1、河南农业大学硕士学位论文磺胺嘧啶单克隆抗体的制备及其在免疫学检测中的应用姓名:杨继飞申请学位级别:硕士专业:兽医学指导教师:宁长申;张改平20090401摘要磺胺嘧啶(S u l f a d i a z i n e,S D)是人工合成的抗菌药物,具有抗菌谱广、价廉、使用方便的特点,被广泛用于畜牧业生产中。同时磺胺嘧啶药物具有诸多副作用,它可在动物体内残留,并通过动物源性食品借食物链以低剂量传递,直接威胁到人类身体健康。检测S D 残留的方法主要有高效液相色谱法、气相色谱法、联用技术、毛细管电泳法和免疫化学测定法等。免疫学分析技术以其灵敏、特异、快速、简便等优点在药物残留检测领域已被广泛应用。本
2、研究内容主要包括S D 人工抗原的合成:抗S D 单克隆抗体(M o n o c l o n a lA n t i b o d y,m A b)制备;S D 残留检测试剂盒研制和S D 残留胶体金试纸研制等方面。通过分析S D 分子结构和免疫原性,采用重氮化法将S D 偶联于牛血清白蛋白(B S A)和鸡卵清蛋白(o V r A),合成人工免疫原B S A S D 和包被抗原O V A S D,通过紫外扫描、S D S P A G E 和免疫小鼠后抗血清的E L I S A 鉴定,证明B S A S D 和O V A-S D 偶联成功。用B S A S D 免疫B A L B c 小鼠后,应用
3、细胞融合技术筛选出1 株高亲和力、高特异性杂交瘤细胞株(6 8 5 E 4)。用体内诱生腹水法制各S Dm A b。竞争E L I S A 测定其I C 5 0 为1 1 5 5p g L,与磺胺甲基嘧啶(S M l)的交叉反应性为0 8,与其它磺胺类同系物的交叉性均小于O 1。应用S Dm A b 研制出S D 残留竞争E L I S A 试剂盒,灵敏度为0 2 5 弘g L,线性检测范围为0 4u g L;试剂盒对尿样的平均回收率为1 1 8 5:对奶样的平均回收率为8 1 0 5;对肉样的平均回收率为8 8 4。研制的S D 残留胶体金试纸(S D-S t r i p),机读检测限为2
4、g r L,目测检测限为l O p g L。两种产品均具有快速、敏感、特异、简便等特点,适合于S D 残留快速检测的推广应用。关键词:磺胺嘧啶;单克隆抗体;E L I S A 试剂盒;胶体金试纸:残留6C H A R A C T E R I Z A T I o No FM o N o C L o N A LA N T I B o D I E SA G A I N S TS U L F A D I A Z I N EA N DI T SA P P L I C A T I o NI NI M M U N o A S S A YF o RR E S I D U E SD E T E C T I o
5、NS u p e r v i s o r:P r o f N i n gC h a n g s h e nP r o f Z h a n gG a i p i n gM a s t e rc a n d i d a t e:Y a n gJ i f e iA B S T R A C T:S u l f a d i a z i n e(S D)i sak i n do fs y n t h e t i ca n t i b a c t e r i a lm e d i c i n e,a n dW a su s e dw i d e l yi ns t o c k b r e e d i n g
6、f i e l dd u et ot h ev i r t u e so f w i d er a n g e,l o w e rc o s t,a n dc o n v e n i e n c et ou s e I t,s i m u l t a n e o u s l y,t h r e a t sh u m a nh e a l t hb yr e s i d u ei na n i m a l Sb o d ya n dt r a n s f e ri na n i m a-d e r i v e df o o d sb ym e a n so ff o o dc y c l e M
