细胞中蛋白提取及含量测定.doc

蛋白提取及含量测定
试剂准备
1.74mg/ml (10mmol/L)PMSF
PMSF 0.174g
异丙醇 100ml
溶解后，分装于1.5ml离心管中，－20℃保存

单去污剂裂解液（50mmol/L Tris·HCl pH8.0，150mmol/L NaCl，1％TritonX－100，100mg/ml PMSF）：
1mol/L Tris·HCl（pH8.0） 2.5ml
NaCl 0.438g
TritonX－100 0.5ml
蒸馏水至 50ml
混匀后， 4℃保存。使用时，加入PMSF至终浓度为100mg/ml（0.87ml裂解液加入1.74mg/ml PMSF50μl）。

G250考马斯亮蓝溶液（测蛋白含量专用）
考马斯亮蓝G250： 100mg
95％乙醇： 50ml
磷酸： 100ml
蒸馏水至 1000ml
配制时，先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，再加入磷酸和水，混匀后，用滤纸过滤，4℃保存。

0.15 mol/L NaCl
NaCl（MW58.44） 0.877g
蒸馏水至 100 ml
高温灭菌后，室温保存。

100mg/ml 牛血清白蛋白（BSA）
BSA 0.1g
0.15 mol/L NaCl 1ml
溶解后，－20℃保存。制作蛋白标准曲线时，用0.15 mol/L NaCl进行100倍稀释成1mg/ml，－20℃保存。
操作步骤：
（一）   蛋白样品制备
（1）         单层贴壁细胞总蛋白的提取：
1、   倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。
2、   每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。
3、   按1ml裂解液加10 ml PMSF（100mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。）
4、   每瓶细胞加400 ml含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。
5、   裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。）
6、   于4℃下12000rpm离心5min。（提前开离心机预冷）
7、将离心后的上清分装转移倒0.5min的离心管中放于－20℃保存。
（2）    组织中总蛋白的提取：
1、将少量组织块置于1～2ml匀浆器中球状部位（或者在1.5ml离心管中加入少量裂解液，将其剪碎），用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。
2、加400 ml(250ul)单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中，置于冰上进行匀浆。
3、几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。
4、裂解30 min后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中，然后在4℃下12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于－20℃或－70℃保存。
（3）         加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取：
由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按（一）操作外还应收集培养液中的细胞。以下是培养液中细胞总蛋白的提取：
1、   将培养液倒至15ml离心管中，于2500rpm离心5min。
2、   弃上清，加入4ml PBS并用枪轻轻吹打洗涤，然后2500rpm离心5min。弃上清后用PBS重复洗涤一次。
3、   用枪洗干上清后，加100 ml裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。
4、 将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于－20℃保存。
（二）   蛋白含量的测定
（1）    制作标准曲线
1、从－20℃取出1mg/ml BSA，室温融化后，备用。
2、取18个1.5ml离心管，3个一组，分别标记为0mg，2.5mg，5.0mg ，10.0mg ，20.0mg ，40.0mg。
3、按下表在各管中加入各种试剂。

0mg
2.5mg
5.0mg
10.0mg
20.0mg
40.0mg
1mg/ml BSA
－
2.5ml
5.0ml
10.0ml
20.0ml
40.0ml
0.15mol/L NaCl
100ml
97.5ml
95.0ml
90.0ml
80.0ml
60.0ml
G250考马斯亮蓝溶液
1ml
1ml
1ml
1ml
1ml
1ml
4、混匀后，室温放置2min。在生物分光光度计（Bio－Photometer，Eppentoff）上比色分析。

（2）    检测样品蛋白含量
1、取足量的1.5ml离心管，每管加入4℃储存的考马斯亮蓝溶液1ml。室温放置30min后即可用于测蛋白。
2、取一管考马斯亮蓝加0.15mol/L NaCl溶液100 ml，混匀放置2分钟可做为空白样品，将空白倒入比色杯中在做好标准曲线的程序下按blank测空白样品。
3、弃空白样品，用无水乙醇清洗比色杯2次（每次0.5ml），再用无菌水洗一次。
4、取一管考马斯亮蓝加95 ml 0.15mol/L NaCl NaCl溶液和5ml待测蛋白样品，混匀后静置2min，倒入扣干的比色杯中按sample键测样品。
注意：每测一个样品都要将比色杯用无水乙醇洗2次，无菌水洗一次。可同时混合好多个样品再一起测，这样对测定大量的蛋白样品可节省很多时间。