低强度微波辐射对晶状体上皮细胞和晶状体的损伤及对相关调控基因表达的影响.pdf

浙江大学博士学位论文低强度微波辐射对晶状体上皮细胞和晶状体的损伤及对相关调控基因表达的影响姓名：王凯军申请学位级别：博士专业：眼科学指导教师：姚克20040501竺兰查!竺竺苎主苎垒垒苎竺!曼R L E C sW S PU S PA S PS PW I PE BA P lP C DS A RP K CI E G sD M S OP B SS D SM E MA A HP IE D T A缩略语A b b r e v i a t i o nR a b b i tJ|e n sE p i t h e l i a lC e l lsW 【t e rS o lL i b l eP F OL e inL t e aS 0 1u b l eP r oL e i nA Ik a liS o l u b l eP r o t e inS o n iC a t e dP r o t e i nW a t e F i n s o l u b l eP F O t e i nA c tiv a t o rP r o t e i nP r o t e inK in a s eCD i m“h v】S u l l、O X i d eP h o s p h a t e-B u f f。e r e dS a lf l q eS o d iu mD o d e c y lS u l f a t eM i n i m u mE s s e nL i n lM e d i u mA r t i f i C i a lA q u o u sH u m o rP r o p i d i u mI o d i d eD is o d i 1 1 1 1E t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t a t e兔晶状体上皮细胞水溶性蛋白脲溶性蛋白碱溶性蛋白超声溶性蛋白水不溶性蛋白溴乙锭激活剂蛋白一1程序性细胞死亡比吸收率蛋白激酶c早期快反应基因二甲基亚砜磷酸缓冲盐溶液十二烷基硫酸钠伊格尔培养基人工房水碘化丙啶乙二胺四乙酸晰江上学眼科学博士学啦论文J I f 宪搞姜煳年j 1 1g论文摘要中文摘要低强度微波辐射对晶状体上皮细胞和晶状体的损伤第一部分及对相关调控基因表达的影响浙江大学医学院眼科学博士研究生王凯军导师姚克教授低强度微波辐射阻断晶状体上皮细胞周期及对相关调控基因表达的影响【目的】柃测不同剂量微波辐射对兔晶状体上皮细胞(r t b b h】c nse p i t h u Ii 1 1。u IIs队x)增殖活性及细胞周期的影响，并测定微波辐射后细胞周期调控基冈恺I”、r 2 7“和c m y c 表达量的改变。切步探讨体外培养的兔晶状体上皮细胞对微波辐射损伤的耐受剂量，以及辐射损伤的分了机制。【方法】应H=|频率2 4 5 0 M I t z，功率密度分别为0 1 0 m W c m：、0 2 5m W c m：、0 5 0m w c m，、I 0 0m W c m：、2 0 0m W c m 一的微波连续辐照体外培养的R L E C s8 h，分别J；=|相差显微镜和：染色观察辐射后细胞形态学的改变：四唑盐(M T T)比色法测定细胞增殖活性：I，【荧光染色后_ I j 流式细胞仪检测微波辐射对细胞周期各个时相的影响；W。sL c r n 印迹-I-山晰汪土学摹科学博士学位论文研竟摘垂删年j 一岳法检测2 0 0m W c m 微波辐照4 h、6 h 和8 h 后P 2 l”。、P 2 7“。和c m y c 基因表达量的改变。盯一P C R 法检测P 2l”、P 2 7“”。m R N A 的表达。【结果】高于0 5 0m W c m：的微波连续辐射8 h，可降低细胞增殖活性：用相差显微镜观察发现微波辐射日，引起l 扎E C s 肿胀和聚集，甚至出现细胞幽缩和脱壁现象：同时高于0 5 0m W c m。的微波辐射町抑制细胞D N A 合成(G-期细胞百分比分别为7 1 9 5 21 2、7 5 6 8 3 3 5、8 2 4 0 8 6 8，高于对照组6 i 6 8 5 7 6，差异有显著性(1 0 0 5 或I 0 0 1)：功率密度为0 I O、0 2 5m W c m 的微波辐射组对细胞增殖活性和细胞周期无影响，与对照组比差异无显著性(D o 0 5)：2 O O m W c m：微波辐照后1 2 7“”表达水平明显升高，辐照4 h、6 h、8 h 后的表达量分别是对照组的i 6 9 0l j、2 1 4 0 5 l 和2 3 2 0 3 0 倍，差异有显著性(尼0 叭)，而c m y c 表达水甲在辐射后下降，辐射4 h、6 h、8 h 后的表达量分别是对照组的0 5 0 0 1 9、0：j 0 1 l 和0 1，I o 0 4 倍，差异有显著性(I O 0 5)；I 2 l“、P 2 Y“m K m 的表达在辐射前后均无明显改变，与对照组比较差异无显著性意义(【)0 5)。【结论】l、功率密度高于0 5 0m W c m?的微波辐射可引起扎E C s 产生形态学改变，并阻断细胞增殖周期，使细胞停滞于G G。期，这种损伤对晶状体的生长发育及维持其正常生理功能具有潜在的危害性。2、低强度微波辐射阻断晶状体上皮细胞增殖周期可能通过分别调节P 2 7“”。和c m y c这两个调控细胞周期转换的基因而实现的，对细胞周期另一重要的调控基因P 2 1”1 的表达不影响。：、微波辐射对细胞周期(；S 限制点重要调控因子P 2 7“”1 的调节可能为转录后调节，主要通过调节P 2 7“”。转录后的蛋白水平起作用，而对其m R N A 的表达不影响。