酒精发酵大实验2013年学生版.doc

酒精发酵大实验
实验目的：1通过酒精发酵的实验，了解酒精生产的工艺过程；2加深温度、溶氧、pH等发酵因素对酒精产量的影响，进一步明白发酵参数对发酵的重要影响；3 发酵工艺的控制的参数来自于多次实验后的优化。
实验内容：通过四组不同工艺参数的设计，发酵所得酒精的收率的差异以及相关指标的检测，总结出酒精发酵的最佳工艺参数，并进行总结讨论。

第一部分 酒精生产的基本流程
一 糖化醪的制备
(一)原料的选择
凡是淀粉原料均可以用来生产酒精，考虑原料成本，生产上多用薯类为原料，其中以木薯淀粉含量高，产量也很高。其次是谷类原料，以用玉米原料居多。本实验采用玉米为实验材料。
(二)原料的蒸煮
目的：1在原料吸水后借助于高温高压的作用，使原料的淀粉细胞膜和植物组织破裂，亦即破坏原料中淀粉颗粒的外皮，使其内容物流出，呈溶解状态变成可溶性淀粉，这一过程叫糊化，原料经糊化后，再通过糖化剂作用即可变成可发酵性糖，为酒精发酵所利用。2 借助于高温高压的作用，把存在于原料中的大量微生物进行灭菌，以保证发酵过程不受原料中的杂菌污染，正常进行酒精发酵。
步骤一 淀粉原料的膨化与预煮
淀粉是亲水性胶体，吸水后能发生膨化现象，工艺上称为淀粉的膨化。产生膨化现象的原因是由于水分子渗入到淀粉颗粒的内部，使淀粉的巨大分子链扩张，因而体积增大，粘度增加。
步骤二 淀粉的糊化（蒸煮）
已经预煮好的淀粉料浆进入蒸煮锅后，在高温高压下，植物组织和细胞壁破裂，使淀粉完全释放出来，称之为糊化。糊化后的料浆称为糊化醪，又叫蒸煮醪。
(三)蒸煮醪的冷却
冷却的目的是为糖化酶提供酶解的合适温度。蒸煮醪冷却到60℃后很粘稠，低于55℃时，则变成凝胶体，不能与糖化剂混合。如果长时间缓慢冷却，则重新形成结晶体，此现象称之为“蒸煮醪老化”以至在糖化过程中，不再受糖化酶作用。为此，应急速冷却至62℃左右，并立即与糖化剂作用，以保证糖化醪的质量。
(四)淀粉的糖化
淀粉原料经过高温高压蒸煮后，淀粉糊化成溶解状态，必须在冷却后的蒸煮醪中加入一定量的糖化剂，利用糖化剂中的淀粉酶使溶解状态的淀粉转化成能被酵母菌利用的可发酵性糖，这一由淀粉转化为可发酵性糖的过程，叫做“糖化”。糖化后的蒸煮醪称为糖化醪。
(五)糖化醪的冷却
冷却到26-28℃后，立即使用。

二 酒母的制备
(一) 传统酒母的制备方法
1酒母用糖化醪的准备
同糖化醪的制备略作改变，料水比1：5；加糖化酶量为生产用糖化量的1.5倍，糖化时间2-3h，糖化结束后，调pH4.5-5.5后（0.05-0.1%的硫酸溶液），升温至85-90℃，消毒15-30分钟。冷却至27-30℃。
操作：在糖化过程中，用稀碘液检查糖化的程度（蓝色：30个以上的葡萄糖链；紫色：30-20个葡萄糖的链；红色：20-13葡萄糖的链；无色：7个以下的葡萄糖链）。
检测：要求还原糖的含量达8%以上。
注意：由于是分批实验，酒母用糖化醪制备好后，应当分装备用。

2 酒母的培养
在制备好的酒母用糖化醪中接种活性干酵母，加入量为每ml糖化醪100万（每克活性干酵母约140亿酵母）。28正负1℃，摇瓶培养8-12h。
指标：
（1）酒母耗糖率：35-40%为宜。
耗糖率=（接种前糖度-成熟时糖度）/接种前糖度×100
（2）酵母数：0.8-1亿/ml（血球计数法计数）。
（3）出芽率：20-30%（镜检视野下计算）。
（4）死亡率：1%以下（美蓝染色）。
（5）酒精度：3-4%（蒸馏测定）。
(二) 目前制作酒母的方法

