固定化木瓜蛋白酶与溶液酶性质的比较1.doc

固定化木瓜蛋白酶与溶液酶性质的比较
学生姓名 刘晶 指导老师 万善霞
摘要：本文就木瓜蛋白酶固定化后的性质与其溶液酶性质进行了初步比较。以变性的卵清蛋白为载体，以戊二醛做交联剂固定木瓜蛋白酶。结果表明：与溶液酶相比，固定化后的木瓜蛋白酶最适反应温度提高了30℃，最适反应PH向碱性方向移动2.0，其热稳定性及耐热性均较溶液酶有显著提高。
关键词：木瓜蛋白酶；固定化；卵清蛋白；戊二醛

Comparison of the properties immobilized papain and
soluble papain
Liu Jing Wan Shanxia

Abstract: In this paper, the immobilized papain with the nature of a preliminary nature of the soluble papain compared.To denatured egg white protein as the support with glutaraldehyde as the cross-linker. The result showed that:compared with the soluble papain,immobilized papain increased the optimum temperature 30℃,optimum PH2.0 to the basic direction, The thermostability and thermotolerance of the immobilized papain are obviously increased compared to those of the soluble one.
Key words: papain; immobilization; egg white protein; glutaraldehyde

目录
1.序言‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥5
2.实验材料‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥5
2.1仪器及器材‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥5
2.2 实验试剂 ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥6
3.实验方法及结果‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥6
3.1实验测定原理 6
3.2固定化酶与溶液酶最适温度的比较 7
3.2.1 实验方法 7
3.2.1.1试剂组成‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥7
3.2.1.2木瓜蛋白酶的固定化‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥7
3.2.1.3木瓜蛋白酶溶液酶活力的检测‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥7
3.2.1.4固定化酶活力的定‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥8
3.2.2实验结果及分析‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥9
3.2.2.1 实验结果‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥9
3.2.2.2 结果分析‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥10
3. 3固定化酶与溶液酶最适PH的比较 10
3.3.1 实验方法 10
3.3.1.1试剂组成 ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥10
3.3.1.2木瓜蛋白酶的固定化‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥11
3.3.1.3木瓜蛋白酶溶液酶活力的检测‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥11
3.3.1.4固定化酶活力的定‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥11
3.3.2实验结果及分析 11
3.3.2.1 实验结果‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥11
3.3.2.2 结果分析‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥12
3. 4固定化酶与溶液酶热稳定性的比较 12
3.4.1试验方法 12
3.4.1.1试剂组成‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥12
3.4.1.2木瓜蛋白酶的固定化‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥12
3.4.1.3木瓜蛋白酶溶液酶活力的检测‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥13
3.4.1.4固定化酶活力的定‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥14
3.4.2实验结果及分析 14
3.4.2.1 实验结果‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥14
3.4.2.2 结果分析‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥15
3. 5固定化酶与溶液酶耐热性的比较 15
3.5.1试验方法 15
3.5.1.1试剂组成‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥15
3.5.1.2木瓜蛋白酶的固定化‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥15
3.5.1.3木瓜蛋白酶溶液酶活力的检测‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥15
3.5.1.4固定化酶活力的定‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥16
3.5.2实验结果及分析 16
3.5.2.1 实验结果‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥16
3.5.2.2 结果分析‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥16
4.讨论 17
5.结论 17
参考文献 18
致谢 19

