quechers方法检测肉中36种兽药.pdf

采用LC/MS/MS结合改进的QuEChERS方法对动物源食品中的36种兽药进行筛查作者Jin-Lan Sun，Chang Liu，Yue Song安捷伦科技（中国）有限公司，上海，200131，中国Jian-Zhong Li安捷伦科技（中国）有限公司，北京，100102，中国应用简报食品检验和农业摘要本应用简报介绍了一种改进的QuEChERS 方法，可对食品中的四类兽药磺胺类、大环内酯类、喹诺酮类和氯吡多进行筛查。改进的QuEChERS 方法包括一个萃取盐包（4 g Na2SO4+1 g NaCl）和一个分散SPE 试剂盒（50 mg PSA、150 mg C18EC 和900 mg Na2SO4）；萃取溶剂采用含1%乙酸的乙腈。采用该方法萃取这四类兽药均可获得满意的回收率。采用LC/ESI/MS/MS，在动态多反应监测（DMRM）模式下对这些兽药进行定量分析。方法得到的检出限符合这四类兽药的各MRL 要求，并且平均回收率超过50%，因此满足常规分析的需要。2前言QuEChERS 方法最初用于水果和蔬菜中的农药萃取1。QuEChERS 操作分为两个步骤，萃取/分配和分散SPE（d-SPE）。在第一步中，乙腈作为萃取溶剂；使用硫酸镁和盐促进分配/萃取。在第二步中，采用d-SPE 去除萃取物中的基质干扰。d-SPE 的材料一般包括N-丙基乙二胺（PSA）、封端C18（C18EC）和石墨化碳黑（GCB）。通过验证，QuEChERS 方法已被用于多种样品基质的处理。相比于水果和蔬菜，本文涉及到的动物源食品样品需要在d-SPE过程中采用PSA 和C18EC 去除这类样品中增加的蛋白质和脂类干扰。本文分析的兽药不需要使用QuEChERS 缓冲盐，即原AOAC或EN QuEChERS 方法系用于萃取pH 不稳定农药的盐。本方法由于其高选择性和高灵敏度，在分析复杂食品基质中痕量级的目标农药时非常耐用和快速。与固相萃取（SPE）相比，QuEChERS 方法会带来更多的基质干扰，因为它是一种“刚好够用”的样品制备技术。因此，需要高选择性的仪器，如使用带DMRM 检测模式的LC/MS/MS 对兽药进行简便准确的分析。采用本文描述的LC/MS/MS 方法，动物源食品中的36 种兽药可以在9 min 内实现有效的分离。本法联用快速QuEChERS 萃取，减少了大量操作步骤和分析人员的时间，为常规工作中兽药的筛查提供了一个可靠的方法。实验部分试剂与标准品所有试剂和溶剂均为HPLC级或者分析纯。甲醇（MeOH）和乙腈（ACN）购自Honeywell 公司（马斯基根，密歇根州，美国）。甲酸（FA）和乙酸购自Sigma-Aldrich 公司（圣路易斯，密苏里州，美国）。溶液和标准溶液将1 mL 甲酸加入100 mL ACN 中，混匀，制备1%甲酸ACN 溶液，每天新鲜配制。将1 mL 乙酸加入100 mL ACN 中，混匀，制备1%乙酸ACN 溶液，每天新鲜配制。标准溶液制备的浓度为10 g/mL（磺胺类和大环内酯类）、5 g/mL（氯吡多）和1 g/mL（喹诺酮类）。仪器与材料配备二极管阵列检测器的Agilent 1260 HPLC（安捷伦科技有限公司，加利福尼亚州，美国）。带有AJST 电喷雾离子源的Agilent 6460 三重四极杆液质联用系统（安捷伦科技有限公司，加利福尼亚州，美国）。Agilent Bond Elut QuEChERS 硫酸镁（部件号5982-8082）Agilent Bond Elut 氯化钠（部件号5982-5750）Agilent Bond Elut PSA（部件号5982-8382 或5982-5753）Agilent Bond Elut C18EC（部件号5982-1382 或5982-5752）Agilent Bond Elut SAX（部件号12213042）Agilent Bond Elut NH2（部件号12213021）药物残留分析用Agilent Bond Elut d-SPE（部件号5982-4956）Agilent Bond Elut QuEChERS 不带缓冲盐萃取试剂盒（部件号5982-5550）Agilent ZORBAX Solvent Saver HD Eclipse Plus C18，3.0 100 mm，1.8 m 