乳杆菌属、双歧杆菌属等菌属在不同密度组间的适应性变化与低密度组养殖鱼肥满度、增重率、生长速率高等密切相关,说明这部分菌属在维持鱼体内消化道微生态稳定,增强黏膜免疫,制约条件致病菌的增殖,促进低密度下养殖鱼脂质和糖类的代谢等方面具有一定的开发应用潜力(苏晨阳,2015;姬玉娇等,2016;Wang et al,2018;姜燕等,2021)。前期研究结果提示我们,养殖过程中或可通过在黄条饵料中适当增加乳杆菌等益生菌,提升养殖鱼的生长效率和抗病力等。另外,本团队已有研究表明,低密度组养殖的黄条血清中IGF-1 和生长激素显著高于中、高密度组(姜燕等,2022),结合本研究中低密度组养殖鱼消化道优势菌属丰度显著高于中、高密度组,推测消化道优势菌属可能与血清IGF-1表达存在协同调控关系,从而促进养殖鱼表现出更佳的生长性能,具体的调控作用及可能机制有待于深入研究。克雷伯氏菌属和Anaeroplasma同属变形菌门,这两种菌属在中、高密度组中的增加是引起变形菌门丰度值变化的原因。克雷伯氏菌属是常见的条件致病菌属,当宿主机体健康状态下降、有益菌丰度降低时,平衡状态被打破,即可导致宿主发病。克雷伯氏菌属下有肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、产酸克雷伯菌(K.oxytoca)等众多细菌,但肺炎克雷伯菌在水生 动 物 中 多 次 被 发 现 并 报 道,在 发 病 的 鲤 鱼(Cyprinus carpio)(卢玉婷等,2014)、出现烂鳃的白鲢(Silver carp)(唐毅等,2007)、暴发出血病的团头鲂(Megalobrama amhlycephala)(滕涛等,2016)中均分离或鉴定出该菌。本次研究中高密度组养殖鱼消化道中的克雷伯氏菌属上升,虽然未出现病理表现,但与生长指标和血清皮质醇等生理指标方面的表现相一致,存在暴发疾病的潜在风险。3.4 不同养殖密度下黄条消化道菌群功能注释分析 通过KEGG通路分析来看,消化道菌群主要功能注释集中在代谢、遗传信息处理和环境信息处理这三方面。在KEGG二级通路中,低密度组实验鱼消化道菌群对应的功能基因数目显著低于中、高密度组,且中、高密度组之间无显著性差异,表明当中、高养殖密度对生长造成生理胁迫时,养殖鱼本身可能通过消化道菌群结构和丰度的调整来调动更多的代谢途径参与到胁迫应答的过程中,从而对机体的生长进行代谢补偿以尽量维持机体消化道微生态稳定。二级代谢通路下,碳水化合物代谢、氨基酸代谢、能量代谢、辅助因子和维生素代谢、核苷酸代谢、聚糖生物和代谢等通路富集均出现在中、高密度组中显著高于低密度组的情况,这可能是中、高密度条件下黄条消化道菌群积极参与了由于密度胁迫引发的生长代谢补偿调控过程,爔与曾晨等(2020)的研究结果一致。中、高密度组在翻译,转录,折叠、分类和降解这三个通路中,参与的基因数目显著高于低密度组,这可能由于中、高养殖密度造成的胁迫导致鱼体应激反应出现了DNA损伤(冉茂良等,2013),而密度胁迫下的黄条消化道菌群积极参与了遗传信息加工处理,其对遗传物质具体的调控机制有待于今后深入研究。4 期 周鹤庭等:鰤黄条(Seriola aureovittata)生长对工厂化养殖密度的微生态适应特性 1235 4 结论 黄条在低(5 kg/m3)、中(10 kg/m3)、高(15 kg/m3)三个工厂化养殖密度条件下,生理指标和消化道微生物群表现出显著性差异,表明养殖密度对黄条的生理造成胁迫从而影响了生长代谢水平。5 kg/m3的密度条件中,消化道中微生物的 Alpha 多样性以及乳杆菌属等有益菌的丰度显著较高,皮质醇和葡萄糖显著较低,同时增重率和特定生长率显著高于其他密度,说明该密度组黄条的生长性能和生理状态优于其他密度组。该研究为养殖黄条的适宜密度和工厂化健康养殖技术提供理论支撑。参 考 文 献 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