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氯霉素（Chloramphenicol）ELISA检测试剂盒说明书

一、概要
氯霉素 （chloramphenicol, CAP）是应用广泛的抗菌素，曾对畜禽疾病控制和治疗起到了重要作用。但由于氯霉素存在严重的副作用，能引起人的再生障碍性贫血，粒细胞缺乏症等疾病，欧美等发达国家已相继禁止或严格禁止使用。
本试剂盒是应用ELISA技术研发的新一代药物残留检测产品，能最大限度地减少操作误差和工作强度。操作时间仅需1.5小时。
二、试验原理
本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，样本中残留的氯霉素和微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗氯霉素抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光值与其残留物氯霉素的含量成负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中氯霉素的含量。
三、适用范围
可定性、定量检测动物组织（肌肉、肝脏等）、尿液、血清、肠衣、牛奶、奶粉等样本中氯霉素的残留量。
四、 交叉反应率
氯霉素 ……………………………………100%；
琥珀氯霉素…………………………………92%；
氯霉素-葡萄糖苷酸 ………………………57%。
五、使用单位需自备的设备及试剂
设备：
┅┅微孔板酶标仪450nm/630nm
┅┅旋转蒸发仪/氮气吹干装置
┅┅均质器
┅┅振荡器
┅┅涡旋仪
┅┅离心机
┅┅天平：感量0.01g
┅┅刻度移液管：10ml
┅┅洗耳球
┅┅容量瓶：100ml、500ml
┅┅玻璃试管：10ml
┅┅聚苯乙烯离心管：10ml、15ml、50ml
┅┅微量移液器：单道 20ml～200ml、100ml～1000ml
多道 250ml
试剂：
┅┅乙酸乙酯（分析纯）
┅┅乙腈（分析纯）
┅┅正己烷（分析纯）
┅┅二水合亚硝基铁氰化钠（分析纯）（供奶样用）
┅┅七水合硫酸锌（分析纯）（供奶样用）
┅┅葡萄糖苷酸酶 (Merck,Art.No.4114)（供尿样本用）
┅┅醋酸钠（分析纯）（供尿样本用）
┅┅肝素钠（分析纯）（供血样本用）
┅┅醋酸（分析纯）（供尿样本用）
----去离子水
六、提供的材料与试剂
1、96孔酶标板×1块 （包被有偶联抗原）
2、标准液×6瓶：（2ml/瓶）
0ppb,0.025ppb,0.075ppb,0.225ppb,0.675ppb,2.025ppb
3、高浓度标准品：（2ml/瓶） 100ppb
4、酶标二抗………………………… 7ml
5、抗体工作液…………………………7ml
6、底物液 A液………………………… 7ml
7、底物液 B液 …………………………… 7ml
8、终 止 液……………………………7ml
9、20×浓缩洗涤液 ………………………40ml
10、2×浓缩复溶液 ………………50ml
七、溶液的配制
配液1: C液（供奶样专用）
0.36M 二水合亚硝基铁氰化钠（Na2Fe(CN)5·NO·2H2O）溶液
称取10.7g二水合亚硝基铁氰化钠加去离子水溶解定容至100ml。
配液2: D液（供奶样专用）
1M七水合硫酸锌（ZnSO4·7H2O）溶液
称取28.8g七水合硫酸锌加去离子水溶解定容至100ml 。
配液3: pH4.8 100mM醋酸钠溶液（供尿样本用）
称取 2.4g醋酸钠，加入1.2ml 醋酸，再加去离子水溶解定容至500ml
配液4:乙腈-水溶液
量取84ml无水乙腈加入到16ml去离子水中混匀
配液5: 复溶工作液
用去离子水将2×浓缩复溶液按1：1体积比进行稀释（1份2×浓缩复溶液+1份去离子水）用于提取样本的复溶，复溶工作液在4℃环境可保存一个月。
配液6: 洗涤工作液
用去离子水将20×浓缩洗涤液按1：19体积比进行稀释（1份20×浓缩洗涤液+19份去离子水）用于酶标板的洗涤，洗涤工作液在4℃环境可保存一个月。
八、样本前处理步骤
样本处理前须知
处理任何样本时，都必须注意：
（a）实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。
（b）实验之前须检查各种实验器具是否洁净，必须使用洁净实验器具，以避免污染干扰实验结果。
