全反式维甲酸对鼠胚神经干细胞增殖和分化的作用.pdf

Chinese Journal of Reparative and Reconstructive Surgery,February 2008,Vol.22,No.2206全反式维甲酸对鼠胚神经干细胞增殖和分化的作用钟德君 张德盛 宋跃明【摘 要】目的 观察不同浓度的全反式维甲酸（all-trans-retinoic acid，ATRA）在鼠胚神经干细胞（neural stem cells，NSCs）增殖和分化中的作用，寻找促 NSCs 分化为神经元的较佳 ATRA 浓度。方法 分离孕 12 16 d（平均15 d）胚胎大鼠脑皮层，用无血清但含神经生长因子（20 ng/mL bFGF、20 ng/mL EGF）的培养液悬浮培养，细胞接种密度为 1106/mL，7 d 传代。取第 3 代 NSCs，分别在含 0.5、1.0、5.0 和 10.0 mol/L ATRA（实验组，分别为 A、B、C、D 组）及不含 ATRA（对照组，E 组）的 DMEM/F12 完全培养基中培养，于培养第 1、2、3、4、5、6 及 7 天倒置相差显微镜下计数形成的细胞球数；于培养后 1、3、5、7 及 9 d 采用 BrdU 免疫荧光染色，分析各组细胞增殖效应。另取第 3 代 NSCs，5%FBS培养基调整细胞密度为 1106/mL，接种至 6 孔板内，分别加入 0.5、1.0、5.0 和 10.0 mol/L ATRA，作为各实验组（即 A、B、C、D 组），对照组不含 ATRA（E 组），于培养后 3、5 及 7 d 采用免疫荧光双标染色和流式细胞仪检测各组细胞分化为神经元的比例。结果 培养后 1、2、3、4、5、6 及 7 d，各实验组增殖细胞球数目接近（P 0.05），但均明显少于对照组，且差异有统计学意义（P 0.05）；对照组各时间点 BrdU 阳性细胞球明显多于实验组，差异有统计学意义（P 0.05）。各实验组 ATRA 促使 NSCs 分化为神经元的比例明显增高，NSE 阳性细胞分化率各组间差异有统计学意义（P 0.05），其中 B 组最高，在培养 3、5、7 d 分别为29.46%0.47%、47.25%0.46%、66.81%0.57%，而 E 组 NSCs 主要分化为星形胶质细胞，NSE 阳性细胞分化率在培养3、5、7 d 分别为 11.11%0.59%、14.10%0.32%、15.92%0.70%。流式细胞仪检测显示，培养后 3、7 d，促神经元分化比例各实验组与对照组比较差异均有统计学意义（P 0.05).Cell counting at each time point of all the experimental groups were less than those of control group(P 0.05).BrdU positive cells at each time point of control groups were more than those of all the experimental groups(P 作者单位：四川大学华西医院骨科（成都，610041）现在泸州医学院附属医院脊柱外科通讯作者：宋跃明，教授，博士导师，研究方向：脊柱外科，E-mail:sym_中国修复重建外科杂志2008年2月第22卷第2期2070.05).The differentiation ratio of neurons was enhanced in experimental groups and the optimal ATRA treatment concentration was 1.0 mol/L(experimental group B).The differentiation ratio of neurons induced by ATRA in group B was 29.46%0.47%,47.25%0.46%and 66.81%0.57%respectively after cultured 3,5 and 7 days,whereas the differentiation ratio of neurons was 11.11%0.59%,14.10%0.32%and 15.92%0.70%respectively in control group.The majority of NSCs differentiated into astroglial phenotypes in control group.By flow cytometry detection,the differentiation ratio of neurons after cultured 3 days and 7 days in experimental groups were more than those in control group(P 0.05).Conclusion ATRA treatment remark-ably promoted the differentiation of NSCs into neurons and the optimal concentration was 1.0 mol/L.