双峰驼TLR3蛋白的表达与抗体制备及在肾脏的分布_张睿.pdf

动物医学进展，（）：双峰驼 蛋白的表达与抗体制备及在肾脏的分布收稿日期：基金项目：国家自然科学基金项目（，）作者简介：张睿（），女，甘肃环县人，硕士研究生，主要从事兽医病理学与动物黏膜免疫学研究。通讯作者张睿，李沛轩，刘转霞，刘静宇，房映栋，刘柯江，张旺东，王雯慧（甘肃农业大学动物医学院，甘肃兰州 ）摘要：为制备双峰驼 样受体（）的抗体，分析其在肾脏中的表达特征。用生物信息学分析及原核表达方式，分析、表达和纯化了双峰驼 重组蛋白，并制备多克隆抗体，用间接酶联免疫吸附试验和免疫印迹法测定抗体效价及其特异性，利用制备的多克隆抗体采用免疫组织化学染色观察 在双峰驼肾脏组织中的表达。结果显示，得到的目的蛋白大小与预测结果相符，为 ，最佳诱导浓度为 ，最佳诱导时间为，重组蛋白主要以包涵体形式表达，抗体效价达 ；免疫印迹结果显示，原核表达的 蛋白和双峰驼肾脏组织中表达的 蛋白均能被该抗体特异性识别，在双峰驼肾小管上皮细胞和肾小球系膜细胞均有表达。研究结果为进一步探究双峰驼 在肾脏中发挥作用的机制积累了资料。关键词：双峰驼；样受体；原核表达；抗体制备；肾脏中图分类号：；文献标识码：文章编号：（）年 样蛋白在果蝇中被首次发现，该蛋白除与果蝇胚胎发育有关外，也能识别入侵的微生物，并发现其与天然免疫间存在着某些联系。随后在哺乳动物中发现该蛋白的同源体，即 样受体（，）。现在已知，是型跨膜蛋白，在非特异性免疫中发挥核心作用，在特异性免疫中有重要作用，年人类 家族的发现可谓是免疫学领域的重大突破。迄今为止，家族个亚家族中已发现的成员至少有 个。根据 在细胞的定位被分为两类：一类包括 、，在细胞膜表面表达，可识别 细 菌、病 毒 等 表 面 结 构 成 分；另 一 类 包 括 、，在细胞内表达，主要识别来自细菌和病毒的核酸。作为一种重要的模式识别受体，在天然免疫中发挥重要作用。现已证实，在心、肝、脾、肺和肾等器官广泛表达。不同物种的 在结构上基本相似但略有差异，如人的 由 个氨基酸构成，而小鼠 由 个氨基酸构成；此外，同其他 相比，没有保守脯氨酸残基，而含有个重要的酪氨酸残基，它的基因由个外显子组成，结构蛋白由外显子、编码，而其他 仅由个外显子所编码。研究表明，具有多重生物学功能，其与 、相似，均 以 核 酸 为 配 体，可 识 别 双 链 （），在宿主抗病毒反应中起到关键作用；同时，也能启动抗炎信号通路，参与炎症的调控。另外，还与一些肿瘤性疾病的发生有关。双峰驼是我国西北特色畜种，在发展民族文化、体育竞技和特色旅游等方面发展潜力巨大，本团队一直以双峰驼黏膜免疫相关研究为主。有研究显示，与多种肾病的发生与发展密切相关，但目前关于 与双峰驼肾病关系的研究很少。本研究选用双峰驼肾脏作为 的定位器官，利用生物 信 息 学 软 件 和 原 核 表 达 系 统，对 双 峰 驼 的基因特性进行分析，表达重组蛋白，并制备兔抗双峰驼 抗体，通过免疫组织化学法观察 在双峰驼肾脏组织的表达，为进一步深入研究 在双峰驼尿生殖道黏膜免疫中的抗炎症、抗病毒及参与炎症调控的调节机理奠定基础。