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类号分 级密 国际进类号十分（UDC）第四军医大学 学位论文学位论文 胰岛素抵抗基因敏感性及相关信号表达与调控胰岛素抵抗基因敏感性及相关信号表达与调控 题题（名和副名）王欣 （作者姓名）导教师指姓名海春旭 教授 导教师单指位第四军医大学军事预防医学系毒理学教研室 请学级别申位硕士 专业称名卫生毒理学 论文提交日期2010.04 辩答日期2010.05 论时间文起止2007 年 9 月至 2010 年 5 月 学单位授予位第四军医大学 独独独独 创创创创 性性性性 声声声声 明明明明 秉承学校严谨的学风与优良的科学道德，本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，不包含本人或他人已申请学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了致谢。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名：日期：保保保保 护护护护 知知知知 识识识识 产产产产 权权权权 声声声声 明明明明 本人完全了解第四军医大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属第四军医大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位仍然为第四军医大学。学校可以公布论文的全部或部分内容（含电子版，保密内容除外），可以采用影印，缩印或其他复制手段保存论文。学校有权允许论文被查阅和借阅，并在校园网上提供论文内容的浏览和下载服务。同意学校将论文加入中国优秀博硕士学位论文全文数据库和编入中国知识资源总库，同意按中国优秀博硕士学位论文全文数据库出版章程规定享受相关权益。论文作者签名：导师签名：日期：胰岛素抵抗基因敏感性及相关信号表达与调控胰岛素抵抗基因敏感性及相关信号表达与调控 研 究 生：王 欣 学科专业：卫生毒理学 所在单位：第四军医大学军事预防医学系 军事毒理学教研室 导 师：海春旭 教授 资助基金项目：国家自然科学基金资助项目（30671788）国家自然科学基金资助项目（30872135）陕西省自然科学基金重点项目（S2009JC1186）关键词：糖尿病；胰岛素抵抗；基因敏感性；氧化应激；活性氧；信号；齐墩果酸 中国人民解放军第四军医大学 2010 年第四军医大学硕士学位论文 目目 录录 缩略语表.1 中文摘要.6 Abstract.11 前言和文献回顾.18 前 言.18 文献回顾.20 正 文.40 第一部分 氧化应激诱导胰岛素抵抗的基因敏感性差异.40 1 材料.40 1.1 主要试剂.40 1.2 主要仪器.41 1.3 实验动物.42 2 方法.42 2.1 构建动物模型.42 2.2 动物处死及标本采集.42 2.3 血糖及血清胰岛素测定.43 2.4 糖尿病基因芯片分析（Oligo Diabetes Microarray）.43 2.5 氧化应激相关指标的测定.43 2.6 糖基化终末产物（AGEs）含量测定.48 2.7 蛋白含量测定.48 2.8 RT-PCR检测基因mRNA水平的表达.49 2.9 免疫印迹法（Western-blot）测定蛋白的表达.51 2.10 统计学处理.52 第四军医大学硕士学位论文 3 结果.52 3.1 血糖变化.52 3.2 血清胰岛素水平.53 3.3 肝组织基因芯片结果.53 3.4 肝组织病理学改变.55 3.5 氧化应激相关指标.55 3.6 AGEs含量变化.56 3.7 肝组织主要抗氧化酶及其调控因子mRNA表达变化.58 3.8 肝组织主要抗氧化酶及糖尿病相关因子蛋白表达变化.58 4 讨论.59 第二部分 ROS信号与胰岛素抵抗.66 1 材料.66 1.1 主要试剂.66 1.2 主要仪器.67 1.3 细胞系.68 2 方法.68 2.1 细胞培养.68 2.2 RT-PCR检测基因mRNA表达.71 2.3 免疫印迹法（Western-blot）测定蛋白表达.72 2.4 细胞内活性氧含量测定.72 2.5 细胞线粒体的分离.72 2.6 线粒体膜电位（m）的测定.72 2.7 透射电镜观察线粒体形态.73 2.8 tBHP对AGEs形成的影响.73 2.9 统计学处理.73 3 结果.74 第四军医大学硕士学位论文 3.1 活性氧对肝细胞胰岛素信号因子影响的剂量效应关系.74 3.2 MAPKs在tBHP对胰岛素信号影响中的作用.77 3.3 MAPKs在葡萄糖氧化酶系统对胰岛素信号影响中的作用.77 3.4 MAPKs在H2O2对胰岛素信号影响中的作用.79 3.5 tBHP对胰岛素刺激下其它相关因子的影响.79 3.6 葡萄糖氧化酶系统对胰岛素刺激下其它相关因子的影响 80 3.7 H2O2对胰岛素刺激下其它相关因子的影响.82 3.8 三种ROS生成系统对线粒体膜电位的影响.83 3.9 tBHP对线粒体形态的影响.83 3.10 