【关键词】微波；晶状体；上皮细胞：细胞周期；基因表达：P 2 7“”；P 21”：c m y c2-晰江太学簟科学博士学位论文研竟摘要嬲年j 鼻后第二部分低强度微波辐射对体外培养晶状体的损伤及其细胞内信号传导机制【目的】观察低强度微波辐射对体外培养晶状体的损伤，并检测微波辐射后不同时间对细胞内信号传导因子l K C 一“、c f o s 和c j u n 表达的影响进一步探讨低强度微波辐射对晶状体的损伤及其分了机制。【方法】采州兔晶状体体外培养的方法。应用频率2 4 5 0 M H z，功率密度分别为0 2,5m W c m、0 5 0m W c m。、1 0 0m W c m、2 0 0m W c m：、5 O O m W c m：的微波连续辐照8 h，观察晶状体混浊程度并测定晶状体湿重的改变：F o li n 一酚法检测晶状体中可溶性蚩白和各种不可溶性蛋白禽量的变化，十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶(s D s P A G E)电泳和考马氏亮蓝染色观察可溶性蛋白条带的分予量改变：撕取品状体前囊膜，相差显微镜及I I o e c h s t 3 3 2 5 8 染色后观察微波辐射对品状体上皮细胞形态学的影响：最后心瑚W e s L e r n 印逊往检测2 0 0 删c 莳微波辐照2 h、4 h、6 h 和8 h 后对细胞内信号传导|天|了P K C 一“、c l O S 和c j L l n 表达的影响。【结果】随着微波辐射强度的增加晶状体的透明度逐渐下降经过5 o()m W c m。微波连续辐射8 h 后的晶状体出现了明显的皮质混浊：2 0 0m W cm-和5 0 0m W c m：微波辐射组与对照组比较晶状体水化程度明显增加(尺0 0 5)：微波辐射强度高于1()om W c m：时晶状体中可溶性蛋白占晶体总蛋白的比例开始降低，而水不溶性蛋白特别是脲溶性蛋白所占比例上升：考马氏亮蓝染色结果显示随着微波辐射强度的增加，晶状体可溶性蛋白中小分子量蛋白质含量减少，而大分子量蛋白含量逐渐增多，当微-3 妇晰江土学t 科学博士学位论文唧竞摘要蝴年j g波辐射强度为2 0 0、5 O O m W c m：时改变最为明显。微波辎射可引起晶状体前囊上皮细胞产生明显形态学改变，使细胞间隙增宽排列紊乱，l o e c h s t 3 3 2,5 8 染色显示细胞染色质浓缩，可见浓染致密的颗粒状荧光，呈现出凋亡细胞核的幽缩形态：2 O O m W c m：微波辐照后P K C a 逐渐由胞浆转位到胞膜细胞浆内P K C n 表达量降低，而细胞膜上P K C n 表达量升高，同时c l o s 和c 一，h,n 的表达量也在辐射后升高，在2 h、4 h、6 h 和8 h 后分别为对照组的1 7 I()6 I、2 6 0 0 7 9、2 4 0 I 2 6、I 9 4 0 3 9 倍和1 1 8 0 0 8、J 1 9 0 1 6、I h I0 2,5、I 3 8 0 2,1 倍，差异育显著性(P O 0 5 或尺O 0 1)。【结论】、高于2 0 0m W c m：的微波连续辐射8 h 可引起体外培养晶状体的水化程度增加并使晶状体出现明显的皮质混浊。2、当微波辐射强度高于I 0 0m W c m。时即可导致晶状体中可溶性蛋白和不溶性蛋白比例改变，在不溶性蛋白中，以脲溶性蛋白比例的增加最为明显，这种甲衡的改变破坏了晶状体的透明性和折光性。：、微波辐射口J 能通过激活P K c n，将辐射刺激信号传入细胞内，进一步引起早期快反应基冈c 1 1 0 s 和c j u n 的快速表达，诱发一系列的生物学反应，对细胞和晶状体产生损伤。【关键词】微波：晶状体：上皮细胞：信号传导：基因表达：P K C 一“：c r o s；c 一 u n4 晰江土学覃科学博士学位论文J I f 宪嫡要删年j gA B S T R A C TE f f e c t so fl o wp o w e rm i c r o w a v er a d i a t i o no nc u l t u r e dr a b b i tl e n s，l e n se p i t h e l i a lc e l l sa n dr e l a t e dg e n ee x p r e s s i o nD e p a r t m e n to fO p h t h a l m o l o g y，M e d i c a lS c h o o lo fZ h e j i a n gU n i v e r s i t yS p e c i a l i t yO p h t h a l m o l o g yP o s t g r a d u a t eK a i j u nW a n gS u p e r v i s o rP r o f K eY a oI n c r e a s e da p p l i c a t i o n so fe l e c t r o m a g n e t i cf i e l d sa r eo fg r e a tc o n c e r nt op u b l i ch e a l t h T h ec h a r a c t e ro ft i l en a t u r a le l e c t r o m a g n e t i cf i e l dh a sb e e na l t e r e ds i g n i f i c a n t l yd u et ot e c h n o l o g i c a lp r o g r e s sa n dn u n