发育·线虫·凋亡(2).doc

发育·线虫·凋亡
一个有关死亡之舞的科学故事
江华
　　你得跳舞呀！穿着你的红鞋跳舞，一直跳到你发白和发冷，一直跳到你的身体干缩成为一架骸骨。
——安徒生《红鞋
从任何意义上，秀丽广杆线虫(Caenorhabditis elegans)都是一种名副其实的美丽生物。显微镜下，它通身透明，纤细的身躯优雅的摆动，每一块肌肉的收缩与松弛的一览无余。当它进食时，作为食物的细菌被一口吞下后是如何通过消化系统进到五谷轮回之所的过程也宛若舞台上一幕鲜活戏剧。这种长不过1毫米的小生物有几个和人类关系密切的亲戚：蛔虫和蛲虫就是其中最大名鼎鼎的两个。不过，秀丽线虫本身和自然状态的人关系不大，它生活在土壤中，以细菌为食，被称为“自由线虫”。在有着多达2000万同宗兄弟的线虫家族中，它们一直默默无闻的过着无人打扰的幸福生活，千百万年来，除了少数线虫分类学家，我们对它们也不闻不问。

荧光显微镜下的秀丽线虫（图片来自）

　　然而，当进入20世纪70年代时，秀丽线虫的平静生活被一群发育生物学家打破。
一直到20世纪初，如何把握多细胞生物在胚胎期复杂的发育变化和调控一直是困扰研究生物个体发育的科学家们的难题之一，尤其是对于人这类高等动物来说，情况就更是如此。胚胎生长的本质是一个细胞不断分裂、迁移并在空间上发生巨大形态变化的过程，越是出生后形态复杂的生物，其发育中细胞间关系的变化也就越剧烈。此外，虽然所有细胞都来自于同一个受精卵，但从发育的较早时候开始，它们就走上了不同的分化道路，越到后期，要精确的说出每个特定位置上细胞的来历就越困难。根本上，发育的过程是一部生命发展的细胞历史。成体中每个细胞都有一段自己独特的历史，总括起来就构成了个体生命。对复杂生物发育的解读类似于对有悠久历史的古文明所进行的研究，史料千头万绪，细节纷繁，难以把握，有时甚至无从下手。显然，如何选取恰当的切入点，找出诸种复杂现象背后潜藏的共同规律就成为驾驭这部生命史的关键。

　　早在20世纪最初的20年中，甚至更早到20世纪的“上世纪”，人们就发现，如果把关注的焦点集中在相对简单的生物上则发育的现象难题可以得到部分解答。因为这些生物的细胞数量更少，分布相对单一，变化也较好观察。由于进化的原因，细胞生命在发育的基本模式方面具有相当大的同一性，所以利用位于生物复杂性阶梯较低级位置上的物种来研究发育共通规律是可能的。尤其是当在有不同发育特点的生物中发现共同形态形成和变化特征时，发育的普遍原理也就得以建立。因为对这些生物的研究具有帮助我们理解生命世界一般规律的意义，所以它们被称为“模式生物”。

海胆：发育研究的第一种模式生物

　　第一个被用作模式生物的是海胆（Sea Urchin），它的胚胎对早期发育生物学的发展有举足轻重的作用。早在1875年，奥斯卡·赫特维格（Oscer Hertiwig, 1849-1922）就开始以海胆为材料研究受精过程中细胞核的作用，1890年后，海胆更在受精和早期胚胎发育的研究中起了重要作用。1891年，汉斯·德瑞熙（Hans Driesh，1876－1941）在海胆中完成了海胆胚胎分裂实验，为现代发育生物学奠定了第一块观念里程碑。他在显微镜下把刚刚完成第一次分裂的海胆一分为二，结果发现，分开后的两个细胞各自形成了一个完整幼虫。这一实验的意义在于证明胚胎具有调整发育的能力，并使盛行一时的机械论发育思想完全破产。