tBHP促进AGEs形成的量效关系.85 3.11 tBHP和H2O2在胰岛素刺激下对ROS生成的影响.85 3.12 3NP对tBHP刺激胰岛素信号的影响.86 3.13 Cyclosporin A对tBHP诱导IR的影响.86 4 讨论.87 第三部分 齐墩果酸的抗氧化活性研究.93 1 材料.94 1.1 主要试剂.94 1.2 主要仪器.94 1.3 实验动物、细胞系.94 2 方法.94 2.1 肝微粒体的提取.94 2.2 OA对DPPH自由基的清除作用.95 2.3 化学发光法测定OA清除OH的能力.95 2.4 化学发光法测定OA清除O2的能力.96 2.5 微粒体VC/Fe2+激发LPO模型.96 第四军医大学硕士学位论文 2.6 微粒体CHP激发LPO模型.97 2.7 微粒体CCl4/NADP激发LPO模型.97 2.8 抑制率的计算.98 2.9 细胞培养.98 2.10 细胞活力测定.99 2.11 细胞内活性氧含量测定.99 2.12 GSH含量测定.99 2.13 GSSG含量测定.99 2.14 免疫印迹法（Western-blot）测定蛋白表达.99 2.15 统计学处理.100 3 结果.100 3.1 OA的自由基清除作用.100 3.2 OA对微粒体脂质过氧化的抑制作用.101 3.3 OA对tBHP诱导的QZG细胞损伤的抑制作用.101 3.4 OA对tBHP诱导的ROS生成的抑制作用.102 3.5 OA对tBHP诱导的GSH/GSSG紊乱的抑制作用.103 3.6 OA对tBHP诱导的抗氧化酶谱及MAPKs变化的调控.104 4 讨论.105 第四部分 齐墩果酸的降血糖和改善胰岛素抵抗作用研究.109 1 材料.109 1.1 主要试剂.109 1.2 主要仪器.109 1.3 细胞系.109 2 方法.109 2.1 动物分组及处理.109 2.2 动物处死及标本采集.110 第四军医大学硕士学位论文 2.3 血糖测定.110 2.4 细胞培养.110 2.5 RT-PCR检测基因mRNA表达.111 2.6 免疫印迹法（Western-blot）测定蛋白表达.111 2.7 血清AGEs含量测定.111 2.8 细胞线粒体的分离和线粒体膜电位（m）测定.111 2.9 -淀粉酶的活性测定.111 2.10 统计学处理.112 3 结果.112 3.1 OA对血糖的调节作用.112 3.2 OA对动物体重和血清AGEs含量的影响.113 3.3 OA对STZ造成胰腺损伤的抑制作用.114 3.4 OA对STZ造成肝脏损伤的抑制作用.114 3.5 OA在实验动物中的抗氧化作用.114 3.6 OA促进肝细胞中胰岛素信号传导.117 3.7 OA对ROS诱导的胰岛素抵抗的抑制作用.117 3.8 MAPKs参与OA对胰岛素抵抗的抑制作用.118 3.9 OA对线粒体膜电位氧化损伤的抑制作用.119 3.10 OA对ROS诱导的肝细胞糖异生的抑制作用.119 3.11 OA对-淀粉酶的抑制作用.119 4 讨论.120 小 结.124 参考文献.126 个人简历和研究成果.142 致 谢.144 第四军医大学硕士学位论文-1-缩略语表缩略语表 缩略词缩略词 英文全称英文全称 中文全称中文全称 AG Aminoguanidine 氨基胍 AGEs Advanced glycation end products 晚期糖基化终末产物 Akt/PKB Protein kinase B 蛋白激酶 B aPKC Atypical protein kinases C 非典型蛋白激酶 C BHT Butylated hydroxytoluene 丁羟甲苯 BSA Bovine serum albumin 牛血清白蛋白 CAT Catalase 过氧化氢酶 cDNA Complementary deoxynucleic acid 互补 DNA CHP Cumine hydroperoxide 过氧基异丙苯 DEPC Diethyl pyrocarbonate 焦碳酸乙二酯 DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇 DM Diabetes mellitus 糖尿病 DMSO Dimethyl sulfoxide 二甲基亚砜 DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl 2,2-二苯基-1-苦肼基 EDTA Ethylenediaminetetra-aceticacid 乙二胺四乙酸 ERK Extracellular signal-regulated kinase 细胞外信号调节激酶 FBS Fetal bovine serum 胎牛血清 第四军医大学硕士学位论文-2-G-6-P Glucose-6-phosphate 葡萄糖-6-磷酸 G-6-PD Glucose-6-phosphate dehydrogenase 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 GAPDH