还原响应性聚合物纳米胶束的制备及体外评价.pdf

化学试剂 第 卷第 期还原响应性聚合物纳米胶束的制备及体外评价李世玺冯佳敏刘雪梁旭华王学军(商洛学院 生物医药与食品工程学院陕西 商洛)摘要:以还原响应性两亲性嵌段共聚物 为载体阿霉素()为模型药物通过透析法制备载药聚合物胶束并选择 细胞进行体外抗肿瘤研究 所制备的类球形聚合物胶束具有适宜的粒径尺寸和较好的载药性能(载药量 包封率)在模拟的还原性条件下纳米载体的双硫键发生断裂实现药物的快速释放 体外细胞毒性结果显示聚合物胶束对 细胞具有良好的杀伤作用 采用激光共聚焦显微镜()和流式细胞仪()观察和测定 细胞对胶束的摄取和细胞内的药物释放与分布情况结果显示载药胶束能够有效地被肿瘤细胞摄取在细胞质内快速释药并进入细胞核 因此还原响应性聚合物 在抗肿瘤药物的靶向递送及可控释放方面具有良好的应用前景关键词:还原响应性聚合物胶束阿霉素纳米载体中图分类号:.文献标识码:文章编号:():./.():().(:).()().:收稿日期:网络首发日期:基金项目:陕西省自然科学基础研究计划资助项目()陕 西 省 教 育 厅 专 项 科 研 计 划 项 目()商洛学院自然科学研究项目()商洛市科技计划项目()陕西省科技创新团队项目()陕西省大学生创新创业训练计划项目()作者简介:李世玺()男河南平顶山人博士讲师研究方向为中药纳米制剂及药物合成工艺通讯作者:王学军:.引用本文:李世玺冯佳敏刘雪等.还原响应性聚合物纳米胶束的制备及体外评价.化学试剂():当今社会癌症已经成为威胁人类健康的一大杀手每年都有数以百万计的患者死于癌症目前在癌症的临床治疗中化疗是一种常用的治疗方法大量的化疗药物(如阿霉素、紫杉醇和喜树碱等)用于癌症的临床治疗显示出良好的抗肿瘤活性 受制于较差的水溶性、不稳定性以及对正常组织的毒副作用传统的化疗药物制剂在临床应用中遇到了极大的挑战 纳米药物载体的问世为这一问题的解决提供了一种新的思路 纳米药物载体能够有效地提高化疗药物的溶解度、增强稳定性、延长循环时间、降低对正常细胞的毒副作用和增强抗肿瘤效果 然而传统的纳米药物载体也存在一些弊端因其不可控和不完全的药物释放致使药物无法有效地在病灶部位富集不仅降低了药物的生物利用度而且也容易引起病变细胞的耐药性第 卷第 期李世玺等:还原响应性聚合物纳米胶束的制备及体外评价近年来研究人员通过研发具有特定刺激响应性的药物运载体系来调控化疗药物的递送和释放 目前已经有一系列不同刺激响应性信号(如酶、氧化还原、葡萄糖、和温度)被应用到纳米载体的设计当中极大促进了纳米药物递送体系的发展 正常体液中谷胱甘肽浓度(/)远低于癌细胞中(/)谷胱甘肽的浓度差异经常被用于刺激响应性纳米载体的设计当中 作为能够被谷胱甘肽诱导断裂的化学键双硫键已经被广泛地应用于各种还原响应性纳米载体的制备中本文以聚合物 为载体通过自组装方式负载抗肿瘤药物 形成具有规则形状的均一性聚合物载药纳米胶束 聚合物胶束进入肿瘤细胞后细胞内还原性试剂引发聚合物的双硫键断裂纳米胶束的结构遭到破坏从而释放出所负载的药物并杀伤肿瘤细胞 还原响应性两亲性嵌段共聚物 载药胶束的形成过程、体内的递送、细胞的摄取和细胞内的还原响应性药物释放如图 所示图 负载 的 胶束的形成、递送和细胞内药物释放示意图.