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siRNA导入细胞的策略
siRNA导入哺乳动物细胞的策略
RNAi在哺乳动物细胞中通常用于阻断特定基因的表达从而研究基因的功能。成功的进行RNAi的问题在于使siRNA导入细胞，常见的做法是将靶向特定基因的大约21碱基长短的双链siRNAs(small interfering RNAs)，或者是45—50-mer的发夹结构RNA（small hairpin RNA, shRNA）转染到细胞。此外，通过质粒表达siRNAs同样可以抑制特定基因的表达。
1.1 siRNA的转染
将一种特殊构建的ｓｉＲＮＡ—对称性 3′突出2nt的约 21nt (nucleotide)siRNAs双链复合物通过阳离子脂质体可以转入哺乳动物细胞中。
1.2 shRNA转染引入细胞
45—50-mer的发夹结构RNA（small hairpin RNA, shRNA）转染到细胞。shRNA在细胞内会自动被加工成为siRNA，从而引发基因沉默或者表达抑制。
1.3 胞内表达siRNA
　 体内载体合成siRNA,是最近迅速发展起来的新技术。它是 2 0 0 2年 2月 ,由Patrick等首先报道的利用载体在细胞体内稳定地表达siRNA ,从而抑制哺乳动物细胞靶基因表达的方法[1,2]。其基本思路如下 :细胞内存在RNA polymerase III,它可以识别Ｕ6启动子 ,从而使启动子后的基因转录成ＲＮＡ。当模板连续出现 3～ 5个“Ｔ”碱基时 ,转录就会终止。根据这一机制 ,可以设计一种能表达ＲＮＡ的质粒 ,其组成包括四部分 :①常用质粒的基本序列 ;②Ｕ6启动子 ,位于克隆位点的上游 ;③克隆位点 ;④ＲＮＡｉ模板序列 (ＤＮＡ)。这部分序列具有如下特点: 含RNAi序列 ,对哺乳动物而言 ,通常为21-23个核苷酸；发卡结构环状部分 ,通常有 4～ 7个核苷酸 ;靶序列的反向互补序列; 3～5个核苷酸“T”。将具有如上结构的质粒导入细胞内, 体内的RNA polymerase III就可以合成一条ＲＮＡ链 ,这条ＲＮＡ链可以通过两端的 2 1个左右的核苷酸反向互补特性而形成发卡样双链结构 ,从而起到基因抑制作用。这种技术的使用 ,操作简便 ,成本低 ,与直接导入SiRNA相比 ,DNA质粒更易导入细胞内 ,而且质粒导入细胞后存在时间长且稳定 ,对靶基因的表达抑制效率高 ,便于进行较长时间的基因功能研究 ,因而近日来成为一种热门技术 ,Cythla等2002-05对载体进行了改进 ,使RNAi效率提高到 99%以上[3]。他们的作法是 ,在上述载体的克降位点上游加入了人Ｕ6ＲＮＡ的前 2 7个核苷酸 ,在克隆位点下游又加上一段能形成发卡样结构的核苷酸序列及转录终止信号poly(u)。据报道 ,这种改进的质粒大大增加了siRNA的转录效率及稳定性 ,同时对靶基因的抑制作用也大大增加 ,因而被认为是迄今报道的最完善的质粒载体。
     胞内表达siRNA，尽管细节各有不同，但载体大都是用RNA聚合酶III（Pol III）启动子启动编码shRNA(small hairpin RNA) 的序列。选用Pol III启动子的原因在于这个启动子总是在离启动子一个固定距离的位置开始转录合成RNA，遇到4—5个连续的U即终止，非常精确。当这种带有Pol III 启动子和shRNA编码序列的质粒转染哺乳动物细胞时，这种能表达siRNA的质粒确实能够下调特定基因的表达，抑制范围包括外源基因和内源基因。采用这种方法的优点在于，通过siRNA表达质粒的选择标记，siRNA载体能够更长时间地抑制目的基因表达。当然还有一点，那就是由于质粒可以复制扩增，相比起化学合成来说，这就能够显著降低制备siRNA的成本。
      pSilencer  siRNA 表达载体系列是用于在培养的哺乳动物细胞中表达siRNA的一系列载体。在载体上包含有RNA Pol III启动子，氨苄抗性基因和大肠杆菌复制子，只要将编码一小段对应目的基因特异序列的、其RNA能形成发夹结构的DNA序列插入载体中Pol III 启动子的下游，转入哺乳动物细胞，载体就能表达出发夹结构的RNA，这种RNA很快在细胞中加工成为siRNA。