7、 a n n yd e t e c t i o na s s a y so fS Dr e s i d u e sh a v eb e e nd e v e l o p e ds u c ha sh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y(H P L C),g a sc h r o m a t o g r a p h y(G C),H y p h e n a t e dM e t h o d,C a p i l l a r yE l e c t r o p h o r e s i s(C E)a n di
8、 m m u n o c h e m i s t r y T h ei m m u n o l o g i c a la n a l y t i c a lt e c h n i q u e,w h i c hh a sm a n ym e r i t so fs e n s i t i v i t y,s p e c i f i c i t y,r a p i d i t ya n dc o n v e n i e n c e,h a sb e e ng e n e r a l l yu s e di nd e t e r m i n a t i o no fd r u gr e s i d
9、 u e si na n i m a lf o o d T h i ss t u d ya i m e da ti m m u n o l o g i c a lr a p i dd e t e r m i n a t i o no fS Dr e s i d u e si na n i m a lf o o d,i n c l u d i n gt h es y n t h e s i so fS Da r t i f i c i a la n t i g e n,p r e p a r a t i o na n ds p e c i a lp r o p e r t i e so fS D
10、m o n o c l o n a la n t i b o d y(S Dm a b)a n dr e a g e n tk i t s,t h ep r e p a r a t i o na n dq u a l i t yo fi m m u n o l o g i c a lg o l d-l a b e l e ds t r i p B a s i so na n a l y s i so fm o l e c u l a rs t r u c t u r ea n di m m u n o g e n i c i t yo fS D,t h ed i a z o t i z a t
11、 i o nW a su s e dt oc o n j u g a t eS Dt ob o v i n es e r u ma l b u m i n(B S A)a n do b t a i n e da r t i f i c i a li m m u n o a n t i g e n(B S A S D),t h ec o a t i n ga n t i g e nO V A-S DW a so b t a i n e di nt h es a m ew a y B S A-S Da n dO V A S DW a ss y n t h e s i z e ds u c c e
12、s s f u l l yb yi d e n t i f i c a t i o nw i t hu l t r a v i o l e ta n dS D S P A G E,a n t i s e r u mo fB A L B cm i c ei m m u n i z e dw i t l lB S A-S Dh a db e e ni d e n t i f i e db yi n d i r e c tE L I S A A f t e ri m m u n i z e dB A L B cm i c e 证mB S A-S D,o n eh y b r i d o m al i
13、 n e so f6 8 5-E 4 谢t hh i g l la f f i n i t ya n dh i g hs p e c i f i c i t yW a ss c r e e n e db yc e l lf u s i o n S Dm A bw a sp r o d u c e db yi n t r a p e r i t o n e a l l yi n j e c tc e l ll i n ei n t op r o s t a n es e n s i t i z e dB A L B em i c e T h em A bh a dag o o ds e n s
