DB63_T278—1996(2020)野牦牛冷冻液精.pdf

ICS备案号：青海省地方标准DB63DB63DB63DB63DB63/T 2781996野牦牛（含 1/2 野血牦牛）冷冻精液1997-03-20 发布1997-06-20 实施青海省技术监督局青海省技术监督局发布发布发布发布DB63/T 2781996I目次前言.II1 范围.12 规格、质量.13 冷冻精液的检查方法：.14 冷冻精液的包装、标记、贮存、运输.2附录 A.3附录 B.5DB63/T 2781996II前言本标准自1997年8月1日实施。本标准的附录A、附录B均为标准的附录。本标准由青海省畜牧厅提出。本标准由青海省大通种牛场、青海省畜牧兽医总站负责起草。本标准主要起草人：李创业、戴海琦。本标准主要审稿人：杨荣珍。DB63/T 27819961野牦牛（含 1/2 野血牦牛）冷冻精液1范围本标准规定了野牦牛(包括野血牦牛)冷冻精液的规格、质量、检查方法及包装、标记己贮存、运输等。本标准适用于野牦牛、含12野血牦牛冷冻精液的制作。2规格、质量2.1剂型：细管、颗粒。2.2剂量：细管，中型 0.5 毫升；微型 0.25 毫升；颗粒，0.10.0l 毫升。2.3活力解冻后活力不低于 0.3(指呈直线前进运动的精子百分率为 30%)。精子复苏率(下限)为 50.0%。2.4每一剂量中呈直线前进运动的精子数(下限)2.4.1细管：每支不应少于 1000 万个。2.4.2颗粒：每粒不应少于 1000 万个。2.5解冻后的精子畸形率(上限为)20%。2.6解冻后的精子顶体完整率(下限)为 40%。2.7解冻后的精液无病原性微生物，每毫升精液中的细菌菌落数(上限)为 1000 个。2.8解冻后的精子存活时间在58贮存时下限为12小时，在20贮存时下限为6小时。野牦牛(含 1/2野血)冷冻精液必须符合上述各项指标，否则不得使用。3冷冻精液的检查方法：3.1活力检查3.1.1细管冻精投入到402温水中直接解冻，然后取一滴(0.40.5毫升)压片镜检。3.1.2颗粒冻精取一灭菌干燥的指形试管(或小安瓿瓶)注入2.9%二水柠檬酸钠液 1.62毫升，加热到402后快速投入冻精一粒(一次一粒，多于一粒分别解冻)不停摇动，待冻精融化到1/3或1/2时即从温水中取出，轻轻摇动至完全融化，取一滴压片镜检。3.1.3评定精子活力的显微镜载物台温度保持 3540，放大倍数以 150600 倍为宜。3.1.4每批冻精应随机取样两份，分别解冻检查，每个精液样品应观察三个以上的视野，并注意不同液层内的精子运动状态，进行全面综合评定。3.1.5检查次数，应在冷冻后的当时检查一次，合格者贮存，在长期贮存期间应定期抽样检查(一般为一个月)。冻精发放前再抽样检查。3.2密度检查3.2.1检查用具：以血球计数器为基准，如用光电比色计则须用血球计数器校正。DB63/T 278199623.2.2每头牛采出的精液应立即进行密度检查，以确定稀释比。一毫升稀释后的精液中最少要有 6 亿个活精子存在。3.3畸形率的检查取样精和解冻后精液样品各一小滴，分别按常规方法制成抹片，风干后用美兰或品红染色，置不低于 600 倍的高倍显微镜检查。检查精子总数不得少于 500 个，以求出所含畸形精子百分率。3.4解冻后精子顶体完整的检查3.4.1定期抽样检查。3.4.2采用姬姆萨染色法镜检，每个样品观察精子总数 500 个。3.5冻精细菌检查3.5.1定期抽样检查。3.5.2取 0.2 毫升解冻后的精液样品，放入血清琼脂平面上，在 37恒温箱中分别培养 24 小时或 48小时，统计出现的菌落数。3.6精子存活时间的检查3.6.1定期把解冻后的精液置于 58、20C 环境中贮存，分别每 48 小时，24 小时检查次和1B 寸检查一次，直到全部失去直线前进状态，统计出存活时间及活率。3.6.2细管冻精解冻后不再稀释。4冷冻精液的包装、标记、贮存、运输4.1包装4.1.1细管冻精经过检查后严密封闭，按公牛品种、个体、牛号放入液氮容器内贮存。4.1.2颗粒冻精用无菌纱布小袋盛装，每一袋分别以 54 或 104 粒为一个标准单位，放入液氮容器中贮存。4.2标记4.2.1每头公牛、每批冻精均应分 51l 包装，细管和盛颗粒冻精的盛器外面均注明种牛品种、牛号、制作日期和制作单位、数量及活力的标记。4.2.2野牦牛：冻精容器(袋)及标签颜色为白色，代号 YW。4.2.31/2 野血牦牛：冻精容器(袋)及标签颜色为红色，代号 YD。4.3贮存4.3.1在液氮容器中贮存时，容器内液氮必须浸没冻精。4.3.2定期检查液氮容器内的贮存状况，发现异常(如：容器表面呈水珠或结霜等)，立即将冻精按操作规程转移到其它完好容器内。4.3.3液氮容器在使用之前，应彻底检查和清理一次，清洗时先用中性洗涤剂擦洗，后用 4045温水反复冲洗几次，在室温下倒置 72 小时左右再充入液氮，长期贮存精液的容器应定期清理、洗涤。