Lyceraldehydes phosphate Dehydrogenase 磷酸甘油醛脱氢酶 GCLC Glutamate-cysteine ligase catalytic subunit 谷胺酸半胱氨酸连接酶催化亚基 GCLM Glutamate-cysteine ligase modifier subunit 谷胺酸半胱氨酸连接酶修饰亚基-GCS -glutamylcysteine synthase -谷氨酰半胱氨酸合成酶 GLUT-2/4 Glucose transporter-2/4 葡萄糖转运体-2/4 G Glucose 葡萄糖 GO Glucose oxidase 葡萄糖氧化酶 Gpx Glutathione peroxidase 谷胱甘肽过氧化物酶 GR Glutathione reductase 谷胱甘肽还原酶 Grb2 The growth factor receptor-bound protein 2 生长因子受体结合蛋白-2 GSH Glutathione(reduced)还原型谷胱苷肽 GSIS Glucose stimulated insulin secretion 葡萄糖刺激的胰岛素分泌 GSK3/Glycogen synthase kinase 3/糖原合成激酶 3/GSSG Glutathione(oxidized)氧化型谷胱苷肽 GST Glutathione-S-transferases 谷胱甘肽硫转移酶 H2O2 Hydrogen peroxide 过氧化氢 HE Hematoxylin-eosin 苏木精-伊红 HNF Hepatocyte nuclear factor 肝细胞核因子 第四军医大学硕士学位论文-3-HO Heme oxygenases 血红素加氧酶 HRP Horseradish peroxidase 辣根过氧化物酶 IGT Impaired glucose tolerance 糖耐量受损 IR Insulin resistance 胰岛素抵抗 IRS Insulin receptor substrate 胰岛素受体底物 ISI Insulin sensitivity index 胰岛素敏感指数 JNK c-Jun N-terminal kinase C-Jun 氨基端激酶 LPO Lipid peroxidation 脂质过氧化 MAPKs Mitogen-activated protein kinases 丝裂原激活蛋白激酶 MDA Malondialdehyde 丙二醛 MODY Maturity onset diabetes of the young 年轻人成年型糖尿病 mTOR Mammalian target of rapamycin 雷怕霉素靶蛋白 MTT Tetraozolium blue 噻唑蓝 NAC N-acetylcysteine N-乙酰半胱氨酸 NADPHNa4 Reduced form of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate tetrasodium salt 还原型烟酰胺腺嘌呤 二核苷酸磷酸四钠 NC Nitrocellulose 硝酸纤维素 NEM N-ethylma leimide N-乙基马来酰亚胺 NQO1 NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1 还原性辅酶 II：醌氧化还原酶-1 Nrf2 Nuclear factor erythroid 2-related factor2 调控制造红血球核因子2 相关的因子 2 O2 Superoxide anion radical 超氧阴离子自由基 第四军医大学硕士学位论文-4-OA Oleanolic acid 齐墩果酸 OH Hydroxyl radical 羟自由基 OPT o-phena ldehyde 邻苯二甲醛 PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis 聚丙烯酰胺凝胶电泳 PBS Phosphate buffer saline 磷酸盐缓冲液 PDK1 Phosphoinositide-dependent kinase1 磷脂酰肌醇依赖型激酶1 PCK Phosphoenolpyruvate carboxykinase 磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶 PGC1 Peroxisome proliferator-activated receptor coactivator 过氧化物酶体增殖物激活受体 共激活因子 PI Propidium iodide 碘化丙啶 PI3K Phosphoinositide-3-kinase 磷脂酰肌醇-3-激酶 PMSF Phenylmethylsulfonyl fluoride 苯甲基磺酰氟 PPAR Peroxisome proliferator-activated receptor 过氧化物酶体增殖物激活受体 PRX