14、i t i v i t yw i t l l5 0 i n h i b i t i v ec o n c e n t r a t i o n(I C s o)o f1 15 5 g La n dO 8 c r o s s r e a c t i v i t y(C R)t os u l f a m e r a z i n e(S M I)a n dl i t t l eo rr i oC Rt oo t h e rc o m p o u n d sb yc o m p e t i t i v eE L I S A Ac o m p e t i t i v eE L I S Ak i t、析l0
15、 2 5 I t g Lo fs e n s i t i v i t ya n dO-4 p g Lo fl i n e a rd e t e c t i o nr a n g ef o rd e t e r m i n a t i o no fS D(S D-K i 0w e r ed e v e l o p e dw i t hS Dm A bo f6 8 5-E 4 T h ea v e r a g er e c o v e r i e so fS Di nu r i n e,m i l l【a n dm e a tw e r e118 5,8 1 0 5 a n d8 8 4 r e
16、s p e c t i v e l y Ar a p i dt e s ts t r i po fS D(S D S t r i p)w a sd e v e l o p e dw i t hS Dm A bo f6 8 5 一E 4 a n di t sd e t e r m i n a t i o nl i m i tw a s2 g Lb yB i o D o t-T S R 3 0 0 0,10 t t g Lb ye y e s T h es e n s i t i v i t y,s p e c i f i c i t y,s i m p l i c i t ya n dr e l
17、 i a b i l i t yo f S D-K i ta n dS DS t r i pw e r ep r o v e dt ob eu s e f u lf o rt h er a p i dd e t e r m i n a t i o no fS Dr e s i d u e si na n i m a lf o o d K e yw o r d s:S u l f a d i a z i n e;M o n o c l o n a la n t i b o d y;S D k i t;C o l l i o d a lg o l ds t r i p;R e s i d u e4
18、 9河南农业大学学位论文独创性声明、使用授权及知识产权归属承诺书学位论磺胺嘧啶单克隆抗体制备及其在免疫学检学位硕士文题目测中的应用级别学生杨继飞学科导师宁长申教授姓名专业预防兽医学姓名张改平研究员学位论文否如需保密,解密时间是否保密独创性声明本人呈交论文是在导师指导下进行的研究工作及取得研究成,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,文中不包含其他人已经发表或撰写过6J 研究成果,也不包括为获得河南农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过自l 材料,指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献士7 已在论文中做了明确的说明,并表示了谢意。参研究生签名:吻铋乃伽导师签名:Jr日
19、期:御年,月矽日日期彳够月夕j学位论文使用授权及知识产权归属承诺研究生签名:布耖锯名导师签名:例学院领导签名:,占二,:j?吼渊年t 月刁日胁御年夕月彩日瞧羼月房心j致谢值此论文完成之际,衷心感谢我的导师宁长申教授和张改平研究员三年来呕心沥血的培养。导师严谨的科研思路、实事求是的治学态度、渊博的学识和敬业精神和对科研工作敏锐的洞察能力是我毕生学习的楷模。在此,对导师三年来对我学术上的精心指导与生活上的关怀表示崇高的敬意和最衷心的感谢。衷心感谢河南农业大学导师组老师们的教育和关怀,向传授我知识的全体老师致以崇高的敬意!衷心感谢河南省动物免疫学重点实验室提供给我进修求学的机会!衷心感谢本实验室周玲