海胆：胚胎发育的早期事件

　　稍后于海胆获得生物学家青睐的模式生物是苍蝇的亲戚——学名唤作黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）。它在近代生物学史上的地位显赫，这红眼睛黑肚皮的小东西曾经三度飞进卡罗林斯卡医学院的颁奖大厅，为主人取回诺贝尔生物医学奖桂冠（1933年摩尔根，1946年缪勒，1995年刘易斯、尼尔森－沃哈德和维斯郝斯）。由于它们繁殖迅速、染色体巨大且易于进行基因定位，因此自1909年摩尔根（Thomas Hunt Morgan，1866－1945）将之用作研究遗传变异和染色体关系的材料之后，果蝇就成为经典遗传学家揭示遗传规律的一张王牌。虽然1940年代后的30年中，更易进行分子生物学操作的大肠杆菌、酵母菌和噬菌体等微生物一度取代了它的辉煌地位，但1970年开始人们发现果蝇在胚胎发育图式的构建中具有特殊地位：它由14个体节构成的躯干完全对称，一套基因控制了这些体节从上到下的发生过程，后来的研究证明，这套基因普遍存在于从昆虫到人的基因组中，是决定机体左右对称布局形成的最基本因素。由此，果蝇再次引起人们的高度兴趣，其在遗传和发育研究模式生物中的地位又变得举足轻重起来。

果蝇：遗传学和分子发育生物学的国王
图中左侧为雌性，右侧为雄性

摩尔根：孟德尔遗传学的伟大继承者，果蝇之父

　　果蝇之后引起生物学家兴趣并在生物学研究中有过不俗表现的模式生物还有蟾蜍（非洲爪蟾，Xenopus laevis）、斑马鱼（Danio rerio）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）和我们今天谈论的秀丽线虫。

秀丽线虫：2002'诺贝尔生物医学奖的新宠。点击图片放大

　　线虫之所以能在经典模式生物的名单中占有一个重要位置和它的形态特点有密切关系。前面已经提到，线虫通身透明，观察十分容易。更为重要的一点是，它是唯一一个身体中的所有细胞能被逐个盘点并各归其类的生物。它的幼虫含有556个体细胞和2个原始生殖细胞，成虫则根据性别不同具有不同的细胞数。最常见的雌雄同体成虫成熟后含有959个体细胞和2000个生殖细胞，而较少见的雄性成虫则只有1031个体细胞和1000个生殖细胞。此外，线虫的生命周期很短，它从生到死的全过程只有3天半，这就使得不间断的观察并追踪每个细胞的演变成为可能。通过20年的努力，到90年代中期，人们已经建立了完整的线虫从受精卵到所有成体细胞的谱系图。这意味着，它机体里每一个细胞的来龙去脉都处于我们的视野中，清晰并且无所遗漏。

　　由于精子和卵细胞的形成（通常称为配子发育gametogenesis）是贯穿个体发育的主线，因此人们通常按照生殖系细胞的发育路线建立个体细胞的谱系。 这里涉及一个有关生殖系（germ line）的定义，它是指从受精卵到原始生殖细胞的分裂过程中，所有能形成配子（生殖细胞的另外一种说法）的细胞。众所周知，任何生物个体的细胞中都含有同样一套基因，但并不是所有细胞都能发育成配子。只有一类特殊的细胞能够形成生殖细胞，至于到底哪些细胞能够成为担负种系延续重任的幸运者，则是一件在受精之初就已经决定的事情：卵子中的一类特殊物质决定了细胞的命运。在线虫、果蝇和两栖动物，这类物质称为生殖质（germ plasm）。它们是位于卵子中离细胞核较远的一端的一些颗粒状物质，由蛋白质和核糖核酸（RNA）构成。

　　线虫的生殖质通常被称为P颗粒，对它的分配是通过一种不对称分裂实现的，这种分裂方式把它只分配到生殖细胞中，而不分配到注定要成为体细胞的姊妹细胞中。受精卵的第一次分裂产生一个含P颗粒的种系细胞P1和一个创建者细胞AB（founder cell,等同于哺乳动物中的干细胞，可以通过分裂形成其他构成机体组织的细胞，因为线虫成虫中没有类似干细胞的具有自我更新能力的细胞，所以用创建者细胞来命名）。P1继续分裂，P颗粒分配到种系细胞P2中，另一个细胞成为创建者细胞EMS。接下来进行的第三次分裂中，产生P3种系细胞和创建者细胞C。前者继续分裂形成生殖系的最后一个种系细胞P4，它最终形成两个原生殖细胞Z2和Z3，同时形成的还有创建者细胞D。到产生原生殖细胞时，幼虫发育就绪――556个体细胞已经完全从创建者细胞形成，可以从母体产出了。通过把分子中带有不扩散高分子葡萄糖的荧光染料注入创立者细胞，幼虫中每个部位细胞的家族史立时昭然若揭。