1.序言
木瓜蛋白酶（Papain）简称木瓜酶，又称为木瓜酵素。木瓜蛋白酶由212个氨基酸残基组成，并含有3对二硫键，是一种含疏基(-SH)肽链的内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，具有较广泛的特异性[1]。它的三维结构是由两个不同的结构域所组成，两个结构域之间形成一个缝隙；缝隙内含有酶的活性位点，包括一个催化三联体，与胰凝乳蛋白酶中所含的相似。木瓜蛋白酶中的催化三联体由25位的半胱氨酸（Cys-25）、159位的组氨酸（His-159）和158位的天冬酰胺（Asn-158）这三个氨基酸所组成[2]。
木瓜蛋白酶是一种重要的生化产品，它已被广泛应用于食品、美容化妆品、医药保健品、日化品、饲料、皮革、纺织等多个行业，有效提高产品的质量和档次，降低生产成本。木瓜蛋白酶的固定化始于20世纪60年代初，但多数方法不是因为材料来源困难，就是因为试剂毒性较大而影响了其在工业上应用。Kamata[3]曾报道过廉价的卵清蛋白做载体来固定化胰蛋白酶和α-淀粉酶。但这种方法操作相对繁琐，必需先对卵清蛋白进行糖基化，再将糖基化后的载体与酶进行固定，并且糖基化后的载体容易溶解，从而导致固体化酶的回收率偏低。本文以此为基础，载体直接选用变性的卵清蛋白，结合传统的交联固定法，用戊二醛做交联剂，成功的固定了木瓜蛋白酶，简化了操作步骤。用卵清蛋白固定化的木瓜蛋白酶在耐热性、热稳定性、耐酸碱等方面都较溶液酶有明显提高。这为木瓜蛋白酶的固定和提供一种新的途径，为扩大其在工业中的应用提供了一定技术依据。
2.实验材料
2.1仪器及器材
1. UV-2100型 紫外分光光度仪
2. Sartorius 电子分析天平
3. 三温三孔水浴锅
4. HZQ-C型 空气浴震荡仪
5. 海尔4℃恒温冰箱
6. 移液枪
7. DNP-9052 型电热恒温培养箱
8. WG-71型 电热恒温鼓风干燥箱
9. PH 综合测试仪
10. 试管和试管架；烧杯；玻璃棒；量筒；漏斗；研钵；200ml离心管；150ml离心管；石英比色皿；移液枪枪头；
2.2 试剂
1. 木瓜蛋白酶（0.5-2units/mg）
2. 半胱氨酸
3. 乙二胺四乙酸 EDTA
4. 硫酸氢二钠（分析纯）
5. 磷酸二氢钠（分析纯）
6. 戊二醛25%（生化试剂）
7. 氢氧化钠（分析纯）
8. 干酪素（棕色瓶子保存）
9. 三氯乙酸 (TCA)
3 实验方法及结果
3.1实验测定原理
本试验采用以酪蛋白为底物的紫外分光光度法测定木瓜蛋白酶的活性。木瓜蛋白酶分解酪蛋白的产物为酪氨酸共轭双键，在280nm处，检测酪氨酸共轭双键的吸光系数，酶的单位定义为每分钟吸光值增加0.01所需的酶量。 对于木瓜蛋白酶的固定，则用变性的卵清蛋白直接作为载体, 结合传统的交联固定法, 用戊二醛作交联剂，形成共价键，成功地固定了木瓜蛋白酶,主要是基于经济效益和安全两个方面的考虑。首先，卵清蛋白体的获得及制备十分容易，且成本低。另外，在食品和医药的用用中，卵清蛋白载体无毒性问题，这是产品的安全性大大提高；戊二醛又最常用的交联剂之一，交联效果稳定，并且简化了操作步骤。因此，这种固定化木瓜蛋白酶的方法可取。
3.2 固定化酶溶液酶最适温度的比较
3.2.1 实验方法
3.2.1.1试剂组成
木瓜蛋白酶 1.6mg/ml
酪蛋白 5mg/ml
三氯乙酸 15%
戊二醛 5%
磷酸缓冲液 （0.2 mol/L的pH7.0的磷酸缓冲液中含30 mmol/L半胱氨酸和0.6 mmol/L EDTA,）
3.2.1.2木瓜蛋白酶的固定化
参考相关文献可知[4]，以卵清蛋白为载体固定化木瓜蛋白酶的最佳条件。取定量的鸡蛋清，按1∶3的比例加入蒸馏水，于100℃水浴搅拌加热使其变性成胶状，于电热恒温鼓风干燥箱烘干，研细，以此作为载体。取1g的载体，加入10mg的木瓜蛋白酶，随后加入pH6的磷酸缓冲液及5%戊二醛溶液，用电热恒温培养箱混匀，振荡20小时，过滤，将固定后的酶用pH6的磷酸缓冲液洗涤干净，冰箱备用。
3.2.1.3木瓜蛋白酶溶液酶活力的检测
称取0.16 g木瓜蛋白酶(0.5-2units/mg),溶于0.2 mol/L、pH7.0的磷酸缓冲液并定容至100 mL,过滤,制得1.6mg/ml的木瓜蛋白酶溶液,用比色法测定酶活力。在0.1 mL 1.6 mg/mL的木瓜蛋白酶溶液中加入0.9 mL磷酸缓冲液(0.2 mol/L的pH7.0的磷酸缓冲液中含30 mmol/L半胱氨酸和0.6 mmol/L EDTA,现配现用),分别于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃水浴恒温10 min,加入相应温度恒温预热的5 mg/mL的酪蛋白溶液1 mL(0.2 mol/L pH7.0的磷酸缓冲液配制), 相应温度下准确反应10 min,立即加入15%三氯乙酸(TCA)溶液3 mL终止反应,对照则先加TCA终止反应,再加5 mg/mL的酪蛋白溶液1 mL,其余与测定管相同。混合均匀后， 25℃下放静置5 min后,漏斗过滤,滤液于280 nm波长下测定光吸收值（操作过程见表1）