20、书记、邓瑞广研究员、杨艳艳研究员、李学伍博士、王自良教授、王选年教授、郭军庆博士、肖治军博士、职爱民博士、罗俊博士、郝慧芳博士、胡骁飞博士、郅玉宝副研究员、李青梅副研究员的悉心指导!衷心感谢张红博士、杨苏珍博士、范国英博士、乔松林博士、赵绪永博士、席俊博士、樊剑鸣博士、王方雨博士、赵银丽博士、权凯博士、冯春花老师、赵东、邢广旭、柴书军、刘庆堂、王建中、滕蔓、王丽、程娜、李清州、刘宣兵、万博、刘运超、李卓洋、田小辉、王秋霞、冯丽丽、张丽萍、张利娜、李乔木、鲍登克、职凌云、李小勉、姜亚兰、张丽等各位老师和同事的热心支持和帮助!感谢我的挚爱双亲和我的家人对我学习的理解、支持和关心,你们的付出是巨大的
21、!应当感谢的人还有很多,在此向在我学习、生活及论文完成过程中给予过我关心和帮助的所有老师、同学、同事还有朋友们表示忠心的感谢和真诚的祝福!第一章文献综述磺胺类药物是一类传统的人工合成抗菌药物,具有对氨基苯磺酰胺结构,与对氨基苯甲酸(P A B A)相似,二者竞争二氢叶酸合成酶,抑制细菌二氢叶酸的合成,影响细菌核酸生成,进而阻止了细菌的生长繁殖I l J。磺胺类药物抗菌谱广,价格低廉,自1 9 3 5 年发现以后,在控制感染性疾病中发挥了重大作用f 2 1。主要与二氨基嘧啶类抗菌增效剂合用,也可单独使用1 3 1。在畜牧业和兽医临床被广泛用于预防和治疗食源性动物疾病。其中磺胺嘧啶(S u l f
22、 a d i a z i n e,S D)一直是治疗多种传染病尤其是流行性脑膜炎的首选药物 4 1。S D 是使用量最大的磺胺类药物之一,也是残留问题最严重的兽药,由此导致的过敏、耐药菌株等问题已引起了广泛关注,过量使用S D 会导致在食用动物产品中残留,给人类健康带来潜在威胁【5 l。我国农业部第2 7 8 号公告明确指出了磺胺类M R L 在所有食品及动物体内为1 0 0 p g L,同时针对复方磺胺嘧啶钠注射液规定停药期为牛、羊1 2 d,猪2 0 d,弃奶期4 8 h:磺胺嘧啶片规定停药期为牛2 8 d;磺胺嘧啶钠注射液规定停药期为牛1 0 d,羊1 8 d,猪1 0 d,弃奶期3 d
23、。因此,建立一种快速、高效的残留检测方法势在必行。1 磺胺嘧啶简介1 1S D 的理化特性及临床应用1 1 1S D 的化学结构与理化特性S D 为白色或类白色的结晶或粉末;无臭,无味;熔点2 5 5-,2 5 6 C,分子式为C l o H l 0 N 4 0 2 S,分子量2 5 0 2 8 道尔顿,分子结构式见图1 1。S D 在空气中稳定,日光下色渐变深【6】。在乙醇或丙酮中微溶,在水中几乎不溶,它的钠盐易溶于水。具有酸碱两性,在强酸或强碱溶液中易溶,形成相应的盐。1 1 2S D 的药理作用与药动学特性Q N 峙o。图1 1:S D 分子结构式F i g 1-I:M o l e c
24、u l e rs t r u c t u r eo f S DS D 有抑制细菌生长繁殖的作用,对脑膜炎双球菌、肺炎链球菌、淋球菌、溶血性链球菌的抑制作用较强,对葡萄球菌感染疗效差。细菌S D 可产生耐药性。S D 排泄较慢,蛋白结合率较低(4 5),脑脊髓液浓度可达血清的7 0 1 7 1。其半衰期为1 7 h,为中效磺胺药【8 1。7S D 可竞争性地阻断敏感菌的利用对氨苯甲酸合成二氢叶酸,影响其核酸合成,发挥抗菌作用。抗菌谱广、作用强,对大多数革兰氏阳性和阴性菌都有抑制作用1 9】。药动学内服易吸收的S D 其生物利用度大小因药物和动物种类而异,一般而言,肉食动物内服后3 4 h 血药达
25、到峰浓度;草食动物为4 6 h;反刍动物为1 2,-一2 4 h,但尚无反刍机能的犊牛和羔羊对S D 的生物利用度与单胃动物和杂食动物相似【4】。主要在肝脏代谢并引起结构上的变化对位氨基(R 2)乙酰化,仍保持原有的毒性而且溶解度下降,从而增加了对肾脏的毒副作用。在排泄方面,内服难吸收的药物主要随粪便排出;肠道易吸收的主要通过肾脏排出;还有少量的以乳汁、消化液及其他分泌液排出。1 1 3S D 的临床应用抗菌谱广、作用强,对大多数革兰氏阳性和阴性菌都有抑制作用【1 0】,S D 血浆蛋白结合率低,易进入脑脊液中,是治疗流行性脑膜炎的首选药1 1 1。对呼吸道、肠道、尿道及皮肤软组织感染等均有较