Peroxiredoxin 硫氧还蛋白过氧化物酶 ROS Reactive oxygen species 活性氧 SDS Sodium dodecyl sulfate 十二烷基硫酸钠 SOD Superoxide dismutase 超氧化物歧化酶 STZ Streptozocin 链脲佐菌素 T1DM Type 1 diabetes mellitus 1 型糖尿病 T2DM Type 2 diabetes mellitus 2 型糖尿病 TBA Thiobarbituric acid 硫代巴比妥酸 第四军医大学硕士学位论文-5-TBARS Thiobarbituric acid reactive substances 硫代巴比妥酸反应产物 tBHP tert-Butyl hydroperoxide 叔丁基过氧化氢 TBST Tris buffer saline plus tween 20 加吐温 20 的 Tris 缓冲液 TCF2 Transcription factor 2 转录因子 2 TEMED N,N,N,N-tetramethylethylenedia mine N,N,N,N-四甲基乙二胺 TFAM Mitochondrial transcription factor A 线粒体转录因子 A TR Thioredoxin reductases 硫氧还蛋白还原酶 TZDs Thiazolidinediones 噻唑烷二酮类药物 VC Vitamin C 维生素 C VE Vitamin E 维生素 E 第四军医大学硕士学位论文-6-胰岛素抵抗基因敏感性及相关信号表达与调控胰岛素抵抗基因敏感性及相关信号表达与调控 硕士研究生：王 欣 导 师：海春旭 教授 第四军医大学军事预防医学系军事毒理学教研室，西安 710032 中文摘要 中文摘要【背景】【背景】糖尿病（Diabetes mellitus，DM）是一种代谢紊乱性疾病，其特征是高血糖、靶组织对胰岛素敏感性不足和/或胰岛素分泌缺陷。2 型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus，T2DM）占糖尿病总发病的 80-85%。文献报道显示，T2DM具有多因子遗传性，又与后天生活饮食和行为习惯有密切关系。遗传因素和环境因素共同作用导致 T2DM 的发生，但遗传因素和环境因素有无相互作用还未见报道。T2DM 的典型特征是胰岛素抵抗（Insulin resistance，IR）导致持续性高血糖。尽管 T2DM 的具体发病机制还不明确，大量的研究证实，氧化应激与 T2DM 的发生、发展密切相关，活性氧（reactive oxygen species，ROS）在 IR 的发生中起着致因性的作用。近些年的研究发现，ROS不仅是体内代谢的垃圾和机体的有害物质，在一定剂量范围内，ROS 还作为一种信号分子，对信号传导起着调节作用。齐墩果酸（Oleanolic acid，OA）是一种天然三萜系化合物，并且是许多皂苷的苷配基。OA 在我国的传统中药中已经有 20 多年的使用历史，主要是用来治疗肝脏疾病，比如病毒性肝炎。OA 吸收后主要在肝脏代谢分布预先给予小鼠 OA，可以降低由于化学肝毒物引起的血清丙氨酸转氨酶的升第四军医大学硕士学位论文-7-高并减轻肝小叶中心坏死。【目的】【目的】(1)研究氧化应激诱导 IR 基因敏感性差异。(2)探讨 ROS 对肝细胞胰岛素信号的调节作用及其机制。(3)研究 OA 的抗氧化活性、降血糖和改善肝细胞 IR 的作用机制。【方法】【方法】(1)氧化应激诱导 IR 的基因敏感性差异研究。高脂高糖饲料的基础上，给大鼠注射小剂量 tBHP，诱导大鼠差异性产生 IR。利用基因芯片，筛选实验动物肝组织糖尿病相关基因 mRNA 表达差异，寻找氧化应激诱导 IR 的易感性差异基因。并测定实验动物血清、肝、脂肪和肌肉组织的氧化应激相关指标，验证实验动物是否存在氧化损伤的差异。(2)ROS 信号对肝细胞胰岛素信号的调节作用及其机制研究。采用 QZG 人正常肝细胞系作为实验对象，利用 tBHP、葡萄糖+葡萄糖氧化酶系统和 H2O2三种 ROS 生成系统，以胰岛素刺激的 Akt、GSK3/和 mTOR 的磷酸化的改变为判定指标，研究不同浓度 ROS 生成系统对肝细胞胰岛素信号影响的剂量效应关系。并使用 DCFH-DA 为探针测定细胞内 ROS 的生成，分离细胞线粒体，测定线粒体膜电位，通过透射电镜观察线粒体形态，同时使用western blot和RT-PCR等分子生物学技术测定MAPKs以及氧化应激相关指标的表达，研究氧化还原平衡、线粒体功能等对 ROS 干扰胰岛素信号的影响。(3)OA 的抗氧化活性、抗糖尿病和对肝细胞 IR 的保护作用及其机制研究。通过体外建立羟自由基和超氧阴离子鲁米诺化学发光体系和 DPPH 自由基生成体系，并在亚细胞水平构建 CHP、Vc/Fe2+、CCl4/NADP+激发的微粒体脂质过氧化损伤模型，建立抗氧化活性评价技术平台，检测 OA 对平台各体系激发生成的自由基及丙二醛含量的影响。