称取活性酒精干酵母，按干酵母与活化液（葡萄糖液浓度3%，蛋白胨1%）1:25的比例将其复水活化，复水条件为水温度35℃，复水时间15分钟，然后在30℃活化1小时后即为发酵用酒母。（每班250ml活化液）
三 酒精发酵
(一)前发酵
酵母菌利用培养基中的溶解氧以及培养基成分繁殖，增加个体数量，同时产生少量酒精分。酵母菌的用量一般为原料量的0.1-0.15%的普通活性干酵母(优质活性干酵母，细胞含量超过200亿cfu/g，含水量小于6%的活性干酵母被称为高活性干酵母。普通的130亿cfu/g)。糖化醪的温度26-28℃。前发酵温度低于30℃，发酵时间约10h。
(二)主发酵
酵母细胞数已达1亿左右/ml。这时，醪液中的溶解氧基本消耗完毕，酵母便以无氧酵解的形式，将糖分转化为酒精和二氧化碳。这个阶段，酵母菌发酵产生大量的热量，应控制温度32-34℃，发酵时间约12h。
(三)后发酵
残存的淀粉和糊精继续被糖化剂糖化生成葡萄糖，但量少并非常缓慢。控制温度30-32℃，约40h。
整个发酵约60-72h。
(四) 放罐蒸馏
(五) 生产核算
计算淀粉出酒率。
原料利用率=酒精总量÷原料重量
注：酒精总量按96%（v/v）计。