26、好疗效。与增效剂T M P 联合应用,可大大加强疗效,缩短疗程1 1 2】。值得注意的是,在给家禽使时,一定要倍量使用碳酸氢钠,以使尿液旱碱性而利于尿酸盐的排出。S D 影响家禽肠道V K 和V B 的合成,因此饲料中应添加V K 和倍量的B 族维生素。产蛋鸡给予S D 时,可与碳酸酐酶结合,降低该酶的活性,从而使碳酸盐的合成减少,最终可导致蛋鸡产蛋下降,软壳蛋和破壳蛋的增加。磺胺药物对螺旋体、结核杆菌、病毒没有作用;对于立克次体,不仅不能抑制,反而可能促进其生长。1 2S D 的毒性作用S D 引起的过敏反应多见,并可表现为严重的渗出性多形红斑【13 1、中毒性表皮坏死松解型药疹、过敏休克、
27、热反应及肠出血掣1 4】,S D 还可致粒细胞减少、血小板减少及再生障碍性贫血变化。对肝脏损害可引起黄疸、肝功能减退,严重者可发生肝坏死,同时具有肾脏毒性【1 5】。可引起脑性核黄疸,因此禁用于幼眚以及妊娠期、哺乳期患病母畜(-3-穿透胎盘屏障、乳腺组织,从而感染胎而和幼畜)。S D 乙酰化物及原药本身在尿中溶解度较小,易析出结晶而损伤肾脏1 7】。1 3 动物性食品中S D 及磺胺类药物残留检测研究进展检测S D 残留的方法主要有高效液相色谱法19 1、气相色谱法、联用技术、毛细管电泳法【2 0 1、免疫化学测定法等【2 1,2 2 1。其中免疫化学测定法因为不需要昂贵的仪器并且相对简单的操
28、作近几年发展迅速,其中有代表性的酶联免疫实验和胶体金免疫层析技术发展的最为快速【2 3 1。1 3 1 高效液相色谱法高效液相色谱法洲是2 0 世纪7 0 年代逐渐发展起米的一项高效、快速的分析分离技术,现在使8用仍很广泛,对于高沸点、热稳定性差和相对分子质量大的药物原则上都可用高效液相色谱法进行分离、分析。由于其只能检测对紫外有吸收和本身能发射荧光的药物,限制了高效液相色谱法的应用【2 5 J。刘宏英等测定联磺甲氧苄啶片中磺胺嘧啶的高效液相色谱(H P L C)法,结果磺胺嘧啶质量浓度在5 1 0 0 p g m L 范围内与峰面积有良好的线性关系,r-0。9 9 9 9(n=5);平均回收
29、率为9 9 9 0,R S D 为0 3 2 6 1。张海琪等建立了一种液相色谱电喷雾串联质谱同时测定大黄鱼中2 0 种磺胺类药物残留的方法,方法的定量限为5 p g k g;以标准加入法计算回收率,在1 0-4 0 9 9 k g 添加范围内,平均回收率为7 9 6 0 o-1 0 9;相对标准偏差为3 5 5 0 o-1 6 5 l z 7 1。1 3 2 气相色谱法气相色谱法是一种经典的分析方法,具有操作简单、分析速度快、分离效能高、灵敏度高以及应用范围广等特点。使用气相色谱法,多种药物可以一次进样,得到完全的分离、定性和定量测定,再配置高性能的检测器,使分析速度更快,结果更可靠【2 引
30、。但因其技术含量高,操作程序相对复杂,且需要特定的试验条件和具有一定专业技术人员进行操作,一般不适用现场检测。另外,沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难以应用气相色谱法进行分析【2 9 1。单用气相色谱法检测S D 尚未见文献报道,多是和质谱连用。1 3 3 联用技术联用技术包括气相色谱质谱联用、液相色谱质谱联用等【3 们。气相色谱仪是质谱法的理想“进样器”,试样经色谱分离后以纯物质形式进入质谱仪,就可充分发挥质谱法的特长。质谱仪是气相色谱法的理想“检测器”【3,色谱法所用的检测器都有其局限性,而质谱仪能检出几乎全部化合物,灵敏度又高。由于G C M S 所具有的独特优点,目前已得到广泛的应用
31、。一般来说,凡能用气相色谱法进行分析的样品,大部分都能用G C M S 进行定性及定量测定。对于高极性、热不稳定性、难挥发的大分子有机化合物,使用G C M S 有困难,而液相色谱的应用不受沸点的限制,并能对热稳定性差的试样进行分离、分析。然而液相色谱的定性能力更弱,因此液相色谱与质谱的联用,其意义是显而易见的。液相色谱质谱联用对分析技术和仪器的要求高,但它是一种很有利用价值的高效率、高可靠性分析技术【3 2 1。赵晓凤等利用气相色谱一串联质谱法分析猪肉组织中的磺胺二甲嘧啶残留量,测定磺胺_ 二甲嘧啶的回收率为7 6 -1 1 0,检出限为0 0 1 m g k g l 3 引。1 3 4 毛
32、细管电泳法毛细管电泳非常适用于那些难以用传统的液相色谱法分离的离子化样品的分离与分析p 4 1。其分离效率可达数百万理论塔板数,操作简便,具有很大灵活性。许多分离参数,如缓冲液的组成和p H 值、毛细管的类型以及所使用电场的波形等都可以调=常。但毛细管电泳尚缺乏灵敏度很高的检测器,可利用的紫外检测器能检测几个p g,但因样品量只用几个n L 体积,故所用样品浓度限制9在m g L 级。因此,只有研究开发灵敏度更高的检测系统,毛细管区带电泳的优势才能充分发挥出来f 3 5】。邱涵等采用高效毛细管电泳法测定复方磺胺甲嗯唑片中磺胺甲嗯唑和甲氧苄啶的含量,磺胺甲嗯唑和甲氧苄啶线性范围分别为5 0 -2