材料与方法材料主要试剂蛋白 ，生物科技有限公司产品；标记的山羊抗兔 ，生物医药有限公司产品；标签蛋白纯化试剂盒，上海尚宝生物科技有限公司产品；免疫组化DOI:10.16437/ki.1007-5038.2023.06.014试剂盒，生物工程有限公司产品。主要仪器切片机，德国 公司产品；正置显微镜带成像系统，日本 公司产品。实验动物日本大耳兔，雌性，体重约，购自兰州兽医研究所实验动物中心。方法 重组质粒的构建参照 中双峰驼 基因序 列（），选取编 码区，用 进行蛋白亲水性和抗原表位分析，用 和 进行跨膜区和信号肽分析后，截除跨膜区和信号肽，截取膜外区抗原指数较高的一段序列（区段：，预测分子质量 ），在碱基序列两端分别添加起始密码子 和终止密码子，接着，用 进行酶切位点预测，在该序列的上、下游分别添加酶切位点 和 ；经碱基优化后送金唯智生物科技有限公司合成，将测序合适的基因序列连接到 载体上，最终将获得的重组质粒 进行双酶切验证，将酶切验证后的 重组质粒冻干粉用 水稀释后转化进 （）感受态细胞，提取质粒送测，将测 序 正 确 的 阳 性 重 组 质 粒 命 名 为 。重组 的诱导表达及表达形式鉴定将 重组质粒转化至感受态细胞 （）中，重 组 菌 命 名 为 （），挑取单个菌落接种（）中过夜培养，取 过夜培养菌液加入到 （）中 培养至 值达到时，在无菌条件下取出制样作为诱导前对照，剩余部分加入 的 诱导后收集菌体，检测。为了确定目的蛋白的表达形式，溶菌酶破碎菌体并离心，分别取上清和沉淀制样，进行 检测。重组蛋白表达条件优化对 重组蛋白的表达条件进行优化。浓度设置 、，诱导时间设置、，然后进行 检测。重组 蛋白的纯化在最佳表达条件下，诱导表达 重组蛋白，溶菌酶破碎菌体，依据标签蛋白纯化试剂盒的说明对蛋白进行纯化，检测，紫外分光光度仪测定蛋白含量。动物免疫及多克隆抗体制备日本大耳兔适应性饲喂周后，将纯化蛋白和弗氏完全佐剂等比例混合乳化，腘淋巴结和背部皮下分点注射免疫接种家兔，蛋白剂量为 只，周后将弗氏不完全佐剂和纯化蛋白等比例混合并乳化，以 只的剂量免疫。每隔周免疫接种次，次免疫后，心脏采血，分离血清保存备用。抗体效价检测以纯化后的蛋白为抗原，过夜包被酶标板（孔），洗涤，脱脂奶粉封 闭 后 再 次 洗 涤，加 入 梯 度 稀 释 的 兔 血 清，孵育，洗涤后加 标记的山羊抗兔 二抗（稀释），孵育，洗涤后加 显色液，暗室显色 后加入 的（孔）停止反应，用酶标仪测 值。重组蛋白的 鉴定将纯化的 重组蛋白制样，经常规电泳后，湿转转印至 膜，用含 脱脂奶粉的 封闭，洗膜，加兔血清一抗（稀释）孵育过夜；经 洗膜次，加 标记的山羊抗兔 二抗（稀释）孵育后，用 洗膜次，最后用 发光液显色。免疫组织化学法检测 在双峰驼肾脏组织中的表达将本实验室制好的双峰驼肾组织石蜡切片按照免疫组化试剂盒中的操作步骤进行染色，一抗为免疫兔血清（稀释），二抗为山羊抗兔 （稀释），拍照观察。结果 重组质粒的构建预测分析双峰驼 蛋白亲水性（图）和抗原表位（图）后发现该蛋白为抗原指数较高的亲水蛋白；预测其跨膜结构后发现该蛋白共有 个氨基酸，其中氨基酸 组成其膜外区（图），预测信号肽后发现该蛋白无信号肽（图），用 （）截取膜外区抗原指数较高的一段序列（区段：，预测分子质量 ），在序列 两 端 添 加 起 始 密 码 子 和 终 止 密 码 子，最后将获得的重组质粒进行双酶切验证（图），最终预测该 重组蛋白大小为 。