（c）处理样本的同时，做空白试剂对照，样本的测定结果减去空白试剂的测定结果为样本中氯霉素的实际残留量。
组织样本空白对照试剂的制备
┅┅取4ml乙酸乙酯在氮气流下完全干燥；
┅┅用1ml正己烷充分溶解；
┅┅加入1ml复溶液工作液（见配液5），强烈振荡1min，静置分层后去除上层正己烷相；
┅┅取100ml水相用于分析。
（d）未处理的样本冷冻保存。
（e）处理后的样本可在2-8℃避光保存24h。未加正己烷之前，吹干的样本保存效果更好。
（f）处理后的样本，如出现乳化现象，可在去除部分上层有机相，60℃水浴5～10min消除乳化后，再重复离心步骤。
（一）组织 (鸡肉/肝、猪肉/肝、虾、鱼等)前处理方法
┅┅用均质器均质组织样本；
┅┅称取3.0±0.05g均质物至50ml聚苯乙烯离心管中，加入6ml乙酸乙酯，用振荡器振荡10min，3000g以上，室温（20-25℃）离心10min；
┅┅移取4ml上层有机相（约相当于2g的样本）至10ml干净的玻璃试管中，于50～60℃水浴氮气流下吹干；
┅┅加入1ml正己烷，用涡旋仪涡动30s，再加1ml复溶工作液（见配液5），用涡旋仪涡动1min， 3000g以上，室温（20-25℃）离心15min；
┅┅除去上层有机相，取下层100ull用于分析。
注：在检测动物肝脏样品时, 加入1ml正己烷溶解干燥的残留物，再加1ml复溶工作液后，只需振荡10s，离心后取下层即可分析；在检测高脂肪样本时正己烷用量可加大2ml－3ml。
（二）鸡血前处理方法
┅┅用加有肝素钠（20-30单位/ml血）的离心管采集鸡血样本（建议采血注射器也用肝素钠润洗），血样本室温静置
1h，待析出血浆后，3000g以上，15℃离心10min；
┅┅取1ml血浆至10ml聚苯乙烯离心管中，加2ml乙酸乙酯振荡1min；
┅┅室温（20-25℃）下静置待水相与有机相完全分层或3000g以上，室温（20-25℃）离心5min；
┅┅移取上层的有机相至15ml干净的玻璃试管中，于50～60℃氮气流下吹干；
┅┅干燥的残留物加入1ml复溶工作液（见配液5），用涡旋仪涡动2min溶解干燥的残留物；
┅┅取100ml用于分析。
（三） 尿液前处理方法
┅┅将尿液于3000g以上，室温（20-25℃）离心5min，直至尿液样本清亮；
┅┅移取2ml清亮尿液样本至50ml聚苯乙烯离心管中，加0.5ml pH4.8 100mM醋酸钠缓冲液（见配液3）混合；
┅┅加40ml葡萄糖苷酸酶 (Merck,Art.No.4114)至稀释的尿液样本中，置37℃水解至少2h（或过夜），取出室温（20-25℃）放置；
┅┅该溶液恢复至室温（20-25℃）后加入8ml乙酸乙酯混合1min；
┅┅3000g以上，室温（20-25℃）离心10min，取出4ml上层液体至10ml干燥的玻璃试管中，于50～60℃氮气流下吹干；
┅┅加入1ml复溶工作液（见配液5），涡动2min溶解干燥的残留物；
┅┅取100ml 用于分析。
（四）肠衣前处理方法
┅┅用均质器均质样本
注：干样本需剪碎（长度不超5mm）后再均质，湿样本需用去离子水漂洗20min以上(去除表面的盐份)，沥干后再进行均质；
┅┅称取1.0±0.05 g均质后的样本至50ml聚苯乙烯离心管
中，加入10ml乙酸乙酯，振荡10min，3000g以上，室温（20-25℃）离心10min；
┅┅取出5ml上层有机相（相当于0.5g的样本）至10ml干
净的玻璃试管中，于50～60℃水浴氮气流下吹干；
┅┅加入1 ml正己烷，涡动30s，再加0.5ml复溶工作液（见配液5）强烈振荡1min，3000g以上，室温（20-25℃）离心5min；
┅┅除去上层有机相，取下层100 ml用于分析。
（五）牛奶和奶粉前处理方法
（a）牛奶前处理方法
┅┅取牛奶样本，3000g以上，10℃离心10min，吸除上层脂肪；
┅┅取5ml去除脂肪牛奶样本至10ml聚苯乙烯离心管中，加入150mlC液（见配液1）出现沉淀，振荡15s，再加入150mlD液（见配液2），振荡1min充分混合；
┅┅3000g以上，15℃离心10min，移取上层液；
┅┅用复溶工作液（见配液5）以等体积稀释上层液（1份上层液+1份复溶工作液）；
┅┅取100ml用于分析。
注：如果离心后仍然浑浊，再重复脱脂过程。
（b）牛奶前处理方法
┅┅取牛奶样本,3000g以上,10℃离心10min,吸除上层脂肪；
┅┅取5ml去除脂肪牛奶样本至10ml聚苯乙烯离心管中，加入250mlC液（见配液1）和250mlD液（见配液2）充分混合，3000g以上，4～12℃离心10min。（如没有冷冻离心机，请预先将样本冷却到8℃再进行离心）；
