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植物学通报2 fi 0 2，1 9(2)：2 3 42 3 8 C h b t t 血l D，B o t t m y R NA 原 位 杂 交 实 用 技 术 徐云远种康。许智宏谭克辉(中国科 学 院植 物研 究 所北京1 0 0 0 9 3)摘 要利用 互 补 R NA为探 针进 行原 位 杂 交是 分 析 组 织 或 细 胞 内 R N A分 布 的 行 之 有 效 的 方 法，通 过 对 mR N A分 布 的研 究 可 以 了解 特 定 基 因 的表 达 情 况。原位 杂 交 技 术过 程 较 长，操 作 繁琐，从 而 在 一些 实 验 中不能得到很好的使用，为此本文 根据莪们过去的实际操作经验对该技 术中的一些使用技巧作简要 的 介 绍。关 键 词原 位 杂 交，基 因表 达 Th e l h-a e t i e a l Te c hn i q ue of n s t u Hybr l di al l on wi t h RNA Pr o be XU Y t m-Y u a n C HONG Ka I l g X U Z h i-Ho n g T AN K e-Hu i(f 矿 B 栅 d A 枷 鼬 ，B e 1 0 0 0 9 3)Ab s 咖 d 5 h y b ri d i z a t i o n wi t h c o mp l e me n t RNA p r o b e i s a|l e ff e c t i v e me t h o d t o d e t e c t d i s t ri b u ti o n o f R NA i n t i s s u e o r o e b v w h i c h t h e e x p ms s mn p a t t e rn o f g e n e c fl n c o n s e q u e n tl y b e r e v e a l e d A s t h e c o mp l e t e p r o c e s s i s l o n g e r a n d mo r e p】t h a n o t h e r m o l e c u l a r h y b fi d i z a t i 呷，t h e a p p l i c a t i o n o f t h i s me o dh o w e v e r i s l i mi t e d i n c(l r r 1 l a】mb 0 +I n o r d e r t o r r 1 a I t h i s t e c h n i q u e b e u s e d wl d l y i n r o u t i n e e x p e ri me n t s，t h e p r a c t i c a l s k i l l s we r e i n t r o d u c e d b a s e d o n p a s t e x p e r i e n c e+Ke ywo r d s n s t u h y b rid i z a t i o n，E x p r e s s i o n o f g e n e 随着越来 越 多的基 因被 克 隆，探 索这 些基 因 的表 达模 式 是研 究 其 功能 的重 要 环节 之 一。利用 N o a h e m 杂交 可以说 明特 定 基 因在不 同器官 不 同 时 期 的表 达情 况，如果 要 在 显 微或亚 显微水 平对一 些 基 因的时 空表 达进 行研 究，N o r t h e r n杂交 就 显 得无 能 为力 根 据 核酸分 子杂交 的基本 原 理 和 免疫 组 织 化 学 的 成熟 方 法而 发 展 的原 位 杂 交技 术(I S H，i n s i t u h y b ri d i z a ti o n)(G a l l a n d P a r d u e，1 9 6 9；J o h n e t a ，1 9 6 9)为 我们提 供 了行 之有效 的途径。