表1 木瓜蛋白酶溶液酶加样顺序
管号
0 （对照）
1 （样品）
2( 样品 )
酶液（ ml ）
0.1
0.1
0.1
激活剂（ ml ）
1.0
1.0
1.0
恒温预热 10 分钟
酪蛋白（ ml ）
0
1.0
1.0
恒温水浴 10 分钟
15%TCA （ ml ）
3.0
3.0
3.0
酪蛋白（ ml ）
1.0
0
0
摇匀，静置 10 分钟过滤
OD 280nm
0.000

3.2.1.4固定化酶活力的测定
在试管中加入1.0 mL 0.1 mol/L， pH7.0的磷酸盐缓冲溶液(含30m mol/L半胱氨酸和0.6mmol/L EDTA,)，分别于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃预热5 min，加入0.01g的固定化酶，随后加入1.0 mL 酪蛋白溶液。于相应温度水浴中震荡反应， 10 min后立即加入3 mL 15%的三氯乙酸溶液终止反应，混合均匀后，25℃下静置30 min，漏斗过滤， 280 nm处测定上清液的吸光度。（操作过程见表2）

表2 木瓜蛋白酶溶液酶加样顺序
管号
0 （对照）
1 （样品）
2( 样品 )
激活剂（ ml ）
1.0
1.0
1.0
恒温预热 5 分钟
固定化酶（g）
0.01
0.01
0.01
酪蛋白（ ml ）
0
1.0
1.0
恒温水浴 10 分钟
15%TCA （ ml ）
3.0
3.0
3.0
酪蛋白（ ml ）
1.0
0
0
摇匀，25℃静置 30 分钟过滤
OD 280nm
0.000

3.2.2实验结果及分析
3.2.2.1 实验结果
表3 不同温度下，固定化木瓜蛋白酶与其溶液酶活性
酶
组
温
度

溶液酶
固定化酶
第一组
第二组
第三组
平均值
第一组
第二组
第三组
平均值
30
0.011
0.009
0.012
0.011
0.009
0.008
0.010
0.009
40
0.050
0.047
0.047
0.048
0.012
0.012
0.010
0.012
50
0.067
0.067
0.065
0.065
0.023
0.025
0.024
0.024
60
0.103
0.101
0.102
0.102
0.031
0.033
0.032
0.032
70
0.085
0.088
0.086
0.086
0.041
0.044
0.040
0.042
80
0.083
0.085
0.084
0.084
0.070
0.090
0.080
0.080
90
0.064
0.064
0.063
0.063
0.098
0.097
0.096
0.097
100
0.020
0.023
0.022
0.022
0.089
0.087
0.086
0.088

根据三次检测的平均值，绘图如下（见图1）

固定化酶与游离酶最适温度的选择 图1
3.2.2.2 结果分析
检测结果如图1所示，可见在同一反应体系中，溶液酶的最适反应温度为60℃，固定化酶为90℃。固定化酶的最适反应温度提高了30℃，说明固定化酶的热稳定性好。
3.3 固定化酶与溶液酶最适PH的比较
3.3.1 实验方法
3.3.1.1试剂组成
木瓜蛋白酶 1.6mg/ml
酪蛋白 5mg/ml
三氯乙酸 15%
戊二醛 5%
磷酸缓冲液 （0.2 mol/L的pH6.0、pH7.0、pH8.0、pH9.0、pH10.0的磷酸缓冲液中含30 mmol/L半胱氨酸和0.6 mmol/L EDTA,）
3.3.1.2木瓜蛋白酶溶液酶活力的检测
称取0.16 g木瓜蛋白酶(0.5-2untis/mg),分别溶于0.2 mol/L、pH6.0、pH7.0、pH8.0、pH9.0、pH10.0的磷酸缓冲液并定容至100 mL,过滤,制得1.6mg/ml的木瓜蛋白酶溶液，用比色法测定酶活力。在0.1 mL 1.6 mg/mL的木瓜蛋白酶溶液中加入0.9 mL磷酸缓冲液(0.2 mol/L对应pH的磷酸缓冲液中含30 mmol/L半胱氨酸和0.6