┅┅移取2.2ml上层液（相当于2ml奶样）至另一个10ml聚苯乙烯离心管中，加入4ml乙酸乙酯上下振荡10min；
┅┅3000g以上，室温（20-25℃）离心10min ；
┅┅移取2ml乙酸乙酯上层有机相（相当于1ml奶样），至10ml干净的玻璃试管中，于50～60℃水浴氮气流下吹干；
┅┅加入0.5ml复溶工作液（见配液5），涡动2min溶解干燥的残留物；
┅┅取100ml用于分析。
由于阴性样本可能会产生背景干扰 （在某些情况下干扰数值在标准2到3之间），所以推荐0.15ppb作为阳性结果的cut off判断值。
奶粉前处理方法
┅┅称取2.0±0.05g奶粉至10ml聚苯乙烯离心管中，加入10ml去离子水，振荡溶解；
┅┅加1ml C液（见配液1）和1ml D液（见配液2）充分混合，3000g以上，4～12℃离心10min，（如没有冷冻离心机，请预先将样本冷却到8℃再进行离心）；
┅┅移取3.6ml上层液（相当于0.6g奶粉）至另一个10ml
聚苯乙烯离心管中，加入6ml乙酸乙酯上下振荡10min；
┅┅3000g以上，室温（20-25℃）离心10min；
┅┅移取4ml上层有机相（相当于0.4g奶粉），至10ml干净的玻璃试管中，于50～60℃水浴氮气流下吹干；
┅┅用0.4ml复溶工作液，涡动2min溶解干燥的残留物；
┅┅取100ml用于分析。
由于阴性样本可能会产生背景干扰 （在某些情况下干扰数值在标准2到3之间），所以推荐0.15ppb作为阳性结果的cut off判断值。
（六）蛋类前处理方法
┅┅用均质器低速均质鸡蛋样本，使得蛋清和蛋黄充分混合；
┅┅称取3.0±0.05g均质过的蛋样本至15ml聚苯乙烯离心管中，加9ml乙腈-水溶液（见配液4），振荡10min，3000g以上，15℃离心10min；
┅┅取3ml上层液与3ml蒸馏水充分混合，加入4.5ml乙酸乙酯，充分混合5min， 3000g以上，15℃离心10min；
┅┅移取上层有机相至10ml干净的玻璃试管中，于50～60℃水浴氮气流下吹干；
┅┅加入1ml正己烷，用涡旋仪涡动30s溶解干燥残留物，再加入2ml复溶工作液（见配液5），用涡旋仪充分混合1min，3000g以上，离心5min；
┅┅除去上层有机相，取下层100ml用于分析。
九、检测步骤
测定前应须知：
1、使用之前将所有试剂和需用板条的温度回升至室温（20-25℃）。
2、使用之后立即将所有试剂放回2-8℃。
3、在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，正确的洗板操作是ELISA测定程序中的要点。
4、在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖板膜封住微孔板。
操作步骤：
1、将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温（20-25℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。
2、取出需要数量的微孔板，将不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。
3、洗涤工作液在使用前也需回温。
4、编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。
5、加标准品/样本：加标准品/样本100ul到对应的微孔中，再加入酶工作液50ul/孔后，再加抗体工作液50ul/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应30min。
6、洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液（见配液6）250ml/孔，充分洗涤4－5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用未使用
过的枪头戳破）。
7、显色：加入底物液A液50ml/孔，再加底物液B液50ml/
孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境反应15min（见注意事项8）。