第二部分 发酵条件的优化

(一)实验内容：酵母浓度、温度、pH值、溶解氧浓度对酒精发酵的影响。
(二)材料与方法
1 实验材料
菌种，安琪耐高温酒精活性干酵母
市售玉米粉
糖化酶、菲林氏液、10%NaOH、10%HCL、稀碘液、培养箱，摇床，蒸馏装置、抽滤装置、真空泵、pH精密试纸(pH3左右的和pH8左右的)、250ml量筒、500ml量杯、可调电炉、酒精计、温度计、糖度计，250 ml三角瓶、500ml三角瓶，水浴锅，电炉，玻棒（可用竹筷等代替）、250ml容量瓶、电炒锅、棉花、天平、大铝锅等。
2 实验方法
基本操作流程
(1) 糖化醪的制备
A膨化阶段—预煮
称取4000g玉米粉，按照1：5的比例加入40℃的热水 (先以0.5MH2SO4将水调pH至糖化时的要求4.0-4.5，并在蒸煮锅内预热到40℃后，停止加热)（实际生产料水比为1：2.5-3.0），搅拌并维持20分钟，使淀粉充分吸胀（吸水阶段）。随后，升温至70-75℃，搅拌并维持20分钟。
B糊化阶段--蒸煮醪
在70-75℃维持20min后，加热至沸腾并搅拌维持10分钟。
C 冷却
将蒸煮醪冷却至62℃为冷却醪(在蒸煮锅内自冷却)。
D 液化糖化—糖化醪
煮醪冷却至62℃后，加入糖化酶，边搅拌边糖化。糖化时间40分钟，温度不低于58℃(点动加热维持)。控制糖化率控制在47-56%。为加快糖化进程，加大糖化酶使用量到20000IU/克玉米粉。
注：糖化完全约需56h，糖化分前糖化和后糖化两个阶段。
E糖化醪的冷却
将糖化醪在蒸煮锅内搅拌冷却至26-28℃。
F 发酵
将冷却后的糖化醪先用1M的氢氧化钠调至pH4.5-5.5，按照下述设计方案进行，优选发酵方案。
3 工艺参数的优化
3.1 酵母浓度对发酵的影响（第1大组）
实验设计1 (正常)（0.8-1.0亿个/ml）；2 (过量). 2-2.5亿个/ml；3 (不足). 0.3-0.5亿个/ml。
仪器：培养箱。
实验小组：
第1小组（正常组），正常工艺操作下的实验（温度28℃、酸度pH值4.5-5.5）。取1个发酵罐（1200ml油膏缸）装入900ml糖化液（充满系数75%），加入复水活化后的酵母菌20ml，混匀后，发酵72h后，测量总体积、酒精度得率及残糖率。
第2小组（酵母数加倍组），在接种酵母后，正常工艺操作下的实验（温度25℃、酸度pH值5.0-5.3—糖化后不再调整）。取1个发酵罐（1200ml油膏缸）装入900ml糖化液（充满系数75%），加入复水活化后的酵母菌40ml，混匀后，发酵72h后，测量总体积、酒精度得率及残糖率。
第3小组（酵母数减倍组），正常工艺操作下的实验（温度25℃、酸度pH值5.0-5.3—糖化后不再调整）。取1个发酵罐（1200ml油膏缸）装入900ml糖化液（充满系数75%），加入复水活化后的酵母菌10ml，混匀后，发酵72h后，测量总体积、酒精度得率及残糖率。
3.2不同温度对发酵的影响（第2大组）
实验设计：1 正常；2 高温36℃；3 低温20℃
仪器：三个摇床或培养箱，控制不同的发酵温度。
实验小组：
第1小组（正常组），用3.1之第1小组数据。
第2小组（高温组），取1个发酵罐（1200ml油膏缸）装入900ml糖化液（充满系数75%），加入复水活化后的酵母菌20ml，混匀后，在36℃高温下发酵72h后，测量总体积、酒精度得率及残糖率。
第3小组（低温组），取1个发酵罐（1200ml油膏缸）装入900ml糖化液（充满系数75%），加入复水活化后的酵母菌20ml，混匀后，在20℃低温下发酵72h后，测量总体积、酒精度得率及残糖率。
3.3不同pH值对发酵的影响（第3大组）
实验设计：1 正常；2 pH8.0；3 pH3.0
仪器：三个摇床或培养箱，控制不同的发酵pH。
实验小组：
第1小组（正常组），用3.1之第1小组数据。
第2小组（高碱性组），取1个发酵罐（1200ml油膏缸）装入900ml糖化液（充满系数75%）后，以2N NaOH调至pH8.0，然后加入复水活化后的酵母菌20ml，混匀后，在正常温度下（28℃）发酵72h后，测量总体积、酒精度得率及残糖率。
第3小组（高酸组），取1个发酵罐（1200ml油膏缸）装入900ml糖化液（充满系数75%）后，以2N H2SO4调至pH3.0，然后加入复水活化后的酵母菌20ml，混匀后，在正常温度下（28℃）发酵72h后，测量总体积、酒精度得率及残糖率。
3.4不同溶氧对发酵的影响（第4大组）
实验设计1 正常；260rpm摇瓶；3 120rpm摇瓶
仪器：三个摇床或培养箱，控制不同的溶氧。
实验小组：
第1小组，用3.1之第1小组数据。
第2小组（高通气组），取1个发酵罐（500ml三角瓶）装入400ml糖化液（充满系数80%），加入复水活化后的酵母菌10ml，混匀后，在28℃、转速为260rpm下发酵72h后，测量总体积、酒精度得率及残糖率。
第3小组（低通气组），取1个发酵罐（500ml三角瓶）装入400ml糖化液（充满系数80%），加入复水活化后的酵母菌10ml，混匀后，在28℃、转速为120rpm下发酵72h后，测量总体积、酒精度得率及残糖率。