利用 R N A作 为探 针，与组 织 内的 R N A靶序 列杂交，这 样可 以 了解组 织或 细胞 内 R N A 的分 布和数 量，而 且与 D N A探 针相 比，使用 R N A探 针 有其 独 特 的 优点：R N A：R N A热稳 定，所 以杂交 反应结 束 后可 以用 高严 谨 条件洗 涤 降低 背景；c R N A：R N A酶 稳定 杂交 反应 结束后可 以用 R Na s e进 行酶解 除去 游 离的 R N A探针，以 降低 背景；杂交 效率 高，根 据 C o x 等(1 9 8 4)的计 算，探针浓 度在 2 n l 一6 g t a时，R N A探 针 的杂交 百 分 比是 D N A探 针 的 8 中科 院剖 新工 程 项 目、国家 97 3”项 目(G1 9 9 9 0 1 1 6)、国家 自然 科 学 基 金 项 目(3 0 1 7 0 0 9 4)和 中 国博 士 后 科 学 基 金 项 目资助。通 讯联 系。&l l h o r f o r o 0 础 作者简介：榇云远 男 3 8岁，副研究员 先后在兰州大学获学 士、硕士、博士学位，现为 中科 院植 物所博 士后，目 前主要从事植物发育的分子生物学研究。收穑 日期：2 0 o l 4)5 2 1 接受 日 期：2 0 0 1 4：6-1 0 责任编辑：刘晖 维普资讯 http:/ 维普资讯 http:/ 植 物学 通报 1 9卷 原位 杂交技 术基本 上包 括探 针标记、组 织 固定、包 埋、切 片、粘 片、脱 蜡、蛋 白酶 消化、乙酰化、预杂交、杂交、洗 片、免疫检 测、封 片、照 相这 些 步骤。我们 曾使用该 技术 分析 小麦 春化相关基因的表达模式，这里仅就应用 过程 中的一些细节和经验作一介绍，供同行参 考。l 探 针 的选择 为提 高探 针 的专一性，用 作转 录 R N A探 针 的 D N A片段应 与靶 序列 以外 的核 酸 序列 无 同源性，所 以在转 录之 前就应 考虑所选 序列 的特点。为使杂交 时探针 能顺利 到达 靶 序 列 附近，R NA探 针 长 度一 般 为 5 03 O 0个核 苷酸。考虑到组织切 片深层 细胞要 求探 针有 一定 的通 透性，表层 组织 可 能存在 靶 序 列 的不 足，所 以我们选用 长度为 1 0 0和 5 0 0个核 苷 酸 的 等摩 尔棍台 物，这 样 既 有一 定 的通 透性 又不 致 于使 D I G的密 度太低。如果 所得 D I G标记 R NA过 长，可 以温和碱水解 的办法达 到 所需 要求(S c h w a r z a c h e r a n d H e s l o p-H a r r i s o n，2 0 0 0)。考虑到对试剂盒 中 D IG-d U T P的充分利用，建议所 选模板 长度尽 可能接 近探针 的长度。所 以在合成 探 针时还要 考虑 的是模 板 长度。根 据实验 的需要，把将 要用 作 R N A探针 的模板 的 D N A片段构建 在适 当 的启动 子 中问(例如 T 7和 1 3之 间)，在探 针台 成之 前选 用 不会 产生 3 突出末端 的限制性 内切 酶在 T 7(或 r I 3)的下游 一定 长度 处进 行完 全酶 解 以对 质粒 进行线性 化，纯化后用 作 I 7 R N A聚合 酶(或 1 3 R N A聚台 酶)的模板。2 探 针 的 标 记 对 探 针的标 记 主要 是利 用放射 性同位素、酶 分子、荧 光 素、半 抗原或生 物素，这些标 记 物 的检 测 已经 十分完善，国内外 的一 些公 司都 有 相应 的试 剂盒可 用，也有 很多 专著和 文献 介绍(苏慧 慈，1 9 9 4；s p e e l m a t，1 9 9 9)。放 射性 同位素分 辨 率 的限制 和实 验 周期 较长、需 要 防护措施、标记 物不稳定 等缺 陷，所 以多用 于检测 固定 于膜上 的靶序 列。用 酶分子标 记 的探针 由于分 子太大、穿透力 差及对 温度 的要 求，所 以在 组织原 位杂交上 也不实 用。