色谱柱（部件号959757-302）3仪器条件HPLC条件色谱柱：安捷伦ZORBAX Solvent Saver HD Eclipse Plus C18，3.0 100 mm，1.8 m流速：0.5 mL/min柱温：30 C进样量：5 L流动相：A：H2O 0.1%甲酸B：ACN梯度程序：时间%A%B0.090100.590101.080204.075258.040609.059512.059512.1901015.09010MS 条件极性：正极干燥气温度：300 C干燥气流量：7 L/min雾化器压力：50 psi毛细管电压：3000 V鞘气温度：350 C鞘气流量：10 L/min扫描模式：DMRM 样品制备样品匀浆空白的猪肉、牛奶、蜂蜜和鸡蛋样品购自当地一家杂货店。样品洗净并剁碎（视需要），然后于-20 C保存。萃取取2 克（0.05 g）各样品（视需要匀浆），置于50 mL 离心管中。向样品中加入200 L 兽药标准溶液，使浓度分别为10 ng/g（磺胺类和大环内酯类）、5 ng/g（氯吡多）和1 ng/g（喹诺酮类）。加入4 mL 水，涡旋样品1 min。每管中加入10 mL1%乙酸ACN 溶液。盖上离心管并涡旋1 min。将萃取盐（4 gNa2SO4，1 g NaCl）加入各管中。样品管加盖并且剧烈振摇1 min。在4 C 下以5000 rpm 的速度离心5 min，放置30 min。分散SPE取6 mL 上层ACN 相，转移至装有50 mg PSA、150 mg C18EC和900 mg 无水Na2SO4的15 mL 试管中。将试管盖紧，涡旋1 min，然后以5000 rpm 的速度离心5 min。将4 mL 上层ACN 相转移至另一试管中，40 C 下氮气吹干。用1 mL ACN/H2O 溶液（2:8）复溶样品残渣，然后以10000 rpm 的速度离心10 min。将上层相溶液转移至自动进样瓶中。结果与讨论色谱条件优化Agilent 1260 Infinity 二元液相色谱系统在600 bar 的最高压力下可快速获得极高质量的数据结果。结合使用Eclipse Plus C18亚2 m 填料色谱柱，该分析系统可以改善分离度，缩短分析时间，提高检测灵敏度，这些改进对于兽药筛查都极为重要。Agilent6460 MS/MS 系统具有高检测灵敏度，先进的六极杆碰撞池可以消除背景噪音和交叉污染，并且创新的动态多反应监测（DMRM）方法在LC 分离过程中即可根据每个分析物的保留时间窗建立离子对列表。基质标准溶液中36 种兽药（磺胺类和大环内酯类10 ng/g、氯吡多5 ng/g 和喹诺酮类1 ng/g）的LC/MS/MS 分离状况见图1。每种化合物的MS 条件见表1。4图1.兽药的MRM 提取离子流图5表1.MRM transitions和MS 操作参数编号保留时间化合物名称母离子碎裂电压（V）定量离子定量碰撞能量（V）定性离子定性碰撞能量（V）11.24磺胺脒215.080108.020156.0922.75林可霉素407.2150126.030359.01532.68氯吡多192.111010125873042.78磺胺醋酰215.07092.019156.0352.97磺胺嘧啶251.1100108.022156.01063.1马波沙星363.0120320.19345.11773.11甲氧苄啶291.2150123.022230.12283.15磺胺噻唑256.0100108.021156.0993.23诺氟沙星320.0140276.113302.117103.26氧氟沙星362.0140261.126318.114113.27磺胺吡啶250.1100156.010184.014123.36环丙沙星332.1130231.042314.118133.52磺胺磺胺甲嘧啶265.112092.030172.013143.57达氟沙星358.2140255.046340.122153.76恩氟沙星360.0130316.218342.118164.05磺胺二甲嘧啶279.1120124.018186.014174.2磺胺甲二唑271.0100108.022156.010184.27磺胺甲氧嗪281.1125108.022156.014194.38磺胺对甲氧嘧啶281.1120108.026156.014204