重组质粒 的表达及表达形式将 （）培 养 至 值为 时，用 的 诱导，收集菌体，检测，重组菌诱导后产物中有清晰的目的条带；溶菌酶破碎离心后的沉淀中蛋白的表达量更多一些，表明 重组蛋白在 中成功表达，且主要以包涵体形式表达，大小约为 （图），与预测结果相符。动物医学进展 年第 卷第期（总第 期）图双峰驼 蛋白亲水性与抗原表位的预测 图双峰驼 蛋白跨膜区预测 图双峰驼 蛋白信号肽预测 标准 ；双酶切；（）载体 ；（）图重组质粒的双酶切验证 重组 表达条件优化分别用不同的 浓度诱导目的蛋白表达，验证在这个 浓度范围之间（）蛋白表达量的变化，就表达结果来说，浓度为 时，蛋白表达量相对较多但变化并不显著（图），故后续试验将 定为最佳诱导浓度。蛋白分子质量标准；未诱导重组蛋白；诱导后重组蛋白；上清；沉淀 ；图双峰驼 重组蛋白表达的 检测 蛋白分子质量标准；未诱导重组蛋白；分别以、的 浓度诱导后的重组蛋白 ；，图双峰驼 重组蛋白 诱导浓度的优化 张睿等：双峰驼 蛋白的表达与抗体制备及在肾脏的分布分别以不同时间（）诱导目的蛋白表达，验证，用 条件下诱导时，就有目的蛋白表达，但在时目的蛋白表达最大（图），因此，选择作为重组 蛋白的最佳诱导时间。蛋白分子质量标准；未诱导重组蛋白；分别以、的产物 ；，图双峰驼 重组蛋白 诱导时间的优化 蛋白的纯化结果将表达的 重组蛋白进行纯化，从镊柱上洗脱下来的纯化蛋白，经测定其最高蛋白含量，验证，纯化的蛋白纯度良好，无杂蛋白，大小为 （图）。蛋白分子质量标准；纯化后的蛋白 ；图双峰驼 重组蛋白纯化 抗体效价的检测结果 结果显示，兔抗 蛋白血清能和重组蛋白特异性结合，即具有反应原性。抗血清与免疫前血清分别以 和 稀释时，（阳性）（阴性），即该血清抗体效价是 。双峰驼 重组蛋白的 鉴定结果 测试结果显示在 膜上约 处有清晰的蛋白印迹条带存在（图），表明该抗体能与 重组蛋白特异性结合，即双峰驼 重组蛋白具有良好的反应原性。蛋白分子质量标准；未诱导重组蛋白；纯化后的蛋白 ；图双峰驼 重组蛋白的 鉴定结果 在双峰驼肾脏表达的免疫组织化学染色结果免疫组织化学染色结果显示，在双峰驼肾脏组织中大量表达，主要表达在肾小管上皮细胞的胞浆中，这与其为膜内受体的分类一致，在肾小球系膜细胞中也有少量表达（图）。讨论传统的获取蛋白质方式是从动物组织中提取，但所需获取的生物活性蛋白结构复杂且性质不稳定，试验条件难以控制，提取难度大。本团队也曾做过类似尝试，但都耗时较长、提纯难度大且试验样品不易获取。与此相比，目前仍广泛用于获取各种蛋白质的原核表达方法就表现出一定的优势，该方法具有研究背景清楚、经济、快速、简单、产量高等优点，因此，为弥补传统方法获取蛋白困难的缺点，试验中我们选择用大肠埃希氏菌来表达重组蛋白。同时，有研究表明，优化密码子是增加蛋白表达量的一种途径，且该方法已广泛应用于有关蛋白质及疫苗的研究中。因此，本试验对截取的一段基因序列进行了密码子优化，成功构建了 重组质粒，并用原核表达系统高效表达了双峰驼 的重组蛋白。