（三） 结果与分析（实验报告）
1 观察发酵过程中，发酵容器内酒味大小、鼓泡大小随时间变化的情况并深入分析现象与实验内容间的关系
2 比较发酵结束时原料出酒率并深入分析出酒率与实验内容间的关系。
3残糖、残淀的测试并深入分析它们与实验内容间的关系。
第三部分 酒精发酵分析
一 原料中纯淀粉的测定
1试样水解
准确称取试样3-5克，置入250ml的三角瓶中，加100ml水，于沸水浴中糊化1h 。冷却至65℃，加20ml酶液，于55-60℃之间保温糖化2h。取出，加热煮沸30分钟，冷却之65℃，再加20ml 酶液，于55-60℃之间保温糖化至碘液指示剂不呈蓝色为止（实验方法：将碘液指示剂盛于白瓷板空穴中，取一滴糖化液进行试验）。乘热用滤纸过滤，滤液用250ml容量瓶接收，用水充分洗涤残渣，冷却后用水定容至刻度。
吸取100ml滤液，置入250ml三角瓶中，加11ml 20%盐酸溶液，于沸水浴中回流1h。取出，立即冷却，用20%氢氧化钠溶液中和至中性或微酸性，转入250ml容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，为供试糖液。以糖度计测试。
另取100ml酶液，置入250ml三角瓶中，加11ml 20%盐酸溶液，于沸水浴中回流1h。取出，立即冷却，用20%氢氧化钠溶液中和至中性或微酸性，转入250ml容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，为空白液。以糖度计测试。
2 斐林试剂的校正
吸取斐林试剂甲、乙液各5ml，置入250ml三角瓶中，加20ml水，并从滴定管中加入约24ml 0.2% 标准葡萄糖溶液（其量应控制在后滴定时消耗0.2% 标准葡萄糖溶液在1ml以内），摇匀，于电炉上加热至沸，并保持微沸2min。加1滴1%次甲基蓝溶液，继续用0.2%标准葡萄糖溶液滴定至蓝色消失，此滴定操作需在1分钟内完成。总耗糖量为V ml。
3 定糖
吸取斐林试剂甲、乙液各5ml，置入250ml三角瓶中，加20ml水，并从滴定管中预先加入适量的水解糖溶液（其量应控制在后滴定时消耗水解糖溶液在1ml以内），摇匀，于电炉上加热至沸，并保持微沸2min。加1滴1%次甲基蓝溶液，继续用水解糖溶液滴定至蓝色消失，此滴定操作在1min中内完成。
4 计算
5 试剂
（1）酶液或粉剂
（2）稀碘液
称取1.3克碘，4克碘化钾，置入研钵中，加少量水研磨至完全溶解，用水稀释至100ml, 贮存于棕色瓶中。
（3）1%次甲基蓝
称取1克次甲基蓝，加100ml水
（4）0.2%标准葡萄糖溶液
准确称取2克无水葡萄糖（预先于100-105℃烘干），用水溶解，加5ml浓盐酸，用水定容至1000ml。
（5）20%氢氧化钠溶液
称取200克氢氧化钠定容至1000ml。
（6）20%盐酸溶液
量取20ml浓盐酸缓缓倒入80ml水中。
（7）斐林试剂
甲液：称取69.3克硫酸铜（CuSO4.5H2O）,用水溶解并稀释至1000ml，如有不容物，可用滤纸过滤。
乙液：称取346克酒石酸钾钠，用水溶解并稀释至1000ml。
（8）所需物品
100 ml棕色滴瓶2个（稀碘液、1%次甲基蓝），1000ml试剂瓶5个（20%盐酸、氢氧化钠以及斐林试剂甲乙液、0.2%标准葡萄糖溶液），1000ml容量瓶，5ml移液管2支，250ml三角瓶，50ml量筒，托盘天平，烘箱，0.1%的分析天平，250-500ml量筒，碱式滴定管、荚、铁架台、电炉，回流装置、循环冷却水引流装置、滤纸。