　　来自创立者AB的细胞后来分裂和分化出了389个细胞，它们构成了皮下、神经、咽肌、分泌腺和运动系统的一部分细胞。EMS则细胞再分裂为MS和E两个创建者细胞系，由MS细胞分裂成为包括体肌细胞、咽肌细胞、神经细胞和分泌腺细胞在内的80个细胞，E细胞的主要作用是发育成消化道的主体：20个肠细胞。构成神经系统的另外2个细胞则来自C细胞，此外，还有45个皮下和体肌细胞也是来自于C创建者系。最后，D细胞全部用于形成运动系统的20个体肌细胞。

雌雄同体秀丽线虫胚胎发育的细胞谱系图解
（仿Wolpert等，1998. 苡菥莼制图），点击图片放大

　　出生之后，线虫的发育还将继续，从形态上，还需要经过3次蜕皮，从细胞数量上，一些器官的细胞还要继续分裂，比如，肠细胞还需要多来14个才够，而表皮细胞也还需要继续分裂直到数量达到213个。在这个数量继续增长的时期，细胞最多时达到1090（雌雄同体，若是雄虫则为1179）。然而，我们前面已经提到，完全成熟的成虫只有959个细胞，那么，多出的131个细胞又到哪里去了？面对这个问题，大家最先想到的答案一定是“它们死掉了”。这答案不错，不过它们在这里死亡的方式很有点独特。

　　通常情况下，当我们说一个细胞“死亡”时，指的是病理性死亡，也就是坏死（necrosis）。这个字眼来自希腊文nekrōsis，本意即是“死亡”。之所以坏死是“病理性死亡”，乃因为它是由严重损伤导致的细胞结构和功能的崩溃。正常情况下，细胞借细胞膜和外界隔离，膜上各种调节大小分子进出的蛋白质就像一台台精巧的分子发动机：它们消耗能量把一些离子泵进细胞，又将细胞内不需要的物质排出门外，调节细胞内水分的含有量，使细胞既不干渴也不至于胀成水壶。对于维系细胞内环境稳定来讲，这些发动机的稳定运转至关重要。

细胞表面的分子发动机：通道和泵，点击图片放大

分子发动机：水和离子进出的精确调节器

　　当各种原因导致细胞缺氧、缺血时，细胞膜上的各种分子发动机就不再正常工作。这时候，不仅细胞功能赖以维继的膜内外离子浓度差无法保持，水也将不断从渗透压相对较低的膜外涌入。于是，细胞开始像气球一样肿胀起来，破裂。这个肿胀一直到破裂的过程不仅发生在分隔细胞和外环境的细胞外膜上，也同样发生在胞内有膜包裹的细胞器身上，而溶酶体酶一类的细胞器的破坏将使细胞制造来消化细菌和异物的各种酶类肆意横流，它们破坏细胞骨架、水解胞内各种蛋白质、销毁记录有遗传密码的机密文件……最后在显微镜下，原本富于秩序和美感的细胞形态完全消失，只剩下一团均匀的红色，那是被酶彻底消化的细胞残骸。有些时候，坏死还会像连锁反应一样蔓延，一个细胞破裂后溢出的酶直接洞开临近细胞的大门，于是更多细胞坏死，更多的酶出来……这样没完没了下去，常常导致严重后果，比如，我们在严重的坏死性肝炎中就可以看到这种惨况如大屠杀般的“大片状坏死”：清晰有序的肝小叶几乎完全消失，整个显微镜视野中是一片通红，肝脏的正常结构无影无踪。因此，坏死常常被看作是一个剧烈而严峻的细胞变化过程，若细胞有意识，它一定会用“惨烈，暗无天日”这类恐怖的词语来形容坏死。

　　左图：正常肝脏结构，肝小叶清晰，细胞完整。点击图片放大
　　右图：丙型肝炎，肝细胞明显肿大坏死，图中空泡样结构是水肿的肝细胞，深色黑点是开始或已经坏死的肝细胞。点击图片放大。