33、 5 0g g m L(r=o 9 9 9 7)采I1 0 -5 0p g m L(r=o 9 9 8 6),平均回收率分别为9 9 0 和9 8 6 t 3 6 1。1 3 5 免疫学检测方法免疫学检测方法不仅能定量检测出动物体内微量的内源性或外源性化合物,并且能广泛地用于残留分析的某些领域。本法具有快速、方便、特异性好和灵敏度高等特点。常用的免疫学测定法有放射免疫测定(R a d i o i m m u n o a s s a y,R I A)【3 7 1、酶免疫测定(E n z y m ei m m u n o a s s a y,E I A)3 S l、荧光免疫测定(F l u o r
34、 e s c e n c ei m m u n o a s s a y,F I A)1 3 9 1 以及胶体金免疫层析技术(G o l di m m u n o c h r o m a t o g r a p h ya s s a y,G I C A)【4 0】。放射免疫测定是将抗血清与待测药物在试管中孵育一定的时间后,加入同位素标记的待测药物,该同位素标记药物即和待测药物竞争与抗体发生反应,采用适当的方法将被抗体结合的和未被抗体结合的标记药物分离,未被抗体结合放射性标记药物留在溶液中。荧光免疫测定是将抗血清、待测药物、荧光标记的待测药物混合在聚苯乙烯管中、经孵育后加入丫-球蛋白和分子量6 0
35、 0 0的聚乙二醇,使与之结合的待测药物和荧光标记的药物留在上清液中。当抗血清与荧光标记药物的量一定时,含待测药物多的试管中,抗体结合的荧光标记药物少,上清液中游离的荧光标记的药物就多。即待测物含量与游离的荧光标记物含量成正比,测定上清液的荧光强度,即可算出待测物含量。陆勤等建立牛奶中磺胺类抗生素残留检测的放射免疫方法,通过对磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺甲基异恶唑、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶和磺胺喹恶啉8 种磺胺类药物在空白牛奶样品中的加标试验,采用放射免疫法检测牛奶中的磺胺类抗生素,筛选水平可达到1 0 盹几,变异系数在1 7 9 0 0-5 5 6 之间
36、;对8 种磺胺类药物的混合标准溶液进行检测,1 0 0 可以被检测出,检测限达5 p g L 1 4 lJ。酶免疫测定是用酶标记抗原、半抗原或抗体而建立的方法。酶免疫测定1 4 2】可分为均相(h o m o g e n o u s)4 3 1 和非均相(h e t e r o g e n o u s)两种类型。在均相E I A 中可不需进行游离的和结合的标记物的分离而直接测定标记物。例如在某种条件下,抗原抗体反应后形成的酶标记抗原抗体复合物中的酶失去其对底物作用的活力,因而测出的酶活力直接反映游离的酶标记物。均相E I A 在临床检验中较少应用。非均相E I A 需先进行游离的和结合的标记物
37、的分离。这种同相酶免疫测定方法在1 9 7 1 年最初建立时称为酶联免疫吸附剂测定(E n z y m eL i n k e dl m m u n o s o r b e n tA s s a y,E L I S A)。E L I S A 的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在同相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性,酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性,义保留酶的活性。在测定时,受检标本(测定其中的抗体或抗原)与同相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方1 0法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体,也通过反应而结合在固相载体上。此