      这些表达载体已经成功地在Hela细胞中抑制了包括Cyclophilin、GAPDH、p53、c-myc在内的多个基因的表达。实验表明：能够被化学合成或者体外合成的siRNAs抑制的基因同样可以被表达相同序列的载体生成的siRNAs抑制。
      载体pSilence  1.0-U6是采用小鼠U6 Pol III启动子。是由哈佛大学开发的载体，已经成功地在Hela、H1299, U-2 OS和C-33A细胞中敲除了cdk-2和laminA/C的表达。这个载体经过Apa I和EcoR I酶切线性化和纯化，先合成一对55-mer的寡核苷酸，带有4个碱基的突出，一起退火、快速连接就可以转化。
pSilencer 2.0-U6 and pSilencer 3.0-H1，这两个载体带有不同的RNA Pol III 启动子，pSilencer 2.0-U6带的是人的U6启动子，pSilencer 3.0-H1则是用H1 RNA启动子（RNase P的一个组成部分）。这两个载体都是用BamH I和Hind III线性化并且经过纯化的，方便定向克隆。
在2003年6月1日的 《基因与发育》杂志上，Shunsuke Ishii和他的同事报道，他们构建了一个新RNAi载体，这种方法既避免了引起干扰素应答，又允许组织特异性抑制基因表达。这个载体被命名为pDECAP，标志着RNAi转基因技术取得重大突破。在迄今开发的RNAi转基因系统中，发卡状小RNA由RNA聚合酶III启动子或病毒启动子表达。然而这些系统无法用于组织特异性敲除基因功能，因为这些启动子在所有细胞类型中都有活性。而这种系统是利用RNA聚合酶II启动子来表达发卡状dsRNA, 因此应用这种系统可以创造出组织特异性基因敲除动物。PDECAP载体系统是由RNA聚合酶II启动子来表达dsRNA，该启动子只在特定细胞类型中激活。Ishii博士和他的同事可以选择敲除哪些组织中的基因功能。为避免干扰素应答，Ishii博士和它的同事对载体系统进行了改造，使其可以转录缺少将RNA从细胞核转移到细胞质的序列的dsRNA。相反,pDECAP表达的dsRNA被扣留在细胞核中，在这里被加工成siRNA。这些siRNA然后被释放到细胞质中，直接降解靶mRNA而不会激起干扰素应答。
1.4 微注射和注射
在小鼠卵母细胞和植入性胚胎中微注射RNA技术 ,如它能干涉合子中E-cadherin的表达 ,破坏胚层的生长发育 ,表型类似于E-cadherin基因敲除小鼠基因。
美国哈佛医学院的科学家在最新一期英国《自然医学》杂志上报道，他们首次使活体动物的基因沉默，治愈了实验鼠的肝炎。这次试验的做法是：在实验鼠尾部的血管注入靶定Fas基因的siRNA，发现有90%的肝细胞接受到了这种RNA分子。Fas蛋白质的产量变为原来的十分之一。（Nature Medicine 2003;10.1038/nm828）
对于人来说，身体比老鼠大的多，血液循环系统也庞大。科学家正在寻找把siRNA送到人体特定部位的方法，以便验证RNAi在人体中的效果。
siRNA导入低等动物个体的策略
dsRNA首先应用于非脊椎动物中的线虫,dsRNS导入线虫有两种途径 :⑴微注射dsRNS ;⑵线虫进食含ｄｓＲＮＡ的Ｅ .ｃｏｌｉ也可产生弱效应 ,且效应是可逆的。
2.1 微量注射
在研究线虫、果蝇、涡虫的ＲＮＡｉ时 ,普遍采用了双链ＲＮＡ微量注射方法。ｄｓＲＮＡ的注射方式有三种 :⑴直接注射ｄｓＲＮＡ(注射前退火形成稳定的双链 );⑵在低盐浓度下把有义及反义ＲＮＡ混合后注射 ;⑶把有义及反义ＲＮＡ分开注射 ,但间隔必须尽量短 ;如果两者注射间隔时间超过 1小时 ,则基因干涉能力将迅速下降。
2.2 低等动物的喂食