荧 光 素标记 检测方便，但存 在荧 光淬 灭问题，杂交后 的片子无 法长 久放置。考 虑以上 因素，生 物素和半 抗原成 为原 位 杂交 中探针 的首 选 标记 物。用 于 探针标 记 的半抗 原多种多样，象修 饰 的 嘌呤碱 基、嘧啶碱 基 和地 高 辛(I)i g o x i r t e n i n，D I G)，目前 最 常 用 的是 地高辛。生物素 本身 也是 一种半 抗原，但 由于它可 与抗生 物 素蛋 白(a v i d l n)或链 亲 和素(s t r e p t a v l d i n)有更 高 的亲 和力，所 以在 实 际应用 中多采 用 酶标 亲 和素。就地 高 辛和 生 物素两 种标记物 而言，前者有 更 高的灵 敏度 0 4 r(1 0 a N)(R i h a l，1 9 9 5)，所 以我 们 在 实验 中选用地 高辛为标记 物。3探 针 浓 度 在杂交 时，杂交液 中探 针 的浓 度要作适 当的调 整，因为 过 高不 但造 成 浪费 而且会 使 背景很深，所 以要对 合成 的探针 进行 浓度估 算。估 算方 法 是将 浓 度 已知 的标 准 品系列 和 系列稀释 的探针溶 液一起 点 在尼龙膜 上，按照 常规 的检 测 膜 表面 半 抗原 的方 法进 行免 疫 显色，通 过颜色深 浅 比较 浓 度 高低(图 2)。我 们 在 实 验 中选 用 0 2 n g t L的浓 度 杂 交 过 夜，证 实效果较 好。维普资讯 http:/ 2期 徐云远等：A原位杂交实用技术 2 3 7 4 粘 片 由于组 织切 片要在 水溶 液 中进 行数 十小 时的反 复处 理，因此 一 定要粘 片牢 固，同时要 严防 R N a s e污染 问题。我们 曾用 过两 家 公 司 的载 玻 片(S i g ma和 F i s h e r S c i e n ti fi c)，效 果 都 不 错。这些 载 片均经过 硅 化处理，表面 疏水 性 较 强，这 样在 展 片 时 不象 亲水 表 面那 样 方 便。可 以先 将 0 4 m L左右 的经 D E P C处 理 的 双蒸 水 加 在载 片上，把 蜡带 飘 浮 于水 上，待 4 5 q c 展 片后，拿起载 片稍为冷却 即可倾 去多余 的水。此时 由于蜡 带 和载 片 的疏 水性 很有 可 能在部分 蜡 带下 保 留-t J,水 珠，如不 除 去，直接 影 响粘 片效 果，甚 至在 杂 交前 的预处理 过程 中材料 就脱落 了。因此 可 以用 细针 尖在水 珠 处扎 一小 孔，用无 菌 的滤 纸尖 在此 孔处 吸 干水。另 外为 了粘 片牢 固，建 议在 4 7左右 的烤 箱 内或烫 板上 烤 片 3 64 8小 时。粘 片后通过 粗略镜 检，选 择组织 结构完 好、定位合适 的片子 进行后 面 的实验。粘片 时最好将 不 同处理 或不 同时期 的切 片放 在 同一载 片上，这样 会 使 杂交 结果 更有 可 比性，而且也 节省载 片。5杂 交 标 样藏 度 a t o o a nt 班白 f l d删饥 j 2n 0 _ O1 2唧 在 常规 膜 杂 交 中这 一 步 十 分 简 单，就 是 加 s t a n d l 上 杂交 液，然而 在 原位 杂 交 中应 考 虑 以 下 几个 因素：(1)温度，一般 原 位 杂 交 中 推荐 的 杂 交 温 撵针I 度在 3 7 5 5。在 我 们 的 实 验 中采 用在 5 0 忡 甲酰氨 中 4 2杂 交过 夜，温度 过 高会 影 响组 织桓针2 的结构。(2)杂 交 液用 量，杂 交液 的用 量 根 据组 岬 2 维普资讯 http:/ 植 物 学 通报 l 9卷 要先 用 R Na s e水解游 离 的探针。因此，建 议 以后 的操 作 环境 应 与前 面 的分 开。杂交后 洗 片必 不可 少，而 且戛反 复 多次，为 了减 少 劳动 量，提 高 效 率，可 以在 1 0 0 0 mL烧 杯 中进 行。