38、时同相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后,底物被酶催化成为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高,间接地放大了免疫反应的结果,使测定方法达到很高的敏感度。E L I S A 具有特异性强、灵敏度高、方便快速、分析容量大、分析成本低、安全可靠等优点,故在国内外得到了快速发展,药物残留的E L I S A 检测更是成为一个研究的热点。但E L I S A 也有其局限性和不足之处,如开发需要投入较多的资金和时间,得到一个好的抗原并不容易,对试剂的选择性高,很难同时分离多种成分,对结构类似的化合物有一定的交叉
39、反应等。沈红等通过制备多克隆抗体,建立的磺胺甲嗯唑残留检测试剂盒的检测线性范围在O 1 n g m 1 一1 0 p g m L 之间,5 0 抑制率检测限为2 2 5 3 n g m L t“l。免疫荧光是根据抗原抗体反应的原理,先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物,再用这种荧光抗体(或抗原)作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素,利用荧光显微镜观察标本,荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光(黄绿色或桔红色),可以看见荧光所在的细胞或组织,从而确定抗原或抗体的性质、定位,以及利用定量技术测定含量。吴国娟等利用热敏感性水凝胶作
40、为S D M 多克隆抗体载体,通过异硫氰基荧光素(F I T C)标记S D M 全抗原,建立一种快速的荧光免疫分析法测定S D M。S D M测定的线性范围在1 n g m L-1 0 0 p g m L,6 0 抑制率时检出限为0 1 1 4 p g m L l 4 引。免疫胶体金技术是以胶体金为标记物,利用特异性抗原抗体反应,在光镜电镜下对抗原或抗体物质进行定位、定性乃至定量研究的标记技术。近年来,胶体金免疫层析技术亦被引入免疫化学检验领域,胶体金免疫层析技术是以微孔膜为固相载体,其原理是将已知的特异性抗原(或抗体)固定于膜上作为检测带,胶体金标记物干燥在玻璃纤维的结合释放垫上,其一端与
41、膜相连,另一端与样品垫相连,膜的另一端连有吸水垫。当加入液体样品(全血、血清、尿或其他体液)后,样品通过毛细管的扩散作用向前移动,并通过含标记物的玻璃纤维,使标记物重新水化,并与胶体金标记物相互反应,然后一起向前泳动,至检测线(固定有特异性抗原或抗体),这样标记物与待测物的复合物会被检测线截获,而出现明显而直观的红色结果。如果样品中不含待测物,则会和游离标记物一起越过检测线,到达控制线或试验终l :线(来判定试验的终止时间)。多采用夹心法检测抗原或间接法检测抗体m】,也有采用双孔间接法或反流免疫层析法检测I g C 和I g M,对于小分子抗原来说则宜采用竞争抑制法w n。张明等制备抗磺胺甲嘿
42、唑多克隆抗体,制成快速检测试纸条。对S M Z 标准溶液的灵敏度达到5 0 n g m L l 4 引。免疫学检测方法不仅能定量检测出动物体内微量的内源性或外源性化合物,并且能广泛地用于残留分析的某些领域。同时具有快速、方便、特异性好和灵敏度高等特点,因此受到广泛的关注。l l2 目的及意义迄今为止几乎所有常用的单个磺胺药己用各种的方法制备了人工抗原和抗体,并对牛奶、血清、鸡肉等组织样品进行了实际测定,方法简便,灵敏度高,具有很高的实用价值。但近年单抗技术的应用,单克隆抗体在检测限等主要指标上比多抗表现出明显的优势,而且单抗在试剂的标准化以及抗体的大量供应上也明显优于多抗,检测上可以降低背景吸
43、收,排除“桥”抗体的干扰,因此,近年来应用日益广泛,单抗技术在药残检测上的应用是主要的发展方向。本研究以期通过实验建立磺胺嘧啶残留的E L I S A 检测方法和胶体金试纸检测方法,为磺胺嘧啶的检测、监控提供一种快速、简便、灵敏的检测手段。3 技术路线本实验拟采用的技术路线如下:S D 分子结构分析,根据可能的偶联位点设计半抗原合成路线l载体蛋白的选择及与半抗原的偶联l免疫B A L B c 小鼠L制备单克隆抗体,并进行抗体纯化LE L I S A 检测试剂盒条件筛选及优化,设计组装E L I S A 检测试剂盒、LE L I S A 检测试剂盒的检测指标测定L检测试纸的选材及条件优化,设计组
44、装胶体金检测试纸 L胶体金检测试纸的检测指标测定L实验室符合检验1 2第二章磺胺嘧啶人工抗原的合成与鉴定S D 由于分子量只有2 5 0 2 8 道尔顿,属于小分子,只有反应原性而无免疫原性,是半抗原。要通过动物免疫制备小分子半抗原的抗体,需要先将之与载体蛋白质偶联得到完全抗原才可以用丁二动物免疫试验。本试验的目的就是将S D 与载体蛋白B S A 及O V A 连接并鉴定,分别制备人工免疫原与包被原,为以后动物免疫以及单抗筛选打下基础。1 材料与方法1 1 材料与设备本论文中所用试剂除特别说明的以外均为分析纯试剂;实验用水均为实验室自己制备双蒸去离子水(D D W)。S D,美国S i g