【Key words】Neural stem cells All-trans-retinoic acid Differentiation Neuron Rats神经干细胞（neural stem cells，NSCs）存在于胚胎和成年哺乳动物的中枢神经系统，具有自我更新和多向分化潜能，能分化为各种神经细胞，如神经元、少突胶质细胞以及星形胶质细胞等1。中枢神经系统损伤后，大部分 NSCs 分化为胶质细胞，在损伤部位形成胶质瘢痕，阻碍了轴突生长，使损伤不能修复2。因此，提高 NSCs 向神经元的分化比例及探索其机制成为神经科学研究的热点。NSCs 分化和增殖受自身基因和外来信号调控。维甲酸是维生素 A 类的衍生物，是影响细胞增殖分化的外来信号之一，在脊椎动物中枢神经系统的正常发育中起关键作用3，也决定了脊髓背-腹轴的形成4，但机制尚不完全清楚。因此，我们对全反式维甲酸（all-trans-retinoic acid，ATRA）对体外培养的 NSCs 定向分化为神经元的作用进行研究，旨在为 NSCs 移植治疗神经系统疾病和损伤修复提供理论依据。1 材料与方法1.1 实验动物和主要材料孕 12 16 d（平均 15 d）SD 大鼠，由四川大学实验动物中心提供。DMEM/F12（11）、B27 辅助生长因子、FBS（Gibco 公司，美国），bFGF、EGF（Pepro-Tech 公司，英国）；ATRA、4，6 二脒基-2-苯吲哚盐酸（4，6-diamidino-2-phenylindole 2HCl，DAPI，Sigma 公司，美国）。抗体：抗巢蛋白、抗神经元特异性烯醇化酶（neurone specific enolase，NSE）、抗胶质细胞原纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）、FITC标记羊抗兔 IgG（武汉博士德生物工程有限公司）；TRITC 标记抗兔 IgG（北京中山金桥生物技术有限公司）；SP 超敏试剂盒（福州迈新生物技术公司）。1.2 NSCs 分离和培养将 SD 大鼠断颈处死，剖腹取胚胎大脑皮层组织，0.25%胰蛋白酶及 0.02%EDTA（11）消化，并轻柔吹打制作单细胞悬液，苔盼蓝染色法计数活细胞。将细胞按 1106/mL 密度接种于 75 mL 培养瓶，每 2 3天以离心半径 22 cm，1 200 r/min 离心 5 min，并半量换液 1 次。7 d 传代，取生长良好的第 3 代 NSCs，备用。1.3 ATRA促NSCs增殖作用 取第 3 代 NSCs，在培养孔中加入用完全培养基 由 DMEM/F12（11）、20 ng/mL bFGF、20 ng/mL EGF、20 L/mL B27 组成 调整终浓度为 0.5、1.0、5.0和 10.0 mol/L 的 ATRA，作为各实验组（即 A、B、C、D 组），对照组不含 ATRA（E 组），每组 6 个复孔，于37、5%CO2及饱和湿度培养箱内培养。倒置相差显微镜下，各组于培养后第 1、2、3、4、5、6、7 天各选择 6个高倍镜视野观察，计数形成的细胞球数；另取各组细胞，于培养后第 1、3、5、7、9 天，使用 BrdU 标记，进行免疫荧光化学检测，计数 BrdU 阳性细胞球数。1.4 ATRA促NSCs分化作用 取第 3 代 NSCs，5%FBS 培养基 由 DMEM/F12（11）、5%FBS 组成 培养，接种至预先由多聚赖氨酸包被的盖玻片 6 孔板内，接种密度为 1106/mL，分别加入终浓度为 0.5、1.0、5.0 和 10.0 mol/L 的 ATRA，作为各实验组（即 A、B、C、D 组），对照组不含 ATRA（E组）。于培养后 3、5、7 d，行免疫荧光双标染色鉴定神经元和星形胶质细胞，同时用 DAPI 标记细胞核，按下列公式计算 NSE 阳性细胞分化率。NSE 阳性细胞分化率 NSE/DAPI。另取各组细胞，于培养 3、7 d后行流式细胞仪检测促神经元分化比例。1.5 统计学方法 采用 SPSS10.0 统计软件包进行分析。数据以均数 标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 法，P值 0.05）。E 组培养 1 2 d 即开始增殖，2 d 形成由 4 8 个细胞组成的细胞球，无明显贴壁现象；此后快速生长，6 7 d 形成数十个至数百个细胞组成的细胞球，细胞球大小及数量与各实验组有明显差异（P 0.05）；而E 组相同时间点的阳性细胞比例均高于各实验组，且差异有统计学意义（P 0.05），见表 2、图 1。2.2 ATRA 促 NSCs 分化作用培 养 后 3、5 及 7 d，各 实 验 组 NSE 阳 性 细 胞分化率均较对照组明显提高，且差异有统计学意义（P 0.05）。各实验组 ATRA 促分化效应由大至小依次为 A、B、C 组和 D 组，各组间差异均有统计学意义（P 0.05）。E 组 NSCs 在含 5%FBS 培养基中主要分化为星形胶质细胞，神经元分化较少。见表 3，图 2。