.43沙氟沙星386.1140342.114368.118214.57二氟沙星400.0140356.118382.118224.91螺旋霉素843.5200101.046174.042235.07磺胺间甲氧嘧啶281.1120108.026156.014245.54磺胺氯哒酮285.0100108.022156.010256磺胺多辛311.112092.030156.014266.21磺胺甲噁唑254.110092.026156.010276.45替米考星869.6250174.050696.445286.65磺胺异噁唑268.1100113.010156.010296.83奥索利酸262.1100216.030244.013307.12红霉素734.5170158.130576.314317.21磺胺苯酰277.180108.022156.06327.34磺胺地索辛311.1125108.026156.017337.36磺胺喹沙啉301.111092.029156.011347.37泰洛星916.5240101.054174.042357.96罗红霉素837.5170158.038679.418368.28氟甲喹262.0150216.030244.0136萃取和分散SPE 参数的改进在初始评价阶段，我们使用安捷伦Bond Elut 无缓冲盐和用于药物残留的Bond Elut QuEChERS d-SPE 试剂盒。在方法开发期间，我们发现有必要改进操作步骤。这些改进可以使回收率满足常规分析的要求，详情如下所述。这个方法已成功应用于如下样品基质的处理：肉类、蜂蜜、蛋类和奶类。萃取步骤的优化首先，药物残留的d-SPE 过程（150 mg C18，900 mg MgSO4）在方法1、2、3 和4（表2）中使用，以评价萃取步骤改进的效果。萃取盐包QuEChERS 方法使用MgSO4去除样品中的水分。实验表明，MgSO4的使用对许多化合物的回收率有负面影响，尤其是磺胺类和大环内酯类药物。用Na2SO4替代MgSO4，并且离心后将样品静置30 min，可以有效地吸收水分2。结果表明，用Na2SO4替代MgSO4，可以提高磺胺类和大环内酯类药物的回收率（表2中的方法1 和方法2）。萃取溶剂在萃取步骤中，还对水/乙腈的比例进行了评价。结果表明，萃取步骤中，采用比例为1:2 的水/乙腈时，其回收率较比例为1:1时的好（表2 中的方法2 和方法3）。肉类基质的许多样品制备技术中常用酸去切断化合物-蛋白质的结合，这会直接影响其回收率。通常用于这种目的的酸是甲酸和乙酸3。经比较表明，采用含1%乙酸的乙腈溶液处理样品的回收率大于采用含1%甲酸的乙腈溶液的处理效果。（表2 中的方法3和方法4）。在四个方法的评价中，林可霉素的回收率都很低。推测是由于林可霉素具有强极性（log P=0.56），限制了乙腈对它的萃取。表2.萃取步骤的不同方法优化结果方法1234萃取盐MgSO4+NaClNa2SO4+NaClNa2SO4+NaClNa2SO4+NaCl分散SPE 混合物C18EC+MgSO4C18EC+Na2SO4C18EC+Na2SO4C18EC+Na2SO4萃取溶剂1%甲酸乙腈溶液1%甲酸乙腈溶液1%甲酸乙腈溶液1%乙酸乙腈溶液水8 mL8 mL4 mL4 mL大环内酯类药物的平均回收率22.95%43.66%45.12%70.46%磺胺类药物的平均回收率10.86%25.96%33.25%54.35%喹诺酮类药物的平均回收率86.79%47.69%62.69%64.44%氯吡多的平均回收率55.12%38.02%49.89%65.37%7d-SPE的优化当考察改进的d-SPE 过程提高基质干扰去除的效果时，使用的盐包括了吸附基质中的蛋白质和脂类的C18EC 吸附剂4，和去除水分的无水Na2SO4。改进参数包括PSA（方法1 和2）、SAX（方法3）和NH2（方法4）。在QuEChERS 方法中，PSA、NH2和SAX 因其阴离子交换特性已被用做d-SPE 材料。它们与基质中的极性有机酸、糖类和脂肪酸等酸性干扰有强烈的相互作用。表3.