并通过 tBHP 诱导肝细胞氧化第四军医大学硕士学位论文-8-损伤，使用 DCFH-DA 为探针测定细胞内 ROS 的生成，测定 GSH 和 GSSG含量，MTT测定细胞活力，western blot测定Nrf2、相关抗氧化酶以及MAPKs的表达变化，研究 OA 对细胞氧化损伤的保护作用，及 Nrf2 调控的氧化还原平衡和 MAPKs 的影响。还利用 STZ 诱导大鼠糖尿病样改变，研究腹腔注射 OA 对糖尿病大鼠血糖的影响，体外测定 OA 对 淀粉酶活性的影响，并使用 200M tBHP 诱导肝细胞发生 IR，western blot 测定胰岛素信号和MAPKs 磷酸化的改变，RT-PCR 测定氧化应激和糖代谢相关指标，分离线粒体测定线粒体膜电位，研究 OA 对肝细胞 IR 的保护作用及可能机制。【结果】【结果】(1)高脂高糖饲料的基础上，给大鼠注射氧化剂 tBHP 4 周后，一部分实验动物（IBG）血糖显著升高并发生 IR，而另一部分实验动物（NBG）血糖未发生显著性改变也未发生 IR。肝组织糖尿病相关基因芯片结果显示，氧化应激条件下，IBG 和 NBG 组大鼠的糖尿病相关基因出现了明显分离性表达，即一部分为糖尿病性敏感性表达，而另一部分为非敏感性表达，其中变化最为显著的是转录因子 2（transcription factor 2，TCF2），也称为肝细胞核因子 1（hepatocyte nuclear factor，HNF1）。敏感组较较不敏感组 TCF2表达下调 60 倍以上，不敏感组较正常对照组 TCF2 表达明显上调。敏感组动物受到明显的氧化损伤，抗氧化能力明显减弱。(2)不同剂量的 tBHP、葡萄糖+葡萄糖氧化酶系统和 H2O2三种 ROS 生成系统显著地影响了胰岛素刺激的 Akt、GSK3/和 mTOR 等信号的磷酸化。总体趋势表现为低剂量 ROS 促进 Akt 信号的传导，高剂量的 ROS 抑制 Akt信号，具有一定的剂量效应关系。在三种 ROS 生成系统中，tBHP 和 H2O2主要表现为低剂量促进 MAPKs 的磷酸化，高剂量抑制其磷酸化。葡萄糖+葡萄糖氧化酶系统则随着浓度的升高，MAPKs 的磷酸化逐渐增强。低剂量的三种 ROS 生成系统明显地使抗氧化核心转录因子（Nrf2）表达增强并使细胞抗氧化酶介导的抗氧化防御系统增强，但随着随着 ROS 浓度的升高，第四军医大学硕士学位论文-9-细胞抗氧化防御能力逐渐减弱。低剂量的三种 ROS 生成系统使 TCF2 表达显著增强，而高剂量的 ROS 又使 TCF2 的表达显著降低。低剂量的 tBHP使胰岛素刺激的 PCK2 mRNA 表达显著降低，而随着浓度升高，tBHP 又促进 PCK2 的表达。线粒体膜电位结果显示，低剂量的三种 ROS 生成系统对线粒体膜电位无显著影响，而在高剂量的条件下，三种 ROS 生成系统使线粒体膜电位显著降低。此外，透射电镜观察发现 200M tBHP 使线粒体明显受到损伤，而给予抗氧化剂明显逆转 tBHP 对线粒体的损伤。使用线粒体酶复合物抑制剂（3NP）明显地抑制了低剂量 tBHP 对胰岛素刺激的 Akt信号的促进作用。使用线粒体保护剂（环孢霉素 A）明显地减弱高剂量 tBHP对肝细胞胰岛素信号的抑制作用。不同浓度的 tBHP 还剂量依赖性地促进以BSA 和胰岛素为底物的 AGEs 的形成。(3)自由基模型和脂质过氧化模型结果显示,OA 具有一定的自由基清除作用和抑制脂质过氧化作用，但是 OA 对自由基的直接作用并不强。体外细胞氧化损伤模型结果显示，OA 可以明显保护细胞免受氧化损伤，明显抑制tBHP 诱导的细胞活力的降低，促进 GSH 的生成而降低 GSSG 的含量，并上调 Nrf2 和抗氧化酶 CAT 和 PRX1 的表达，并促进 ERK 和 JNK 的磷酸化。OA 对糖尿病大鼠的作用显示，预防性和治疗性给予 OA 都可使糖尿病大鼠血糖显著降低，OA 可以有效预防并阻止 STZ 诱导的 T1DM。OA 还使大鼠在实验期间体重增加明显减慢。OA 明显地保护 STZ 诱导的大鼠胰腺和肝脏的病理损伤。OA 显著地促进正常条件下胰岛素的信号分子传导并明显改善 tBHP 诱导的 IR。预防性或治疗性给予 OA 明显地促进 MAPKs 的磷酸化。OA能使tBHP诱导的PCK2的mRNA表达明显降低。OA还明显地保护tBHP对线粒体膜电位的损伤。然而，OA 对 淀粉酶活性无明显影响。【结论】【结论】(1)TCF2 是决定胰岛素抵抗发生易感性的关键因子。高脂高糖氧化应激动物出现 IR 分离性表现，发现有 45受试动物具有第四军医大学硕士学位论文-10-糖尿病易感性，表现为有一系列的基因表达异常，其中 Nrf2 与 TCF2、PPAR以及其它一系列的抗氧化酶表达的变化趋势非常相似，但 TCF2 变化最为显著。这些发现表明，TCF2 与以 Nrf2 为核心的氧化还原平衡之间有着密切的关系。TCF2 是否为决定生物体在氧化应激条件下发生 IR 甚至于 T2DM的关键因子，有待于进一步证明。(2)ROS 对肝细胞胰岛素信号具有剂量依赖性的双重调控作用。在生理条件下，低剂量的 ROS 可以促进胰岛素信号的传导，而高剂量的 ROS 可以干扰胰岛素信号的正常传递，诱导 IR 的发生，提示 ROS 对胰岛素信号的作用具有剂量依赖性，ROS 水平的变化起着双刃剑的作用。