A、B、C、D 组促神经元分化比例，培养 3 d 分别为 28.10%0.36%、25.30%0.54%、22.40%0.47%和 18.30%0.35%；培养 7 d 分别为 48.60%0.41%、67.10%0.58%、43.70%0.35%和 38.80%0.61%。E 组培养 3、7 d 分别为 10.60%0.46%和 15.00%0.47%。各实验组促神经元分化比例高于对照组，且差异有统计学意义（P 0.05）；各实验组中，B 组促神经元分化比例高于其他各组（P 0.05），见图 3。表 3 各组不同时间点促 NSCs 分化为神经元的比例（n=6，%，x s）Tab.3 The differentiation ratio of neurons from NSCs by ATRA inter-vention at different time（n=6，%，x s）组别Group时间（d）Time（d）3 57A26.30 0.61*35.14 0.48*46.19 0.47*B29.46 0.47*47.25 0.46*66.81 0.57*C23.14 0.44*34.11 0.35*42.38 0.16*D19.25 0.52*27.29 0.42*37.03 0.58*E11.11 0.5914.10 0.3215.92 0.70*与 E 组比较 P值 0.05,与 B 组比较 P值 0.05*Compared with group E,P 0.05;compared with group B,P 0.053 讨论成年哺乳动物的中枢神经系统存在具有增殖和分化潜能的多能干细胞NSCs，它具有多向分化潜能、自我复制、高度增殖能力，能分化为特定类型神经元和神经胶质细胞，可维持局部神经发生1。NSCs 的基因治疗、细胞移植以及作为组织工程种子细胞在治疗神经系统退行性疾病（如帕金森病、阿尔茨海默病等）、遗传性神经系统疾病（如亨廷顿舞蹈病）和中枢神经系统损伤性疾病（如脊髓损伤）中已展现良好前景。但在中枢神经系统损伤修复的研究中发现，损伤表 1 不同浓度 ATRA 作用不同时间后 NSCs 细胞球计数（n=6，x s）Tab.1 The number of neurospheres by ATRA intervention at different time（n=6，x s）组别Group时间（d）Time（d）1 2 3 4 5 6 7 A0.666 7 0.516 4*0.333 3 0.516 4*7.333 3 1.032 8*11.666 7 0.815 6*17.000 0 1.264 9*19.666 7 1.366 3*21.833 3 1.329 6*B1.166 7 0.482 3*0.500 0 0.547 7*7.833 3 0.752 8*12.333 3 0.516 4*17.833 3 0.983 2*20.333 3 1.366 3*22.833 3 1.169 1*C1.166 7 0.752 8*0.333 3 0.516 4*7.666 7 1.032 8*12.166 7 0.752 8*17.666 7 0.816 5*20.166 7 0.983 2*22.666 7 1.366 3*D0.833 3 0.408 3*0.166 7 0.408 3*7.333 3 1.211 1*11.833 3 0.752 8*16.833 3 1.472 0*19.666 7 1.633 0*21.666 7 0.366 3*E1.833 3 0.408 34.833 3 0.408 313.666 7 0.516 419.500 0 0.547 728.833 3 0.752 835.166 7 0.752 837.833 3 0.752 8*与 E 组比较 P值 0.05*Compared with group E，P 0.05表 2 不同浓度 ATRA 作用不同时间后 BrdU 标记的阳性细胞数（n=6，x s）Tab.2 Counts of BrdU-positive NSCs by ATRA intervention at different time（n=6，x s）组别Group时间（d）Time（d）1 3 5 79 A0.500 0 0.547 2*2.000 0 0.632 5*8.333 3 0.516 4*15.833 3 0.752 8*21.333 3 1.861 9*B0.666 7 0.516 4*2.333 3 0.516 4*9.000 0 0.632 5*16.833 3 0.752 8*22.833 3 0.752 8*C0.666 7 0.516 4*2.166 7 0.752 8*8.500 0 0.547 7*16.333 3 0.816 5*22.666 7 1.505 6*D0.333 3 0.516 4*1.833 3 0.408 3*8.166 7 0.752 8*16.166 7 1.169 1*21.666 7 1.505 6*E1.333 3 0.516 44.666 7 0.516 414.333 3 0.516 421.333 3 1.032 830.833 3 1.169 1*与 E 组比较 P值 0.05*Compared with group E，P 0.05中国修复重建外科杂志2008年2月第22卷第2期209图 