l e r o u sm a n m a d es o u r c e ss u c ha si n d u s t r y，t r a f f i c，m e d i c i n e r a d i o t e t e v i s i o n，m i c r o w a v e s，R T Va p p a r a t u s e se t c T h e s es o u r c e so fn o n i o n i z i n gr a d i a t i o nc a u s ea t m o s p h e r i cp o l l u t i o ns i m i l a rt ot i l ep o l l u t i o nf r o mv a r i o u si n d u s t r i a ls o u r c e s T i l e l e n so ft i l ee y ei sd e r i v e df r o me c t o d e r ma n dg r o w st h r o u g h o u tl i f e T h i st r a n s p a r e n to r g a nc o n s i s t so fas i n g l e，c u b o i d a ll a y e ro fe p i t h e l i a lc e l l so nt h ea n t e r i o rs u r f a c ea n de l o n g a t e d，t e r m i n a l l yd i f f e r e n t i a t e de p i t h e l i a lc e l l s，o rf i b e rc e l l s，i nt h ei n t e r i o r T h el e n se p i t h e l i a ll a y e ri sc r i t i c a lf o rl e n sp h y s i o l o g y，a n di n s u l t st ot h i sl a y e rc a np l a yar o l ei nl e n sp a t h o l o g y M a n ys t u d i e sh a v ef o u n dt h a td a m a g et ot h ee p i t h e l i u mc a nb ea l le a r l ye v e n ti nc a t a r a c t o g e n e s i s，H o w e v e r，n os y s t e m a t i cs t u d i e sh a v ei n v e s t i g a t e dt i l eb i o l o g i c a le f f e c t so fl o wp o w e rm i c r o w a v er a d i a t i o no nl e n se p i t h e l i a lc e l l s I ti sw e l lr e c o g n i z e dt h a tm i c r o w a v e sa f f e c tt h eb i o l o g i c a lf u n c t i o n so fl i v i n go r g a n i s m sa tb o t ht h ec e l l u l a ra n dm o l e c u l a rl e v e l sa n dc a nl e a dt ot h ea p p e a r a n c eo fg e n o t o x i ce f f e c t s H o w e v e r，t h em e c h a n i s m sb yw h i c he l e c t r o m a g n e t i cf i e l d se x e r tt h e i rb i o l o g i c a le f f e c t sr e m a i np o o r l yc h a r a c t e r i z e d S p e c i a la t t e n t i o nh a sb e e ng i v e nt o一5-四晰江土学摹科学博士学位论文研竟稿要蝴年5 一岳i n v e s t i g a t i n gt h ee f f e c t so fl o wp o w e rm i c r o w a v er a d i a t i o n(1 0m W c m?)o nc e l lg r o w t h c e l lc y c l ep r o g r e s s i o na n dD N As y n t h e s i s I nh u m a nl y m p h o c y t e s，4 5 0 M H zf i e l d sa ta r o u n d1 0 m W c m?a f f e c t e dc A M P-i n d e p e n d e n tp r o t e i nk i n a s ea c t i v i t y T h ee x p o s u r eo fg l i o m ac e l l so rl y m p h o c y t e st o2 7o r2 4 5 0 M H zf i e l d sc a u s e dd o s ed e p e n d e n te f f e c t so np r o l i f e r a t i o n D N As