切取一 大小合适 的包装 用 泡 沫 塑料，用 刀片 在 上面 划 几道 缝，将载 片的贴 标 签 端插 入 缝 I 中，这样可 容易地把 载 片悬 于 烧杯 内的 s s c溶 液 中，然 后 用 磁 力搅 拌器 缓 慢搅 动溶 液 即 可。图 3反义(A)和 正义(B)R N A探 针 杂交 结 果 Hg 3 l h e h y b ri d i z a ti o n r e s u l t s o f a n t l s e me(A)a n d s e r (B)p I D b e 7检 测 为 了节 省酶标抗体 用量，滴 加抗 体溶 液之前 先用滤 纸小心擦 干组织 周 围的溶液，再加 抗体溶 液覆盖组 织，这样可 以避免溶 液 向周 围扩散。用 N I g WB C I P进行 显色 时，首先 要 避 免光 照。显 色 时 间和 温 度、探针 量、靶 序 列 的 丰 度、底物浓度 等 因素都会影 响颜色 深浅。一般在 镜 检时 阳性信号 为 浅 红或 红棕 色 即可 停 止反应，进 行照相记 录结果。为了长期保 存并期 望在高倍 镜下得 到细胞 内的定 位，可 以按常 规 脱水、透 明、树脂 封 片，此时 阳性信号 变为蓝 色或蓝紫 色(图 3)。所 以如 果 要进行 组 织结 构对染，不 要 选用 蓝 色染料。在我们实验中由于杂交信号在细胞质 中，所以也尝试用苏木精作短暂衬染，酸性 乙醇分 色 以显示 细胞核，可 以明显分 开核与质 的着色 区别。总之，理 想 的结果 不但组织 结构 完好还 要背 景 干净、信 号 明 显，所 以从 固定 材 料到 洗 照 片，每一 步都要认 真对待，尤其 是粘 片要牢、避免 R N a s e污染。参考文献 苏慧慧 1 9 9 4 原位杂交北京：中国科学技术出版社 c呱 K H，DeLe o n D V，A L M，A HR C，1 98 4 a s y mme t ric P,NA 如脚B o，1 0 1；4 8 4 5 0 2 3 15 2 De t e c t i o f t o fmP,NA in s e aI 曲 慢I Ib 艚 b y n 5 v b d l z a fi o n u B g ca【I J G，P o x d u e H L，I 螂 f o t ma t l e a n dd e t e e t l o n o fR N A-D N A h v b r j dm o l e e de si n e y t do g i c a i 蛳P r o c A o 0 d蹦 品：3 7 8弼 1 I d u H A，B i r s fi e M L，J e sK W，1 9 0 9 删 一 DN A h y b ri d s址 t h e e y t do g i,l od N a t u r e 2 ：5 8 25 8 7 Rif m B，Bo tt i n M C，Co u a d s C，M I I e【N，1 9 9 5 Ev a t t l J O I1 0 f 0 阳t hb di I a n d d e t e c t i o n o f d 朗 b 呻 u de i e i d s Pa n t w0：0 D 1 mi目 c n th o d s a n d c q _ w i t h c b l u 目 哪 d JB Mmn 如Me t h o d s，3 0 1 0 3l l 2 S dr*-a r z a e h e rT，He do p-Ha r r i P嘲，P m e t i c a l 咖 皿 Ox f o r d：B【噔S e l e n fi fie P u b l i s h e r s ，45 s p o d E JM，Ho p ma nA H NK o mm i n o h h P，I 9 9 9 A m p l i fi t a l o n删 t oi l删 船 t h e s e n fi v l t y o f h y b r i d i z a t i o n：fl a y C AR D(S)a o d a e m r tt o n,4 7：2 8 12 8 8 维普资讯 http:/