实验部分 主要仪器与试剂 型纳米粒度电位仪(英国 公司)型透射电子显微镜(日本电子公司)型荧光光谱仪(日本日立公司)型酶标仪(美国伯乐公司)型激光扫描共聚焦荧光显微镜(日本尼康公司)型流式细胞仪(美国贝克曼公司)两亲性嵌段共聚物、(本课题组自制)(德国默克公司).(上海英轩公司)(美国 公司)、培养基、胰蛋白酶、双抗(美国 公司)胎牛血清(美国 公司)细胞(中国典型培养物保藏中心)载药胶束的制备及应用 胶束对阿霉素的包载聚合物载药胶束通过透析法制备:将 .和 三乙胺溶于 避光搅拌 加入 或室温继续避光搅拌 将 去离子水缓慢滴加到此混合液中继续搅拌 随后将其分别转移至透析袋()中定时更换透析缸内的二次水室温透析 即得 或 的载药胶束 将聚合物载药胶束用 的水系滤膜过滤即得粒径均一的载药胶束 分别取 载药胶束冻干将其用一定量的 溶解利用荧光光谱仪测定 处的发射光强度 依据所制的/的标准曲线来计算胶束中 含量 载药胶束的表征聚合物胶束粒径和粒径分布通过动态光散射仪()进行测定每个样品测定 次后取平均值 聚 合 物 胶 束 的 形 态 由 透 射 电 子 显 微 镜()检测观察样品制备过程具体为:将聚合化学试剂 第 卷第 期物胶束溶液稀释至合适浓度(/)后滴加到镀有 膜的铜网上烘干后使用 (/)的磷钨酸溶液进行染色晾干后即可通过透射电子显微镜观察颗粒的形貌 载药胶束的体外释放以聚合物 的载药胶束()为实验组 的载药胶束()和游离()为对照组模拟还原性环境(含 /的 /)和非还原性环境(不含 的 /)进行体外药物释放实验 具体的操作步骤如下:分别将 的上述 种溶液移至透析袋()中密封好之后浸入 相应的缓冲溶液中于 恒温振荡(/)在设定的时间点从各体系中分别取出 缓冲液并补加相同体积相应的新鲜缓冲液使体系中缓冲液的总体积不变 通过荧光光谱仪测定样品中 含量 载药胶束的细胞毒性采用 法来考察聚合物载药胶束对 细胞的杀伤效果:使用完全 培养基将游离 以及 或 的载药胶束逐级稀释到不同浓度 浓度范围为 /将其分别取 加入到预先种有 细胞的 孔板中(对照组只加入 完全 培养基)于 下继续培养 每孔中加入 于 培养 后移除孔中的 及培养基每孔加入 室温下轻柔振荡使蓝紫色的晶体甲瓒彻底溶解利用酶标仪()测定各孔中溶液在 处的吸光值 每个浓度的胶束溶液和对照组做 个平行样细胞的相对存活率()()/()式中:为背景值(该孔未加胶束及)为对照值(该孔未加胶束而只加)而 则是含不同浓度胶束的各孔的实验值 共聚焦荧光显微镜观察细胞对载药胶束的摄取及细胞内药物分布采用激光共聚焦荧光显微镜()研究聚合物载药胶束被肿瘤细胞摄取情况和细胞内的 分布情况 将 培养基稀释过的 或 载药胶束加入到预先种有 细胞的激光共聚焦皿中 的最终浓度为 /将其分别培养 或 后取出用 缓冲液(/)洗涤()然后用 多聚甲醛溶液避光固定 用 缓冲液清洗()然后于 用 /对细胞核染色 用 缓冲液清洗()在肿瘤细胞内的分布状况可通过 进行观察 流式细胞术研究细胞对胶束的内吞采用流式细胞分析仪()对 细胞内 进行定量测试:将用 培养基稀释过的 或 载药胶束加入到预先种有 细胞的六孔板中 的最终浓度为 /分别培养 或 在设定的时间点移除材料及培养基用(/)缓冲液漂洗()加入胰蛋白酶进行消化用完全 培养基均匀吹打细胞 细胞悬浮液离心后除去上清液用 洗涤两遍然后用 多聚甲醛溶液重悬 使用 定量检测细胞内 含量激发波长为 数据使用 软件进行处理 结果与讨论 