　　显然，若通过坏死来清除发育中多余的细胞是不明智的，那么，怎样做才恰如其分呢？看来一种受控制的，且加以严密保护的细胞消失方式是再好不过了。这正是在线虫发育中人们观察到的，那多出的131个细胞的死亡方式。它叫“凋亡”。

　　凋亡是对英文单词apoptosis的意译。Apoptosis也是一个希腊文来源的词语，它原本写作απτωστσ，apo 来自απο意为 from，而－ptosis则从πτωστσ获得语源，意为"fall"（落下）。在希腊人那里，这个字眼所表达的正是花儿凋谢，树叶落下的景色。古诗中“一叶落而天下知秋”的意象恐怕正是再好不过的一种意境：优雅，含蓄，还带点淡淡的忧伤。因了内敛而不张扬，更因为飘落时那种虽然有些无奈却坦然以受之的美，古往今来的国画家和诗人总不乏对之表达敬意的举动，正所谓“零落成泥碾作尘，只有香如故”。
正因为发育中细胞死亡表现出的那种含蓄和内敛的美，注定了凋亡会成为一个绝佳的名词。这一死亡的舞蹈首先从细胞核跳起。由蛋白质构成核仁率先崩解，变成一些可以被染料染成深色的斑块。而由DNA组成的染色质则向包裹它们的核膜聚集，逐渐形成一些状似新月的致密斑，最后完全压缩成为一整块。这个过程被病理学家称为“核固缩”。电子显微镜下面，可以清晰的看到折叠起来的DNA链的断裂。随着核固缩形成，细胞的体积也开始缩小，细胞骨架逐渐断裂，起支撑作用的脚手架的倒塌使靠它们维持张力的各种胞膜塌陷。胶质胞浆的压力使膜塌陷的方向只能向内进行，于是已经断裂并聚成一团的细胞核被分割包被起来，形成一团又一团类似肥皂泡一样的圆球。而细胞外膜的内陷则把各种有可能造成广泛损害的化学杀手——各种威力强大的酶类也包裹起来。在这过程中，细胞膜表明的各种蛋白质－糖天线的结构也随着膜的变化而改变起来。当这些改变被周围细胞探测到，身体中专事打扫卫生的巨噬细胞应声而动，赶来把这些已经变成凋亡小体的细胞碎片一一吞进腹中，最终完成一个温和而井然有序的细胞死亡过程。

线虫发育中细胞的凋亡：荧光显微镜图片，点击图片放大

　　有关发育中细胞死亡的形态学研究其实很早就被人们注意过。最早的记录来自1896年，那时的发育生物学家约翰·贝雅德（John Beard）已经在鱼类神经元发育中观察到了细胞的死亡现象。在他之后，1905年巴比芮（Barbieri），1906年科林（Collin）以及1926年恩斯特（Eranst）等相继在两栖类和鸟类发育中观察到了已发育细胞的退化和死亡现象。但是，一方面由于受细胞染色技术的限制，另一方面也因为此时人们的眼睛都紧紧盯在细胞发育进程本身的形态变化上，细胞的死亡被认做为一种无甚趣味的现象，毕竟，小小细胞的生死太过常见，又有什么要紧。发育中死亡的现象也就因此从主流生物学家的眼睛中消失了，这一消失就是50年。
事情的第一次转机出现在1965年，这一年，发育生物学家洛克辛（Lockshin）和威廉姆斯（Williams）提出，蝶类变态中，成虫出现是幼虫死亡的结果。由于这种死亡受到发育过程控制，对此他们给出了一个全新的概念：发育调节性死亡（development regulated death）。这个概念的重要在于，它第一次明确表达了主动和受控制细胞死亡的观念。而坏死的所指乃是细胞在各种损伤动因下发生的被动和不由自主的死亡。打个比方，如果说坏死是一件细胞谋杀案的话，那发育调节性死亡就是一桩自杀案。