1 ATRA 作用后各时间点 BrdU 荧光染色（荧光显微镜 400）a A 组培养后 3 d b B 组培养后 7 d c D 组培养后 5 d d E 组培养后 3 d 图 2 NSCs 分化情况（荧光显微镜 200）a A 组 DAPI 染细胞核（蓝色）与 NSE 阳性细胞（红色）b B 组分化的 NSE 阳性细胞（红色）增多 c C 组 DAPI 染细胞核（蓝色）与 GFAP 阳性细胞（绿色）d E 组荧光双标显示主要分化为 GFAP 阳性细胞（绿色）图 3 流式细胞仪检测各组各时间点促神经元分化比例 a A组培养3 d b B组培养3 d c C组培养3 d d D组培养3 d e E组培养3 d f A组培养7 d g B 组培养 7 d h C 组培养 7 d i D 组培养 7 d j E 组培养 7 dFig.1 BrdU-positive NSCs number by ATRA intervention at different time(Fluorescence microscope 400)a Three days after culture in group A b Seven days after culture in group B c Five days after culture in group D d Three days after culture in group E Fig.2 The NSCs differentiation(Fluorescence microscope 200)a In group A,cell nucleus were stainied by DAPI(blue)and NSE-positive cells（red）b In group B,NSE-positive cells(red)increased c In group C,cell nucleus were stainied by DAPI(blue)and GFAP-positive cells(green)d In group E,the major differentiated cells from NSCs were GFAP-positive cells(green)Fig.3 Ratio of NSE staining positive by flow cytometry detection at different time a Three days after culture in group A b Three days after culture in group B c Three days after culture in group C d Three days after culture in group D e Three days after culture in group E f Seven days after culture in group A g Seven days after culture in group B h Seven days after culture in group C i Seven days after culture in group D j Seven days after culture in group E 部位的 NSCs 主要分化为星形胶质细胞，在局部形成胶质瘢痕，阻碍了轴突生长和损伤修复2。因此，探索NSCs 向神经元的定向分化及其分化机制具有重要价值。NSCs 的分化受多种因素共同调控，这些因素相互作用，构成了复杂的调控系统。决定 NSCs 增殖分化的因素主要包括两方面：一是细胞自身基因的调控；二是外来信号的作用。细胞自身基因主要包括转录调控因子螺旋-环-螺旋、转录抑制因子、Wnt/-catenin 信号途径、Notch 信号途径等；而外来信号主要包括有丝分裂原（如 bFGF、EGF1a1b1a1c1d2a2b2c2d3aP2070207-2101102103104105FITC-A0255075 100 125Count3b3e3c3d3j3i3h3f3gChinese Journal of Reparative and Reconstructive Surgery,February 2008,Vol.22,No.2210等）、神经营养因子（如睫状神经营养因子、PDGF、IGF、脑源性神经营养因子、神经营养蛋白 3）、肽类物质（如神经肽）及一些化学物质（如维甲酸）等，这些外来信号构成了 NSCs 增殖分化的外部微环境5-8，相同来源的 NSCs 在不同环境下可分化为不同类型、不同谱系的细胞。NSCs 自身基因及外来信号的协调作用，形成复杂的调控网络，共同决定 NSCs 的增殖及分化。维甲酸是维生素 A 类的衍生物，也是影响细胞增殖分化的外来信号之一，在动物发育中调控多种功能，包括视觉形成、细胞分化、免疫、生殖力和内环境的稳定，从发育早期持续到成熟期，维甲酸类物质在正常生理中发挥极其重要的作用9。维甲酸的生物效应是由维甲酸受体介导的。