Fraser等与Gnczy等人在研究RNAi上取得了可喜的成绩 ,他们利用RNAi特异性这一优点 ,合成了上千个与开放读框相对应的双链ＲＮＡ和表达这些双链ＲＮＡ的细菌克隆 ,分别用微量注射和喂食的方法导入线虫体内 ,干扰同源基因的表达 ,再运用子代分析和定时差异干扰比较 (differential interference contrast, DIC)显微分析法 ,成功地在基因组水平上大规模地筛选了功能基因 (称为ＲＮＡｉ筛选 ) ,证实了线虫染色体Ⅰ和染色体Ⅲ中早期胚胎细胞分裂及细胞代谢等有关的所有基因功能 (Ｇ ｎｃｚｙ ,2 0 0 0 ;Ｆｒａｓｅｒ,2 0 0 0 )。其中,Ｆｒａｓｅｒ等在研究中设计了可表达ｄｓＲＮＡ的细菌文库,由于文库中的细菌克隆可以复制,因此,用喂食进行的ＲＮＡｉ筛选具有低成本、高效、高重复使用性的优点
2.3 电穿孔转染
恶性疟原虫 dhodh和 aro C基因用常规PCR从恶性疟原虫基因组 DNA中扩增而来。将 ds RNA加入到同期疟原虫中 ,对环状滋养体用 5%山梨糖醇培养 42 - 44h,对晚期滋养体需再培养 2 4h,然后用 2 0 0 Ω,2 5μF和 6. 2 5Kv Cm-1 的电流进行电穿孔。用RPMI- aro培养基稀释并分装至 96格的培养皿中 ,每个样本一式三份 ,每 2 4h更换一次培养基。疟原虫的生长可通过测量放射性示踪物质次黄嘌呤的结合进行监测
2.4 体内表达siRNA
利用热诱导控制表达形成ｄｓＲＮＡ干扰基因表达 ,可以控制ＲＮＡｉ在特定时期表达 ,拓展了ＲＮＡ干扰的应用空间 .利用热诱导可以使整个生物体产生全局性的干扰 ,而不至于产生传统ＲＮＡ微注射干扰带来的镶嵌现象[5 ]
目前采用的解决方法主要是利用Ｐ因子载体 ,以更准确地了解这类基因功能 ,在其上游构建热启动子和构建内源的可稳定遗传的ＩＲ基因(ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｒｅｐｅａｔ),将该载体转入果蝇的品系中 ,在需要时热诱导ＩＲ基因表达 ,形成发夹结构ＲＮＡ (hairpin loop RNA),以此类ｄｓＲＮＡ的结构实现对基因表达的干扰 ,且效果与注射ｄｓＲＮＡ相似 . 将目的基因的靶序列以反向重复的方式 ,由热激启动子控制在转基因生物中表达。热激处理后 ,反向重复序列在细胞内开始转录 ,其产物会形成具发夹环结构的ｄｓＲＮＡ ,从而产生ＲＮＡｉ,使目的基因沉默[1 2 ]。这种改进的ＲＮＡｉ技术与传统的ＲＮＡｉ技术相比 ,具有明显的优点 :首先转基因可以遗传给后代 ,有利于突变的分析 ;其次ｄｓＲＮＡ可以被诱导产生 ,ＲＮＡｉ能够在发育特定阶段出现 ,从而使研究发育早期必需基因在发育晚期的功能成为可能 ;另外 ,当用细胞特异性启动子控制ｄｓＲＮＡ的表达时 ,可以研究特定基因在不同器官中的功能
　　利用热诱导控制表达形成ｄｓＲＮＡ干扰基因表达 ,可以控制ＲＮＡｉ在特定时期表达 ,拓展了ＲＮＡ干扰的应用空间 .利用热诱导可以使整个生物体产生全局性的干扰 ,而不至于产生传统ＲＮＡ微注射干扰带来的镶嵌现象;利用ＩＲ序列可以构建大量稳定的果蝇品系 ,比如一些温度敏感型 ,而在过去 ,这些突变型只能通过对开放末端(ｏｐｅｎ ｅｎｄｅｄ)进行反复筛选得到.如果结合ＧＡＬ4 ＵＡＳ系统或组织特异性的启动子 ,可以进行一定时期一定组织特异的ｄｓＲＮＡ表达以干扰相应的基因表达 ,从而精确知道ＲＮＡｉ产生的时间和位置。[6]
siRNA导入植物细胞的策略

尽管在研究线虫、果蝇、涡虫的ＲＮＡｉ时 ,普遍采用了双链ＲＮＡ微量注射方法 ,但这个方法对研究植物ＲＮＡｉ却没成功。鉴于这一点 ,Ｃｈｕａｎｇ等人构建了可以在细胞内转录为双链ＲＮＡ的ＤＮＡ嵌合结构 ,利用农杆菌把此结构转化到拟南芥中 ,成功的利用ＲＮＡｉ干扰作用证实了拟南芥中与花发育有关的基因的功能 ,并证明ＲＮＡｉ在对应的转基因植物中是稳定的 ,并且可以传给后代 (ＣｈｕａｎｇＣｈｉｏｕ＿ＦｅｎａｎｄＭｅｙｅｒｏｗｉｔｅ ,2 0 0 0 )。而植物中ＲＮＡｉ作用稳定这一点在其它方法产生的ＲＮＡｉ的生物体内 (如双链ＲＮＡ微量注射的动物 ,ＲＮＡ转染的细胞 )并未体现。