Nrf2调控的氧化还原平衡可能是 ROS 调节胰岛素信号的关键。此外，MAPKs和线粒体功能可能是介导 ROS 调节胰岛素信号的重要因素。(3)OA 可以 Nrf2 为靶点有效地降低血糖、改善肝脏胰岛素抵抗。OA 具有自由基清除作用，是一种可以通过生物学作用诱导抗氧化防御系统而间接发挥抗氧化作用的抗氧化剂。与自由基清除作用相比，OA 的间接生物学作用更为重要。OA 通过诱导 Nrf2 上调抗氧化酶的表达，进而促进 GSH 的生成而发挥抗氧化作用，可能主要通过间接地激活关键转录因子和抗氧化酶系统而发挥抗氧化作用。此外，JNK 和 ERK 的磷酸化参与 OA发挥抗氧化作用，而且在 MAPKs 和 Nrf2 之间很可能存在某种 cross-talks。OA 可以降血糖、改善肝脏 IR、抑制肝糖异生。而 OA 的减轻体重、抗氧化作用、对 ERK 和 JNK 两种氧化应激敏感激酶的激活以及对线粒体的保护作用等功能可能是 OA 抗糖尿病作用的重要机制。我们的研究表明 OA 在治疗糖尿病领域的应用将具有非常重要的意义。【关键词】【关键词】糖尿病；胰岛素抵抗；基因敏感性；氧化应激；活性氧；信号；齐墩果酸 第四军医大学硕士学位论文-11-The genetic sensitivity of insulin resistance and the expression and regulation of related signals Candidate for master:Wang Xin Supervisor:Hai Chunxu Department of Toxicology,the Faculty of Preventive Medicine,the Fourth Military Medical University,Xian 710032,China Abstract【Background】Diabetes mellitus(DM)is a metabolic disorder characterized by hyperglycemia,the defect of the sensitivity to insulin in target tissues and/or the defect of insulin secretion.Type 2 diabetes mellitus(T2DM)accounts for 80-85%of all diabetic cases.T2DM is a multifactorial hereditary disease resulted from both of genetic factors and environmental agents.The hallmark of T2DM is insulin resistance(IR),leading to chronic hyperglycemia.Although the pathogenesis of T2DM is still to be cleared,a number of evidence have showed that oxidative stress is closely related with the onset and development of T2DM and that ROS play a causal role in the pathogenesis of IR.The studies of the last decades have showed that in addition to the injury of excessive ROS to organisms,under certain concentration,ROS is also considered to be a signal molecule,regulating signal transduction.Oleanolic acid(OA)is a natural triterpenoid and the aglycone of many saponins.There is a long history(more than 20 years)of the use of OA in traditional Chinese medicine,mainly being used for the treatment of hepatic 第四军医大学硕士学位论文-12-diseases,such as virus hepatitis.After absorption,OA will mainly be distributed to liver,and mainly be metabolized in liver.There are experiments showing that OA protecting animals against hepatotoxicant-induced oxidative injury.In addition,pretreatment of mice with OA attenuates the chemical hepatotoxicant-induced increase of alanine transaminase and and centrilobular necrosis.