维甲酸受体是细胞核受体超家族的成员10，包括维甲酸类受体（retinoic acid recep-tors，RAR）、和视黄醇受体（retinoid X receptors，RXR）、。RAR 可与 ATRA 和 9-顺式维甲酸结合，RXR 与 9-顺式维甲酸结合，也可与非维甲酸类的亲脂质的配体，如二十二碳六烯酸结合11。RARs 和 RXRs形成异二聚体，与 DNA 特殊序列结合，提高靶基因转录。RARs、RXRs 和维甲酸间的活性在齿状回和海马区域等中枢神经系统内以不同模式存在12。维甲酸是形成神经元间长期的突触联系所必须的11，13，且维甲酸的集中、浓缩及在成年动物齿状回中表达 RARs 和RXRs，提示维甲酸也能促进神经发生区域专一。在这个过程中，通过与 RARs 和 RXRs 作用，维甲酸上调了转录因子 NeuroD，使 P21 表达增加，同时增加了酪氨酸激酶（tyrosine kinase，Trk）受体 TrkA、TrkB、TrkC和 P75 神经营养因子受体的表达，使 NSCs 向神经元分化14。在鼠的体内人为造成维甲酸缺乏，通过注射BrdU 并对比研究，发现维甲酸的缺乏明显抑制了发育早期神经元的分化11。维甲酸还通过上调 NT2 细胞内的 Wnt7b 蛋白，促使神经元分化15。在胚胎干细胞培养中，维甲酸还能促进核内-catenin 的表达，增加 Neurogenin1 的表达，从而促进胚胎干细胞向神经元分化，为胚胎干细胞移植治疗神经系统疾病奠定基础16-17。实验表明，维甲酸可激活 Pax6、Pax7 及 EN1等神经发育基因18，同时也可能作用于 Notch1 信号，促使其下调并激活下游基因转录，使胚胎干细胞向神经细胞分化19；此外，维甲酸还能通过抑制 BMP 信号20，或者与 PA6 细胞联合培养来促进胚胎干细胞向神经细胞分化21。因此，维甲酸在 NSCs 增殖、分化，尤其是分化为神经细胞的过程中，发挥了重要作用。我们的实验以不同浓度的 ATRA 对 NSCs 进行干预，以无 ATRA 干预的细胞组为对照，荧光双标染色及流式细胞仪检测结果均显示，在各浓度组 ATRA 促 NSCs分化为神经元的比例明显高于对照组；其中 1.0 mol/L ATRA 促神经元分化比例最高，而完全培养基中的NSCs 主要分化为星形胶质细胞，在各时间点均如此。表明 ATRA 促 NSCs 分化的效应在浓度由低到高时呈浓度依赖性，但超过5.0 mol/L时，由于浓度逐渐增高，引起细胞死亡增多。bFGF 和 EGF 作为有丝分裂原样的生长因子，是构成细胞外微环境的重要成员，在 NSCs 增殖发育中起重要作用。实验表明，无论在体外培养的干细胞还是体内的前体细胞均检测到了丝裂原信号受体，在发育过程中也证实了 bFGF 和 EGF 的存在。在体外培养中，bFGF 和 EGF 能使干细胞不断增殖，并使其具有形成单克隆的能力，而且使干细胞保持自我更新和自我维持的能力，并维持干细胞特性，去掉这些因子，干细胞则失去这些能力22-23。bFGF 一般作用于中枢神经系统的早期发育24，而 NSCs 在神经系统发育的稍晚时期对 EGF 作用更加敏感25。因此，相对于维甲酸的促分化作用，bFGF 和 EGF 对 NSCs 的作用主要是使其增殖并维持其干细胞特性。我们的实验以不同浓度ATRA 对 NSCs 进行干预，以完全培养基（含 bFGF 和EGF）培养细胞组为对照，从观察神经球生长情况及计数神经球数目和 BrdU 免疫荧光染色结果发现：各ATRA 组能促 NSCs 的增殖，各组促增殖作用无明显差异，但增殖作用较对照组弱，差异有统计学意义。这是因为在完全培养基中，含有较高浓度的 bFGF 和 EGF，能促进神经干细胞分裂增殖，保持干细胞自我更新能力以及干细胞特性。以上这些结果为研究 NSCs 的定向分化提供了一定的实验依据，将可能为神经细胞移植治疗神经系统疾病和损伤修复提供有益的材料和方法。4 参考文献1 Watt FM,Hogan BL.Out of Eden:stem cells and their niches.Science,2000,287(5457):1427-1430.2 Takahashi M,Arai Y,Kurosawa H,et al.Ependymal cell reactions in spinal cord segments after compression injury in adult rat.J Neuro-pathol Exp Neurol,2003,62(2):185-194.3 Maden M.Retinoid signalling in the development of the central ner-vous system.Nat Rev Neurosci,2002,3(11):843-853.4 Pierani A,Brenner-Morton S,Chiang C,et al.A sonic 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医学整形美容（会阴部修复重建）以上重点栏目将邀请国内相关领域专家撰写述评。欢迎广大读者踊跃投稿。此外，也竭诚欢迎广大读者投寄与本刊宗旨“结构、功能、形态的完美结合”相符的其他基础研究和临床治疗研究类论文。本刊编辑部2008-01-30