分散SPE 参数优化结果方法12345萃取盐Na2SO4+NaClNa2SO4+NaClNa2SO4+NaClNa2SO4+NaClNa2SO4+NaCl分散SPE 混合物50 mg PSA+150 mg C18EC+900 mg Na2SO4100 mg PSA+150 mg C18EC+900 mg Na2SO450 mg SAX+150 mg C18EC+900 mg Na2SO4100 mg NH2+150 mg C18EC+900 mg Na2SO4300 mg C18EC+900 mg Na2SO4萃取溶剂1%乙酸乙腈溶液1%乙酸乙腈溶液1%乙酸乙腈溶液1%乙酸乙腈溶液1%乙酸乙腈溶液水4 mL4 mL4 mL4 mL4 mL大环内酯类药物的平均回收率54.57%42.23%59.87%33.70%66.10%磺胺类药物的平均回收率64.37%63.27%77.35%51.71%71.80%喹诺酮类药物的平均回收率73.88%88.34%76.82%97.03%84.66%氯吡多的平均回收率85.12%100.11%71.57%70.27%91.17%8表3 的结果表明，方法1 和5 实现了最好的回收率，它们分别采用了添加或不添加PSA 的C18EC。我们的目的是可以找到一个适用于我们所有样品基质的d-SPE 处理方法。因此，在d-SPE 过程中使用PSA 非常重要，因为它可以去除蜂蜜基质中普遍存在的有机酸和糖。最终选择的d-SPE 参数为50 mg PSA、150 mgC18EC 和900 mg Na2SO4。其它样品基质除了肉类基质，本方法也成功用于蛋类、奶类和蜂蜜基质样品的处理。这些基质样品的回收率良好，满足常规兽药定量分析要求（附录I）。结论采用改进的QuEChERS 方法，结合使用LC/MS/MS，可以成功实现省时的动物源基质样品中磺胺类、大环内酯类、喹诺酮类和氯吡多兽药的筛查。本文优化的最佳QuEChERS 组成为：4 g Na2SO4、1 g NaCl 作为萃取盐，乙腈（1%乙酸）作为萃取溶剂，d-SPE 过程中使用50 mg PSA、150 mg C18EC 和900 mg Na2SO4。改进的QuEChERS 方法回收率满足常规兽药筛查的要求。参考文献1.M.Anastassiades,S.J.Lehotay,“Fast and EasyMultiresidue Method Employment AcetonitrileExtraction/Partitioning and Dispersive Solid-PhaseExtraction for the Determination of Pesticide Residues inProduce”,J.AOAC Int.,86,412-431(2003).2.George Stubbings&Timothy Bigwood,“The developmentand validation of a multiclass liquid chromatographytandem mass spectrometry(LC/MS/MS)procedure forthe determination of veterinary drug residues in animaltissue using a QuEChERS(QUick,Easy,CHeap,Effective,Rugged and Safe)approach”,Analytica Chimica Acta,637,68-78(2009).3.Jerry Zweigenbaum，et al，“使用三重串联四极杆液质联用仪和动态多反应监测功能（DMRM）进行复杂样品中农药多残留的快速定性定量分析，采用安捷伦分析方法包和农药化合物参数数据库进行快速而高效的方法开发”，安捷伦科技有限公司，应用简报，出版号5990-4253CHCN4.Angelika Wilkowska&Marek Biziuk“Determination ofpesticide residues in food matrices using the QuEChERSmethodology,”Food Chemistry,125,803-812(2011).更多信息这些数据代表了典型的结果。如需了解更多有关我们产品和服务的信息，请访问我们的网站 萃取管50 包与试管4 g Na2SO4，1 g NaCl5982-4950分散SPE50-15 mL 试管50 mg PSA，150 mg C18EC，900 mg Na2SO45982-00329附录1.