y u t h e s i sw a si n c r e a s e di ng l i o m ac e l l sa n ds u p p r e s s e di nl y m p h o c y t e s C e l lc y c l ea l t e r a t i o n si nC H Oc e l l sw e r ei n d u c e db ya2 7 M H ze x p o s u r e T h em a j o ra l t e r a t i o nw a sa ni u c r e a s ei nt h en u m b e ro fc e l l si nG 0 G l a n dad e c r e a s eo ft h o s ei nMp h a s e C y t o g e n e t i cd a m a g eh a sb e e nr e p o r t e di nh u m a nl y m p h o c y t e sf r o mb l o o ds a m p l e se x p o s e dt oa9 4 5 M H zf i e l d V e r yl o wp o w e rp u l s e de x p o s u r eo fh u m a na m n i o nc e l l sa t9 6 0 M H zh a v er e c e n t l yb e e nr e p o r t e dt oi n d u c ead e c r e a s ei nc e l lg r o w t hr a t ew i t hi n c r e a s e de x p o s u r et i m e I no u rp r e v i o u ss t u d i e s，w eh a v ed e m o n s t r a t e dt h a tl o wp o w e rm i c r o w a v er a d i a t i o nc a ui n d u c ei r r e v e r s i b l ed a m a g et or a b b i tl e n se p i t h e l i a lc e l l s(R L E C s)i nv i v o T h ea i mo ft h i ss t u d yw a st od e t e r m i n et h ee f f e c to fm i c r o w a v er a d i a t i o no np r i m a r yc u l t u r e dR L E C sa n dl e n s a n dr e l a t e ds i g n a lt r a n s d u c t i o nm e c h a n i s m s P a r tIL o wp o w e rm i c r o w a v er a d i a t i o ni n h i b i t st h ep r o l i f e r a t i o no fr a b b i tl e n se p i t h e l i a lc e l l sb yu p r e g u l a t i n gP 2 7 K i p e x p r e s s i o no b j e e t i v eT h eg o a lo f t h i ss t u d yw a st oe x a m i n et h ee f f e c t so f l o wp o w e rm i c r o w a v er a d i a t i o n(1 0m W c m!)0 1 1t h ep r o l i f e r a t i o no f c u l t u r e dr a b b i tl e n se p i t h e l i a lc e l l s(R L E C s)M e t h o d sC e l lc u l t u r e：T h er a b b i t su s e di nt h i si n v e s t i g a t i o nw e r eh a n d l e di nc o m p l i a n c ew i t ht h e“G u i d i n gP r i n c i p l e si nt h eC a r ea n dU s eo fA n i m a l s”(D H E WP u b l i c a t i o n，N I H8 6 2 3)a n da c c o r d i n gt ot h et e n e t so ft h eA R V OS t a t e m e n tf o rt h eU s eo fA n i m a l si nO p h t h a l m i ca n dV i s i o nR e s e a r c h I2-w e e k-o l dr a b b i t sw e i g h i n gIk gt 01 5 k gw e r ek i l l e db yC 0 2i n h a l a t i o n-6-K 1晰江土学簟科学博士学位论文研宽搐耍删年j 鼻彰T h ee n t i r ee y ew a sr e m o v e da n dd i p p e di n7 5 e t h a n o lf o r3 0s e c o n d s、t h e ni tw a so p e n e df r o mt h ep o s t e r i