为了使转化进细胞的序列可以转录成为双链ＲＮＡ ,Ｃｈｕａｎｇ等人设计出了ＤＮＡ嵌合体结构 ,即将两段序列相同的目的ＤＮＡ序列的 5’端分别连在同一个标记基因 (如ＧＵＳ报告基因 )的两端 ,使标记基因两端的ＤＮＡ呈类似回文的结构 ,再在一个 3’端连接一个强启动子。这种结构的转录产物为一个发夹结构 :目的ＤＮＡ序列的转录产物通过杂交形成双链 ,分别连在一个环状单链ｍＲＮＡ(ＧＵＳ的转录产物ｍＲＮＡ)的两头。这种ＤＮＡ嵌合体被载体转化到植物细胞后 ,会稳定的整合在宿主细胞的基因组上 ,并随着基因组复制给后代。这就是目的双链ＲＮＡ在植物中稳定表达并传给后代的原因
拟南芥是研究植物生长发育过程中基因功能的重要模型。在秀丽新小杆线虫、黑腹果蝇和布氏锥虫Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｂｒｕｃｅｉ等动物中采用ＲＮＡ微注射技术进行ｄｓＲＮＡ ;在拟南芥等植物中主要通过构建有义、反义ＲＮＡ和ｄｓＲＮＡ载体 ,利用Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ来转化基因 ,前两者也可产生弱的基因干涉功能 ;ｄｓＲＮＡ在拟南芥中作用特点如下 :⑴遗传性在ｄｓＲＮＡ植物亲代中ＡＰ1基因以孟德尔方式遗传 ,其效应可持续到子代 ,提示ｄｓＲＮＡ基因可整合到植物基因组中 ;⑵基因序列特异性 ;⑶共阻遏效应载体中两条链表达强度有差异 ,如果选用两个强度相等的启动子则会产生共阻遏效应 ,影响ｄｓＲＮＡ的干涉效应 ;因此必须选用强度不同的两种强启动子才能产生强的ｄｓＲＮＡ作用 ;⑷组织对ｄｓＲＮＡ耐受性不同[7]
参考文献：
1，Elbashir SM,Harbotrh J,Lendeckel W ,et al .Duplexes of 21 nuclecbied RNAs mediate RNA interference incultured mammalian cells [J]Nature,2001,411(494- 498).
2，Paddison PJ, Caudy AA,Bemstein E,et al . Short hairpin RNAs(shRNAs) induce sequence specific silencing in mammalian cells [J]. Genes Dev,2002,16:948-958.
3，Yu JY DeRuiter L Tumer DL .RNA interference by expression of ghoriinterfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells [J].Proc Natl Acad Sci USA ,2002, 99:6 0 47- 6 0 52
4，Timmons L ,Fire A. fire A.Specificinter ference by ingested dsRNA[L]Nature ,1988,3:95-854
5，kennerdell JR ,Carthew RW .Use of dsRNA mediated genetic interference to demonstrate that frizzledand frizzled 2 actin the wingless pathway.Cell, 1 998, 95(7):1 0 1 7～ 1 0 2 6
6，Tavernarakis N , Wang SL,Dorovkov M,et al.Heritable and inducible genetic interference by double stranded RNA encoded by transgenes [J].Nat genet, 2 0 0 0 , 2 4(2 ):1 80～ 1 83
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Proc.Natl.Acad.Sci.USA . 2 0 0 0 , 97:4985～ 4990