　　在洛克辛等人提出这概念之后，并没有太多人把它当成一回事，不少人觉得这是个过于玄妙的想法，毕竟，细胞又不是有意识的人，哪里可能弄出自杀这等荒唐事体来。但也有科学家开始认真思考这个问题。这年稍后的时间里，英国阿伯丁（Aberdeen）大学的病理学家克瑞（Kerr）也发表了他在小鼠肝脏中发现的与坏死有本质区别的细胞死亡方式，他将之命名为渐进性坏死（necrobiosis）。以后的7年中，克瑞对这种迥然不同的细胞死亡方式产生了浓厚兴趣。在另一位病理科同事安德鲁·维利(Andrew H Wyllie)的协作下，他们对这种生理死亡现象做了细致深入的观察，详细而全面的描述了这过程中细胞形态的变化。长久的观察使他们发现，这种非坏死性细胞死亡不仅见于生物的发育过程，在免疫应答、抗肿瘤免疫以及较低程度的还不至于导致坏死的细胞损伤时都可以见到。这样，发育调节性死亡的称谓就有点不大合适了。正当Kerr在为如何给这种特别的死亡方式取名字时，同在阿伯丁大学的希腊语系教授Cormack听说了这件事情，于是他向Kerr建议使用apoptosis这个雅驯的希腊字眼。于是，凋亡这个词从此登上了生物学语言的历史舞台。

　　虽然Kerr等人的工作确立了一种全新的有关细胞生理性死亡的形态学理论。但很长一段时间里，却没有太多人对这一新学说加以重视。一则这理论还太单薄，形态学的简单陈述并不能提供现象背后的隐藏机制；其次，这时所发现的凋亡还仅仅只是一个存在于少数动物中的特殊现象，没有人意识到它到底对理解生命有多大意义。

　　然而，随着对发育和疾病研究的不断进展，人们逐渐发现，凋亡现象广泛的存在于各种生理和病理过程中。它和细胞增殖一道，为维护机体的正常运转提供最基本的保障：体内新细胞的产生总是伴随衰老细胞的凋亡，遭受损伤的细胞只有通过凋亡才能清除，更不用说危及生命的癌症在本质上也就是一种不正常细胞的清除不足。因此，进入80年代之后，有关凋亡机制的分子和细胞生物学研究不断升温，apoptosis也成为一个在各种医学和生物学文献中出现频率高得离奇的字眼。

凋亡：有秩序的细胞死亡之舞，点击图片放大

　　随着对凋亡好奇心的增长，人们越来越渴望了解细胞形态学变化背后的深层机制。恰当其时的，兴起于1960年代的分子生物学经过20年的发展，已经能为人们解决凋亡的分子医学问题提供足够的技术支持。由于凋亡是生物发育中具有基本性的细胞数量调控方式，因此它在从低等如原虫到高等如人类的各种动物的都普遍存在。从进化上讲，凋亡在分子水平上的调控机制也从而具有高度的保守性。换句话说，搞清楚简单生物细胞凋亡的机制就能开辟通向复杂生物发育调控的分子道路。

　　也就在这个时候，人们惊讶的发现，1972年由西德尼·布雷纳（Sydney Brenner）开创的以线虫为材料的研究道路为揭示凋亡的分子机制提供了一个绝佳视角。而约翰·萨尔斯顿（John Sulston）一手建立的线虫细胞谱系为嗣后罗伯特·霍维茨（Robert Horvitz）等人进行的凋亡基因研究提供了坚实基础。到1986年，有关线虫发育中凋亡的基因调控机制已经得到基本阐明。以线虫为起点，包括bcl、p53等在内的与人类细胞凋亡调控和癌症发生有密切关系的基因也陆续被发现。而发育生物学和医学中诸多领域的观念结构也随着凋亡及其相关机制研究的进展发生了根本改变。
由于线虫研究开创了一个对今日生物医学发展具有举足轻重的全新领域，同时也因为以线虫为基础的凋亡研究对基础和应用生物学产生的巨大推动作用，2002年11月，卡罗林斯卡医学院的诺贝尔奖评选委员会将本年生理和医学奖授予了西德尼·布雷纳、约翰·萨尔斯顿和罗伯特·霍维茨。

线虫生物学的开拓者：Sydney Brenner（1927－），点击图片放大

线虫生物学先驱：John Sulston（1942－）

线虫凋亡之父：Robert Horvitz（1947－）

主要参考文献：

1. Wopert L et al Principles of Development. Oxford: Oxford University Press, 1998

2. Hodgin J Sex,cell death, and the genome of C.elegans. Cell, 1999,98:277-280

3. Müller WA 发育生物学 施普林格－高等教育出版社 北京1998

4. 桂建芳 等 发育生物学 科学出版社 北京 2002