4.3.4取放冻精时提漏按号扣入定位槽内，提漏只准升到容器的颈下，严禁提到容器外，停留时间一次不得超过 10 秒钟。如转移冻精时，盛装冻精的提漏离开液氮面时间不得超过秒钟。4.3.5较大型贮精容器，应将冻精分类存放，登记清楚，以免个体问冻精混淆。4.4运输4.4.1移动贮精容器时，不许拖行，只能其外柄轻拿轻放，防止冲撞。4.4.2贮精(液氮)容器均应竖立放置，装车运输时，应对容器采取保护性措施，严防冲击倾倒。4.4.3运输冻精时，应有专人负责，办好接交手续，途中应及时检查和补充冷源。DB63/T 27819963附录A（标准的附录）冻精制作程序及使用方法A1采精。A.1.1公牛质量标准A.1.1.1用于制作冻精的野公牛，其体型、外貌、生产性能，均应合乎本品种牛标准的特、一级标准.在目前尚未建立国家种畜后裔测定站的情况下，采精公牛必须经部或有关上级部门审批，和省级科研单位严格把关。A.1.1.2公牛必须体质健壮，并须经法定兽医师和正式兽医检查部门定期检查，证明无传染病才能进站使用。如：牛肺疫、牛结核、牛副结核、牛布氏杆菌、牛白血病及传染性鼻气管炎、钩端螺旋体病、胎儿弧菌、阴道滴虫病等。A.1.2公牦牛的鲜精应符合下述质量标准，不具备任何一项者，均不得制作冻精。新鲜精液呈乳白色或微黄色。直线前进运动的精子(下限)为 60%。精子密度(下限)为 6 亿毫升。精子畸形率(上限)为 12%。A.1.3在牦牛配种季节(611月)，成年公牦牛基本每周采精两次，每次可连续排精23回，采精前按技术操作规程进行公牛有关部位的消毒及冲洗。A.2精液的稀释A.2.1稀释保护剂的配制A.2.1.1所采用的保护剂，必须使用新鲜的双重蒸馏水和卵黄，二级品以上的化学试剂。A.2.1.2所用器具必须达到“野牦牛(含12)冻精标准”，保持清洁无菌。A.2.1.3稀释保护剂的标准配方R112%蔗糖液75毫升；卵黄20 毫升；甘油5 毫升；青、链霉素各 10 万单位。R212%脱脂奶粉 82 毫升；卵黄10 毫升；甘油8 毫升；青、链霉素各 10 万单位。A.2.1.4稀释保护剂要现配现用或配后放入45的冰箱中备用。A.2.2稀释比例必须保证每一剂量(二种剂型)中解冻后所含直线前进运动的精子数的规定。A.3降温和平衡稀释后的精液，要在11.5小时内使精液温度逐步降到45，然后置于05冰箱平衡34小时。DB63/T 27819964A.4冷冻A.4.1制备冻精的操作室应符合“青海省牦公牛站牦(野)牛颗粒冻精制作暂行规则”的要求。A.4.2冻精的器具A.4.2.1细管冻精，采用细管冻精生产、分装线配套的器具进行。A.4.2.2颗粒冻精，采用，氟板(聚四氟乙稀)、铝板进行。以上各种用具，在制作冷冻精液时均应同液氮面保持一定(11.5cm)的距离。冷冻各类精液时，冻前样品均应混合：并检查冻前活力。细管精液：不论是采用聚乙烯粉、铜珠或超声波塑料热合，都必须严密封口。颗粒精液：滴冻时每毫升精液滴冻 101 粒，滴管应事先预冷，操作要干净、利落、准确，每冻完一头公牛精液后，必须更换滴管、氟(铝)板等用具。A.4.2.3不论何种剂型，在制作时必须防止精液温度回升。每冻完一批(头)将冻精浸泡在液氮中，计数、取样抽检、包装。A.5使用方法A.5.1解冻(已述)。A.5.2解冻液配制：称取 2.9 克二水柠檬酸钠，溶于 100 毫升的双蒸馏水中充分溶解，经过滤三次，蒸煮消毒 1020分钟，冷却后加青、链霉素各 5 万单位，置 45冰箱中贮存备用。A.5.3解冻后的使用时A.5.3.1颗粒冻精(上限)2小时。A.5.3.2细管冻精(上限)1小时。A.5.3.3如解冻后需要外运或使用延长上述时限时，均应在解冻后轻轻放 45冰箱或保温瓶中保存，但使用时限不得超过6小时。A.6输精A.6.1每头发情母牛每次使用一个剂量的解冻精液(细管，颗粒)，输精前必须进行活力检查，不合标准的，不得使用。A.6.2输精方法以采用直肠把握输精法输精。A.6.3输精器插入以子宫内为准，慢插，轻注、缓出、防止逆流。A.6.4每一情期输精2次，间隔时间为812小时。DB63/T 27819965附录B（标准的附录）评定受胎效果B.1对受胎的母牛可通过直肠触摸卵巢法检查，以确定是否受胎。或采用放射免疫测定(RIA)法做早期妊娠诊断，亦可根据最后一次输精后 3060 天不返情头数来确定。B.2计算情期受胎时，应注明是直检结果还是根据输精后若干天不返情统计的结果。B.3计算方法B.3.1平均情期受眙率=受胎牦母牛总数/受配情期总数100。B.3.2不返情率=不返情数/受配牦母牛头数100。B.3.3总受胎率=总受胎母牛数/授配母牛总数100。评定冻精受胎效果(技术水平)主要以第一次情期受胎率为标志，生产指标(生产水平)以总受胎率为依据。