聚合物胶束的制备与表征以两亲性聚合物 或 为载体以阿霉素为模型药物采用透析法制备载药胶束 两亲性聚合物在水中能够自组装成胶束疏水性药物与聚合物疏水端通过相互作用从而包载于胶束内核制成载药胶束聚合物与阿霉素的原始投料质量比为 通过荧光光谱法测定聚合物胶束的载药率其中还原敏 感 性 聚 合 物 的 载 药 率 为 非还原敏感性聚合物 的载药率为 二者的载药率基本一致随后采用 和 表征该聚合物的载药胶束的粒径和形态结果详见表 从图 中可以看出还原敏感性聚合物 载药胶束的粒径呈现单分散性分布较窄其粒径平均尺寸为 为 测试结果显示该载药胶束具有比较规则的球形轮廓其粒径尺寸约为 (图)相较于 所测结果该方法所测得的胶束粒径较小主要因为此法制样过程中聚合物胶束经历了干燥过程致使其中亲水性外壳发生坍塌从而造成了尺寸的缩减 非还原敏感型聚合物 载药胶束作为对照组其粒径和形貌同还原敏感性聚合物的第 卷第 期李世玺等:还原响应性聚合物纳米胶束的制备及体外评价载药胶束基本上一致(图、)因此这两种聚合物载药胶束的粒径尺寸及分布符合抗癌药物载体的要求表 两亲性聚合物胶束性质及载药性能注.)/)/()(/)/)/注:)、.、.图 负载 的聚合物胶束的粒径分布和 图.载药胶束的体外药物释放模拟体外还原性环境(中含 /)和非还原性环境()研究聚合物载药胶束的药物释放状况其药物累积释放曲线如图 所示 从图 可以看出游离阿霉素在 中出现暴释不到 就有约 的药物释放出来 还原敏感性聚合物 的载药胶束在非还原性条件下释药速率较慢 之后其释药量趋于稳定仅有约 的 从胶束中释放出来 该胶束在还原性环境中的释药速率则大为改观 就有约 药物释放出来随着释药时间的增长累积释药量可达 这是由于该聚合物的双硫键在 存在下发生断裂造成胶束结构破坏致使胶束内核中负载的 快速释放出来.图 聚合物胶束在不同条件下的体外 释放().()非还原敏感性聚合物 的载药胶束的累积释药曲线见图 该载药胶束在还原性和非还原性条件下的释药速率均较低其释药情况无显著性差别 即使释药时间延长至 其累积释药量仍然不超过 相较于还原敏感性聚合物载药胶束其释药状况大为逊色因此还原敏感性聚合物 的载药胶束可以实现定点快速释药在抗癌药物运载体系方面具有一定的应用潜力 载药胶束的体外细胞毒性通过 法分别研究游离、还原敏感性聚合物 载药胶束以及非还原敏感性聚合物 载药胶束对肿瘤细胞(细胞)和正常细胞(细胞)的杀伤 从图 可知游离、载药胶束和 载药胶束对 细胞 的 半 致 死 量()分 别 是 、/作为小分子药物可以通过被动扩散而快速进入肿瘤细胞内进而迅速在细胞核富.细胞.细胞图 负载 的聚合物胶束和游离 与不同细胞共培养 后细胞毒性().()化学试剂 第 卷第 期集实现对肿瘤细胞的高效杀伤 聚合物载药胶束则通过内吞作用进入肿瘤细胞 从胶束中释放出来 聚合物载药胶束的药物释放延滞性使得细胞核内的瞬时药物浓度低于游离 组因此其细胞毒性要小于游离 相较于 载药胶束还原敏感性聚合物 载药胶束对 细胞的杀伤效果更加显著 由于肿瘤细胞内含较高浓度的谷胱甘肽在细胞内还原性条件下 的双硫键断裂致使载药胶束解体从而导致 从中快速释放出来细胞核内 的瞬时浓度相对较高因此杀伤效果明显 而聚合物 因缺乏具有还原敏感性的双硫键该胶束的结构不会因为肿瘤细胞内的环境而发生改变其所载的 只能缓慢释放出来所以其抗癌效果相形见绌图 