二 酒母用糖化醪总糖和还原糖的测定
总糖的测定在糖化完成后进行，直接用酶解液按总淀粉的测定方法用20%盐酸回流水解，用斐林试剂滴定（参见原料中纯淀粉的测定）。
酒母用糖化醪还原糖的测定是酒母制作过程中的重要工作，关系着酒母的质量。
1 原理
酒母用糖化醪还原糖的测定采用快速法。其反应与纯淀粉的测定相似，不同点为斐林试剂甲液中硫酸铜量较小，适用于含糖量较少的试样。另外，斐林试剂中加入亚铁氰化钾（黄血盐），使红色氧化亚铜沉淀生成可溶性的复盐，反应终点更明显。用糖度计测试。
2 试剂
（1）斐林试剂
甲液：称取35克硫酸铜（CuSO4.5H2O）, 0.05克次甲基蓝，用水溶解并稀释至1000ml，如有不容物，可用滤纸过滤。
乙液：称取117克酒石酸钾钠，126.4克氢氧化钠，9.4克亚铁氰化钾，用水溶解并稀释至1000ml。
（2）0.1%标准葡萄糖溶液
准确称取1克无水葡萄糖（预先于100-105℃烘干），用水溶解，加5ml浓盐酸，用水定容至1000ml。
3 测定步骤
（1）斐林试剂的标定
吸取斐林试剂甲、乙液各5ml，置入250ml三角瓶中，加10ml水，并从滴定管中预先加入约20ml 0.1%标准葡萄糖溶液（其量应控制在后滴定时消耗标准葡萄糖溶液在1ml以内），摇匀，于电炉上加热至沸，立即以4-5 s一滴的速度继续用0.1%标准葡萄糖溶液滴定至蓝色消失，此滴定操作在1min中内完成，总耗糖量V0 ml。
（2）定糖
预备实验：吸取斐林试剂甲、乙液各5ml，置入250ml三角瓶中，加V1 ml试样稀释液（含葡萄糖量约5-15 mg）及适量的0.1%标准葡萄糖溶液，摇匀，于电炉上加热至沸，立即以4-5 s一滴的速度继续用0.1%标准葡萄糖溶液滴定至蓝色消失，此滴定操作在1min中内完成，总耗糖量V2 ml。
正式试验：吸取斐林试剂甲、乙液各5ml，置入250ml三角瓶中，加V1 ml试样稀释液和（V2-1）ml的0.1%标准葡萄糖溶液，补加[（V0+10）-（V1+ V2）]ml水，摇匀，以下同标定操作，总耗糖量V ml。
4 计算
还原糖（以葡萄糖计%）=（V0-V）×C×n×1/ V1×100%
式中V0----斐林试剂的标定值（ml）
V-----斐林试剂的测定值（ml）
C----标准葡萄糖溶液浓度（g/ml）
n----试样稀释倍数
V1-----所取试样稀释液体积（ml）
5 所需物品
1000ml试剂瓶3个（斐林试剂甲乙液、0.1%标准葡萄糖溶液），1000ml容量瓶，碱式滴定管、荚、铁架台、电炉，5ml移液管2支，250ml三角瓶，50ml量筒，托盘天平，烘箱，0.1%的分析天平，250-500ml量筒。

三 酒母质量的检测
1 细胞体积数量的检测（载玻片直接计数法）
（1）摇动酒母液使其混合均匀，并用无菌水稀释到适当倍数，用无菌微量移液管取菌液0.01ml于载玻片上，并用无菌接种环均匀地涂布在1cm2的面积上。风干，固定，镜检。
（2）用物镜测微尺，测量显微镜观察时的视野直径，并以S=πr2公式，计算出视野面积。
（3）不断变化视野，共观察10个视野，计数每一视野中的酵母个数。以下公式计算每ml 菌液中的含菌量。
原菌液菌数（个/.ml）= 1cm2/1个视野的面积×视野中的平均菌数×100×稀释倍数
2 出芽率及死亡率的检测
摇动酒母液使其混合均匀，并用无菌水稀释到适当倍数，用无菌移液管或滴管取少量酒母液于载玻片上，加1滴0.05%美蓝溶液，盖片，镜检10个视野，求平均。
3 酒精含量的检测
取100ml酒母液于500ml蒸馏烧瓶中，加100ml自来水，接上冷凝器，缓火蒸馏，收集流出液100ml，用酒精计测量酒精度，并同时测量流出液的水温，查表可以得到酒精度。

四 发酵液的检测
1 残余发酵糖的检测
参见酒母用糖化醪总糖和还原糖的测定中的还原糖的测定相关内容（可用糖度计测量后代替）。
2 残余淀粉的检测
参见酒母用糖化醪总糖和还原糖的测定中的总糖的测定相关内容。
3 酒精度的检测
参见酒母质量的检测中酒精含量的检测方法（一份抽滤后的发酵液加等体积的自来水，收集大约相等量的蒸馏液，一般取100ml）。

五 糖化率的测定
取蒸煮冷却后的蒸煮醪15克，加水85ml，后面的操作参见原料中纯淀粉的测定相关内容（可用原料淀粉含量计算后代替）。
糖化后糖化醪还原糖的测定参见酒母用糖化醪总糖和还原糖的测定中还原糖的测定相关内容（可用糖度计测量后代替）。
糖化率的计算公式：
糖化率%=（蒸煮醪总糖-糖化醪还原糖）/蒸煮醪总糖×100

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