8、测定：加入终止液50ml/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测，请在5min内读完数据），测定每孔OD值。(若无酶标仪，则不加终止液用目测法可进行判定)。
十、 结果判定
结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，而定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与其所含氯霉素成负相关。
1、用样本的平均吸光度值与标准值比较即可得出其浓度范围(ppb)。假设样本1的吸光度值为0.410，样本2的吸光度值为0.920，标准液吸光度值分别是：0ppb为2.160；0.05ppb为1.701；0.15ppb为1.342；0.45ppb为0.869；1.35ppb为0.431；4.05ppb为0.183。则样本1的浓度范围是1.35ppb-4.05ppb再乘以其对应的稀释倍数即可得出样本中氯霉素残留的浓度范围； 样本2的浓度范围是0.15 ppb-0.45 ppb 再乘以其对应的稀释倍数即可得出样本中氯霉素残留的浓度范围。
2、定量分析
（1）百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度值的平均值（双孔）除以第一个标准（0标准）的吸光度值，再乘以100%，即
百分吸光度值（%）＝
B
×100%
B0
B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值
B0—0ppb标准溶液的平均吸光度值
（2）标准曲线的绘制与计算
以标准品百分吸光率为纵坐标，以氯霉素标准品浓度（ppb）的半对数为横坐标,绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中,从标准曲线上读出样本所对应的浓度,乘以其对应的稀释倍数即为样本中氯霉素实际残留量。
若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样本的准确、快速分析。（欢迎来电索取）
样本的稀释倍数：
组织样品稀释倍数：0.5
血清血浆样品稀释倍数：1
尿液样品稀释倍数：1
肠衣样品稀释倍数：1
（a）方法处理牛奶样品稀释倍数：2
（b）方法处理牛奶样品稀释倍数：0.5
奶粉样品稀释倍数：1
蛋类样品稀释倍数：2
十一、检测方法灵敏度、准确度、精密度
试剂盒灵敏度：0.05ppb
样本最低检测限：
肠衣……………………………………………0.1ppb
牛奶……………………………………………0.05ppb
尿液、血清、鸡蛋…………………………………0.1ppb
鸡肉/鸡肝、猪肉/猪肝、虾、鱼……………………0.05ppb
准确度：
鸡肉/鸡肝、猪肉/猪肝、虾、鱼 …………………… 85±10%
鸡蛋 ………………………………………………… 70±10%
牛奶、奶粉…………………………………………… 85±10%
肠衣 ………………………………………………… 70±15%
精密度：
试剂盒的变异系数均小于10%
十二、注意事项
1、室温低于20℃或试剂及样本没有回到室温（20-25℃）会导致所有标准的OD值偏低。
2、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。
3、每加一种试剂前需将其摇匀。
4、不要使用过了有效日期的试剂盒；也不要使用过了有效期的试剂盒中的任何试剂，掺杂使用过了有效期的试剂盒会引起灵敏度的降低；不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。
5、储存条件
保存试剂盒于2-8℃，不要冷冻，将不用的酶标板微孔板放进自封袋重新密封。标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。
6、试剂变质的迹象
发色试剂有任何颜色表明发色剂变质，应当弃之。0标准的吸光度（450/630nm）值小于0.5（A450nm<0.5 ）时，表示试剂可能变质。
7、在加入底物液A液和底物液B液后，一般显色时间为10-15min即可。若颜色较浅，可延长反应时间到20min（或更长），但不得超过25min。反之，则减短反应时间。
8、该试剂盒最佳反应温度为25℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。
十三、贮藏条件及保存期
贮藏条件：保存试剂盒于2~8℃。
保存期：该产品有效期为6个月。