为游离 及聚合物载药胶束对 细胞的毒性曲线 从图中可以看出游离 对正常细胞的毒副作用极大 由于聚合物胶束通过非共价的方式载药不可避免会出现部分药物泄露因此对正常细胞具有一定的毒副作用 然而相较于游离 聚合物载药胶束对正常细胞的毒性已经大幅度减弱实现了“减毒增效”之目的 肿瘤细胞对载药胶束的摄取为了进一步验证还原响应性聚合物 载药胶束在肿瘤细胞内的还原响应性药物释 放 性 质 利 用 激 光 共 聚 焦 荧 光 显 微 镜()研究肿瘤细胞内 的分布情况并且用流式细胞仪()定量分析细胞内 的荧光强度还原响应性聚合物 载药胶束和 载药胶束分别与 细胞共培养 或 然后通过 观察细胞内 分布状况情况结果如图 所示 从图中可以看到实验组聚合物 载药胶束与 细胞共培养 之后细胞内可以明显看到 的红色荧光 作为对照组的 载药胶束与 细胞共培养 细胞内仅有微弱的荧光 将共培养时间延长至 两组细胞内的红色荧光均会明显增强 实验组细胞内具有较强的红色荧光 不仅广泛分布在细胞质中细胞核内也有大量的富集 而对照组细胞内荧光强度虽有增强但依然明显弱于实验组并且 主要存在于细胞质中细胞核内鲜有分布 这种差异要归因于实验组聚合物具有双硫键其在富含谷胱甘肽的肿瘤细胞内会发生断裂致使 迅速从胶束中释放出来而对照组聚合物无此性质 该实验结果与载药胶束的体外释药和体外细胞毒性实验结果相吻合进一步验证了还原敏感性两亲性前段共聚物 载药胶束具有还原响应性释药性质 剂量:/、.、.、.游离 图 不同胶束及游离 与 细胞共培养()或 ()后 图.()()聚合物 载药胶束(实验组)、载药胶束(对照组)分别与 第 卷第 期李世玺等:还原响应性聚合物纳米胶束的制备及体外评价细胞共培养 或 通过流式细胞仪()对 细胞内游离 含量进行检测结果如图 所示 从结果中可以看出这两组聚合物载药胶束与 细胞共培养 或 之后实验组的荧光强度均明显高于对照组随着共培养时间的增长这两组细胞内荧光强度均会增强 此结果同 实验结果一致进一步验证了聚合物 载药胶束在肿瘤细胞内的还原响应性释药特性为其在抗癌药物运载系统的应用奠定了基础 剂量:/.图 不同胶束与 细胞共培养 或 后的流式细胞仪分析结果.结论本文以还原敏感性两亲性嵌段共聚物 为载体材料选择 作为抗肿瘤模型药物通过透析法制备载药聚合物纳米胶束该载药胶束具有较高的包封率和载药量较为规则的球形轮廓和适宜的粒径尺寸及分布 体外释药实验表明该聚合物载药胶束在还原性条件下能够快速释放出大量游离 体外细胞毒性实验显示该聚合物载药胶束对 细胞具有良好的抑制作用 利用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪进一步证实了该胶束在肿瘤细胞内的还原敏感性药物释放直观地解释了其体外细胞毒性实验结果 因此还原敏感性聚合物 在用作抗癌药物载体领域具有巨大的潜力参考文献:.():.:().:.().():.():.():.:.:.():.陈文雪靳丹丹朱良亮等.上转换 聚多巴胺纳米光热剂的制备及载药与抗菌性能.化学试剂():.徐小欢孙继红.和温度响应型介孔 杂化材料的药物控释研究进展.化学试剂():.:.贤凤程婉婷高静.壳聚糖纳米粒子的制备方法及其作为药物递送载体的应用.化学试剂():.:.:.化学试剂 第 卷第 期 .:.:.:.:.():.:.:.:.:.:.:.:.:.