o rs e g m e n t T h ed i s s e c t i o np r o c e d u r ew a sp e r f o r m e dw i t hs t e r i l ei n s t r u l n e n t su n d e ral a m i n a rf l o wh o o d L e n s e sw e r ed i s s e c t e dc a r e f u l l yb yap o s t e r i o ra p p r o a c ha n dw a s h e dt h r e et i m e si np h o s p h a t e-b u f f e r e ds a l i n et or e m o v ea t t a c h e dp i g m e n t sa n dv i t r e o u s T h ec a p s u l ee p i t h e l i u mw a sd i s s e c t e db yf i n ef o r c e p sa n dp l a c e di na3 5 一m m：c u l t u r ed i s ha d h e r i n gt ot h ep l a s t i cS o m ed r o p so fc u l t u r em e d i u mw e r ea p p l i e dt ot h ee p i t h e l i u ms p e c i m e n st op r e v e n td r y i n g，a n dt h ed i s h e sw e r ep u ti nah u m i d i f i e dC O,i n c u b a t o r(5 C O!3 7)f o r6h o u r st oa l l o wf i r ma t t a c h m e n to f t h ec a p s u l e s A n o t h e r2I n lo fc u l t u r em e d i u mw a st h e na d d e d a n dt h ec a p s u l e sw e r el e f tf o r3o r4d a y sb e f o r et h ef i r s tt r y p s i n i z a t i o na n ds u b c u l t u r i n g T h em e d i u m，w h i c hw a sc h a n g e de v e r y2d a y s w a sm o d i f i e dE a g l e sm e d i u m(M E M，G i b c o B R L)w i t h1 0 f e t a lb o v i n es e r u m(F B S)，s u p p l e m e n t e dw i t h2 r a ML-g l u t a m i n e，1 0 0 U 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c o p e(N i k o n J a p a n l-7 幽晰江土学孽科学博士学位论文一唧宪镇要删年j 一岳a u d H Es t a 1 M T Ta s s a y：T oe x a m i n ec e l lv i a b i l i t y，a nM T Ta s s a yw a su s e d B r i e f l y，R L E C sw e r es e e d e di n9 6-w e l lc e l lc u l t u r ep l a t e sa tad e n s i t yo f1x10 6 m lc e l l si nM E Ms u p p l e m e n t e dw i t ht 0 f e t a lb o v i n es e r u mA f t e rm i c r o w a v er a d i a t i o n，2 0 p tM T Ts o l u t i o n(S m g m 1 S i g m a)w a sa d d e dt oe a c hw e l If o ra na d d i t i o n a l4h o u r s T h e nt h eM T Ts o l u t i o nw a sr e m o v e d，a n dt h eb l u eM T Tf o r m a z a np r e c i p i t a t ew a sd i s s o l v e di nl5 0 p ID M S O T h eo p t i c a ld e n s i t y(爿v a l u e)o fs a m p l e sw a sm e a s u r e da t4 9 0 r i mu s i n ga l le n z y m e I i n k e di m m t m o s o r b e n ta s s a yp l a t er e a d e r(B i o R a d，H e r e u l e s，C A)C e l lc y c l ea n a l y s i s：A f t e rt r e a t e dw i t hd i f f e r e n td o s e so fm i c r o w a v er a d i a 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