【Aims】(1)To investigate the genetic sensitivity differences to oxidative stress-induced IR.(2)To study the regulation and mechanism of ROS signal in insulin signal transduction in hepatocyte.(3)To investigate the antioxidant activities and anti-diabetic effect of OA and the protective effect and mechanism of OA in hepatic insulin resistance.【Methods】(1)The study of the genetic sensitivity differences to oxidative stress-induced IR.Based on high fat/glucose diet,the experimental animals were dosed with low concentration of tBHP,leading to the differential occurrence of IR.Livers of the animals were used to screen the mRNA expression difference of diabetes-related gene by the use of gene arrays.Oxidative stress-related indexes of serum,liver,fat and muscle were measured to testify whether the oxidative injury of different animals were discrepant.(2)The study of the regulation and mechanism of ROS signal in insulin signal transduction in hepatocyte.Human normal hepatocyte cell line(QZG)was used to study the dose-effect relation of different consentrations of ROS,which were induced by tBHP,glucose+glucose oxidase and H2O2,on hepatic insulin signal 第四军医大学硕士学位论文-13-transduction.The changes of the phosphorylations of Akt、GSK3/and mTOR were used to evaluate the effect of different concentrations of ROS on hepatic insulin signal.DCFH-DA was used as a probe to detect the generation of ROS.Mitochondria were isolated and mitochondrial membrane potential was detected using Rho 123.The mitochondrial appearance was observed under transmission electron microscope.Western blot and RT-PCR were used to evaluate the phosphorylation of MAPKs and the expression of oxidative stress-related indexes.(3)The study of the antioxidant activities and anti-diabetic effect of OA and the protective effect and mechanism of OA in hepatic insulin resistance.In vitro hydroxy radical and superoxide anion chemiluminescence model and DPPH free radical generating system were established.Microsomal lipid peroxidation models induced by CHP,Vc/Fe2+and CCl4/N