当所用试验条件和材料确定不变后，蛋白表达量的多少与 浓度之间存在着某种联系，常用的 浓度范围为 ，当 浓动物医学进展 年第 卷第期（总第 期）第一列为苏木精伊红染色，第二列为阴性对照，第三列为免疫组织化学染色。肾小球（）（箭头所指为肾小球系膜细胞免疫组织化学染色阳性）；肾（）；肾小管（）（箭头所指为肾小管上皮细胞免疫组织化学染色阳性），（）（）；（）；（）（）图 在双峰驼肾脏的分布特征 度超出这个范围时会对细胞产生一定的毒副作用，对细菌蛋白的表达不利，当 浓度小于这个范围时蛋白的表达量太小或者直接不表达，无法满足研究需求。诱导重组蛋白表达时，诱导时间的长短是影响重组蛋白表达量的另一个重要因素。诱导的时间过短，蛋白表达量较少，但诱导的时间过长，蛋白可能会被细菌蛋白酶降解，且重组菌因老化而破碎难度增大。诱导浓度对蛋白表达量的影响很微弱，但诱导时间对重组蛋白的表达量的影响较大，随着诱导时间的延长，重组蛋白的表达量增多，这与孔慧芳等 的研究结果相符。通过对重组蛋白的纯化、动物免疫等，制备出多克隆抗体，再用 和 对抗血清进行检测发现，抗体效价为 ，且该抗体能与重组蛋白特异性结合，也就是说，已成功制出特异性良好的兔源性双峰驼 多克隆抗体。有研究证明，通过信号通路来调控肾病的进程，另有研究显示，在肾脏疾病的致病机理中可能有十分关键的作用。双峰驼作为多用途的地方性经济畜种，其饲养和使用周期均较长，出现相关泌尿生殖道疾病的概率较其他家畜更高。本研究用兔免疫血清作为一抗进行免疫组织化学染色发现，在双峰驼肾小管上皮细胞呈强表达，且主要为胞浆表达，在肾小球系膜细胞中也有少许表达。本结果可以为进一步研究双峰驼 在肾脏中发挥作用的机制积累了资料。参考文献：尹淑园三角帆蚌 样受体的鉴定及其免疫功能研究江西南昌：南昌大学，孔伟梁，王俊，周斐 和 在卵巢癌组织中的表达及临床意义中国妇幼保健，（）：段家文，乔瑞峰，雷坤，等卵形鲳鲹 蛋白原核表达及其多克隆抗体制备南方农业学报，（）：王正安，符起亚模式识别受体与慢性牙周炎的研究进展海南医学院学报，（）：唐章文，戴文香，苏琦 样受体与肿瘤的研究进展中国现代医药杂志，（）：吴倩，郑秀花，刘亚丽人参皂苷 介导 信号通路对哮喘大鼠的抗炎作用机制中国老年学杂志，（）：李琴，郭莉莉，史文静 、蛋白表达与宫颈鳞癌盆腔淋巴结转移的相关性分析中国性科学，（）：（），（）：朱小娟，韩玫瑰，张芳敏，等，样受体和 样受体在张睿等：双峰驼 蛋白的表达与抗体制备及在肾脏的分布原发性 肾病患儿肾组织中的表达及意义新乡医学院学报，（）：贾妮旦，赵德安，刘海玉，等 样受体、在原发性肾病综合征患儿外周血单个核细胞中的表达 中华实用儿科临床杂志，（）：李东海，张旺东，程翠翠，等双峰驼血清 亚型的分离纯化及多克隆抗体的制备 兽类学报，（）：陈徵婷，可小丽，郑少玲，等无乳链球菌 蛋白的密码子优化、原核表达及免疫原性研究 农业生物技术学报，（）：，（）：孔慧芳，赵商岐，刘斌，等 细粒棘球蚴重组蛋白 诱导表达条件探索寄生虫病与感染性疾病，（）：陈义忠，何毅辉，陈琅，等 通过靶向 通路调控免疫因子 对肾病综合征大鼠细胞凋亡的影响 免疫学杂志，（）：韦娜 、在儿童微小病变型肾病肾组织中的表达及临床意义 河南新乡：新乡医学院，（，）：（），：；动物医学进展 年第 卷第期（总第 期）