采用改进的QuEChERS 方法处理四种基质中兽药的回收率和LOQ化合物保留时间（min）肉类的回收率（猪肉）%肉类的LOQ（猪肉）（ng/g）蛋类的回收率（%）蛋类的LOQ（ng/g）奶类的回收率（%）奶类的LOQ（ng/g）蜂蜜的回收率（%）蜂蜜的LOQ（ng/g）林可霉素2.712.610.01210.770.01312.740.0187.180.025螺旋霉素4.975.310.81345.570.29374.460.47654.720.431替米考星6.599.430.085106.670.130161.030.14466.400.184红霉素7.126.100.02739.760.01736.670.01325.600.030泰洛星7.468.290.08347.080.12669.180.52463.890.145罗红霉素8.086.830.01595.170.00896.420.00771.190.017磺胺脒2.723.960.67843.950.71942.160.33946.590.127磺胺醋酰2.750.150.50075.500.29372.040.28970.660.457磺胺嘧啶2.950.780.42075.140.02565.350.04366.620.060甲氧苄啶3.083.710.02683.220.00983.530.01382.720.014磺胺噻唑3.137.410.13359.150.09457.370.11653.090.113磺胺吡啶3.246.220.03770.500.02963.070.03564.500.024磺胺磺胺甲嘧啶3.454.980.37368.240.10663.830.05266.890.060磺胺二甲嘧啶3.945.700.20669.760.04461.040.02469.420.035磺胺甲二唑4.133.430.46064.390.13658.590.08154.690.228磺胺对甲氧嘧啶4.141.960.02571.820.01059.340.02260.480.022磺胺甲氧嗪4.240.360.03975.350.06670.400.12368.040.097磺胺间甲氧嘧啶4.950.130.11374.100.07764.100.08971.370.101磺胺氯哒酮5.348.260.12471.890.10763.970.10866.320.042磺胺地索辛5.858.760.02976.940.01348.330.01569.930.020磺胺多辛5.850.910.03274.450.07464.350.06069.930.032磺胺甲噁唑6.045.820.13576.800.07269.800.05071.150.077磺胺异噁唑6.551.230.15472.430.05666.840.05168.770.160磺胺苯酰7.155.370.03573.000.03847.340.02062.960.040磺胺喹沙啉7.351.060.07373.890.03551.430.03069.250.093氯吡多2.775.690.05678.790.03978.260.03781.130.020诺氟沙星3.266.371.58772.833.84655.252.70371.680.469氧氟沙星3.257.100.10246.760.11449.680.07467.190.079环丙沙星3.3107.171.37038.300.08248.530.00759.340.110达氟沙星3.656.260.05355.680.03130.230.64179.000.526恩氟沙星3.760.820.17954.610.07149.820.14376.530.102沙氟沙星4.456.041.08793.790.58857.330.22772.750.667二氟沙星4.569.740.34060.400.06562.270.15785.530.222氟甲喹6.879.341.29968.910.24447.871.38984.740.121奥索利酸8.272.962.00076.201.33356.730.51886.550.382马波沙星 年5 月4 日，中国印刷5991-0013CHCN