45、m a 公司;B S A,美国A m r e s c o 公司;O V A,美国A m r e s c o 公司;亚硝酸钠(N a N 0 2),W a k o 日本和光纯药公司;磷酸盐、碳酸钠、氯化钾、碳酸氢钠、氯化钠等,上海生物试剂公司:透析袋,购于北京经科宏达生物公司;可调移液器,E p p e n d o r f 公司;A E 2 6 0 电子分析天平,瑞士M e t t l c r 公司;N D 1 0 0 0 紫外连续扫描可见分光光度计,美国N a n o d r o p 公司;高速冷冻离心机,美国B K M A N 公司;J Y-6 0 0 C 电泳仪,北京君意仪器有限公司;S
46、Z 9 3 自动双重水蒸馏器,上海亚荣生化仪器厂;低温冰箱,日本S A N Y O 公司。1 2 方法1 2 1 载体蛋白的选择蛋白质结构复杂,具有良好的免疫原性,是半抗原连接的首选的优良载体,目前常用的载体蛋白主要有牛血清白蛋白(B S A),卵清蛋白(O V A),兔血清白蛋白(R S A),人血清白蛋白(H S A),匙孔血蓝蛋白(K L H)等。本实验最终选用B S A 和O V A 做为偶联蛋白。1 31 2 2 载体蛋白与S D 的偶联磺胺嘧啶有芳香氨基,可采用重氮化法将其连接到蛋白质上的酪氨酸残基上酚羟基的邻位,进行偶联制备免疫抗原,连接原理见图2 1。为了避免蛋白质变性及其生物
47、活性的损失,药物或半抗原等与蛋白的交联应尽可能采用具有中等反应活性的试剂,在温和的条件下进行。将5 m gS D 溶解到4 m L0 5 m o l LH C L 溶液中,先升温到3 7 助溶,待完全溶解后降温至4,得到溶液A。取l m L1 0 m g m L 的N a N 0 2 溶液,冰浴条件下降温到4 C,得到溶液B。然后将B 溶液缓慢加入A 溶液中,得到溶液C。4 C 避光反应2 4 h,其间缓慢搅拌。取2 5 m g 牛血清白蛋白,溶解到2 0 毫升生理盐水中,得到溶液D,降温到4 备用。将C、D 溶液放4 冰箱中,将溶液C缓缓加入到溶液D,其间不断搅拌。4 C 避光搅拌2 4 h
48、。反应完毕后用N a O H 溶液调p H=7 0,收集反应好的溶液于透析袋中,4 C 避光对生理盐水透析4 8 h,每4 h 换一次透析液。透析完毕后1 2 0 0 0 r p m4 C 离心2 0 m i n 收集上清液分装,2 0 保存。包被原O V A 与S D 的连接方法同上,只是O V A 的投入量为3 5 m g。1 2 3 紫外扫描鉴定D N o N卜1o 一峙D 吲董(s D 和壤体蛋f 1 砭物)o图2-1:载体蛋白与S D 的连接原理图F i g 2-l:T h ep r i n c i p l ef i g u r eo fe o n e c t i o nb e t
49、w e e nc a r r e r i e rp r o t e i na n dS D用P B S 精确配制S D、B S A 和O V A 的标准溶液,然后分取一定量的B S A S D 连接物和O V A S D 连接物,用N a n o D r o p 伞_ 波长紫外扫描仪测得B S A、O V A、S D、B S A-S D 和O V A S D 的紫外吸收曲线。根据最大吸收峰是否偏移以及波形是否变化来判定S D 于载体蛋白的偶联是否成功。1 2 4S D S P A G E 凝胶电泳鉴定1 4D配制好各种电泳溶液,安装电泳扳后分别灌制分离胶和浓缩胶,分离胶浓度1 2,浓缩胶浓度5
50、,待完全凝固后安装电泳槽,加注电泳缓冲液。样品I O p L 加L 样缓冲液1 0 u L 后沸水加热5 m i n 月j 微量上样器上样。打开电泳仪,调整浓缩胶电压到8 0 V 观察蓝线进入分离胶后调整电压至1 0 0 V。电泳完毕后,考马斯亮蓝染色3 舶,置脱色液中过夜脱色。2 结果与分析2 1 全抗原的合成反应过程中,当N a N 0 2 溶液加入A 溶液中时渍调口H 后颜色会有加深。用生理盐水透析4 8 h 后2 2 全抗原的鉴定2 2lS D S P A G E 凝胶电泳鉴定溶液缓慢变为浅黄色。反应完毕后用N a O H 溶仍显示黄色表明已经连接上。样品上样量均为2 g 电泳结果见图