固相萃取技术(Solid Phase Extraction)_58页.pdf

1固相萃取技术固相萃取技术(Solid Phase Extraction)SPE的发展 SPE原理 SPE实用技术 SPE方法的建立和优化2静置1minSPE 的发展发展历程发展历程 1971年，Broich等人从尿中提取滥用药物时首次使用液-固萃取(Liquid Solid Extraction)一词。1979年，St Onge等首次定义固相萃取（首次定义固相萃取（Solid-Phase Extraction）。1983年，以以Waters公司公司 Sep-Pak系列为代表的各类商品化小柱进入市场系列为代表的各类商品化小柱进入市场，使固相萃取法有了长足的进步。3分析物干扰物柱预处理样品添加柱洗涤分析物洗脱SPE柱及配套装置柱及配套装置（1）固相萃取附件）固相萃取附件自然淋洗（简易支架）自然淋洗（简易支架）加压（注射器）加压（注射器）加负压（真空装置）加负压（真空装置）4SPE柱及配套装置柱及配套装置（2）96孔板孔板高通量的SPE产品，每孔含少量吸附剂（10-100mg），样品载量约2ml/孔。主要用于生物，医药等行业小量的多样品的净化处理。SPE柱及配套装置柱及配套装置（3）自动化固相萃取装置）自动化固相萃取装置SPE方法的优点方法的优点 高样品回收率和良好的重现性高样品回收率和良好的重现性 萃取过程简单快速，易于多样品平行操作萃取过程简单快速，易于多样品平行操作 样品更干净样品更干净 易于自动化，提高分析效率易于自动化，提高分析效率 降低溶剂的消耗降低溶剂的消耗5萃取过程连续萃取，每萃取一次需要的柱长称为 一个塔板高度，一个固相萃取柱的萃取次数为5-20次SPE概念及基本原理概念及基本原理 概念概念：固相萃取法是利用选择性吸附与选择性洗脱的液相色谱法分离原理，使液体样品通过一吸附剂，保留其中某一组分，再选用适当溶剂冲去杂质，然后用少量溶剂迅速洗脱，从而达到快速分离净化与浓缩的目的。SPE概念及基本原理概念及基本原理 目的：目的：?从试样中除去对以后的分析有干扰物质；?富集痕量组分，提高分析灵敏度；?变换试样溶剂，使之与分析方法想匹配；?.6SPE概念及基本原理概念及基本原理SPE基本原理SPE基本原理?原理与原理与HPLC法类似，区别如下：法类似，区别如下：SPE柱的填料粒径（40m）比HPLC（310m）大；SPE柱是一次性使用。SPE组成分分离，HPLC单组分。原理 溶质、溶剂分子竞争吸附（溶质、溶剂分子与吸附剂的关系）流动相体积固定相体积容量因子吸附系数量平衡时流动相中组分质量平衡时固定相中组分质度平衡时流动相中组分浓度平衡时固定相中组分浓VcVakqpkcaK=1分子间相互作用：X=X斥+X引 X=X定+X诱+X色+X氢 斥：排斥力位能场；定：定向力位能场；诱：诱导力位能场；色：色散力位能场；氢：氢键力位能场。7（1）、定向能（定）产生偶极矩如果分子中具有电负性不同的原子时，则有可能产生正负电荷中心不相重合的现象，所带电荷与正负电荷中心间距离的乘积即为偶极矩。1、2分别为两分子的偶极矩，K:Boltzmann常数，:绝对温度，r:两分子之间的距离。z:在溶液中，每个溶质分子（）被z个溶剂分子有效包围ZkTrXBA62232=0.741,2,3-三甲苯0.371,2,4-三甲苯01,3,5-三甲苯偶极矩8（2）、诱导能（诱）产生诱导偶极矩 具有永久偶极矩的性分子对邻近分子会产生诱导作用，产生诱导偶极矩。被诱导的分子可以是极性的，也可以是非极性的。：永久偶极矩：极化率（偶极矩的电场力作用下，分子中电子云对分子骨架本身变形的程度）r:两分子之间的距离62121rXA=62212rXB=62221rXBA+=诱ZaarXAA)(1226溶剂溶剂诱+=80.8环已烷80.1苯沸点化合物9（3）、色散能（X色）产生非极性分子之间的作用能。非极性分子的偶极矩虽然等于零，但是电子在围绕分子骨架运动的过程中，正负电荷中心的瞬间位置是不同的，因而形成同步电场，使邻近分子极化。极化后的分子又反过来加剧瞬间偶极矩变化的幅度，从而产生分子间的作用能。这种通过分子中电子摄动产生的作用能，被称为色散能。它与温度无关。I：分子电离能。它反映了分子对外层电子的制约能力。212121623IIIIrX+=色ZIIIIrXAAA溶剂溶剂溶剂色+=623（4）、氢键作用能（氢）直接与电负性强的原子（如F,O,N等）联接的氢原子，由于负电荷集中在X-H键的原子上，氢原子的核又无内层电子的屏蔽，故当其与另一电负性强的原子接近时可产生强烈的相互作用。这个作用力产生的力场就称之为氢键位能场。10醇、酸化合物烷烃硝基苯酚、羟基苯酚的三个异构体二甲酚异构体不同溶质（药物）的吸附效率CLCLCLCLCLCLCH3OPSONO2CH3O净化净化淋出曲线淋出曲线 表5 2g活性碳/Cilete545（1：4）柱淋洗曲线表5 2g活性碳/Cilete545（1：4）柱淋洗曲线淋洗体积ml 淋出百分率%r-666甲基对硫磷淋洗体积ml 淋出百分率%r-666甲基对硫磷05510101551511520474720252 2 25300.52314,96 360316,245 386342,299 262244,202 Ciprofloxacin Danofloxacin Enrofloxacin Sarafloxacin Flumequine 1.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.0011.00Time0100%0100%0100%0100%0100%图 4.2.3 空白猪肝样品的 MRM 图 2.50 5.00 7.50 10.00 Time 0 100%0 100%spiked 1:MRM of 2 Channels ES+332 288 1.34e6 4.51 spiked 1:MRM of 2 Channels ES+332 245 6.48e5 4.49 2.50 5.00 7.50 10.00Time 0 100%0 100%spiked 2:MRM of 2 Channels ES+358 314 1.16e6 5.29 spiked 2:MRM of 2 Channels ES+358 96 7.18e5 5.29 2.50 5.00 7.50 10.00 Time 0 100%0 100%spiked 3:MRM of 2 Channels ES+360 316 7.50e6 5.87 spiked 3:MRM of 2 Channels ES+360 245 2.50e6 5.85 （1）（2）（3）2.50 5.00 7.50 10.00 Time 0 100%0 100%spiked 4:M RM of 2 Channels ES+386 342 3.40e5 6.69 spiked 4:M RM of 2 Channels ES+386 299 2.52e5 6.70 2.505.00 7.50 10.00 Time 0 100%0 100%spiked5:MRM of 2 Channels ES+262 244 1.14e7 spiked5:MRM of 2 Channels ES+262 202 2.53e6 9.52 9.52 （4）（5）图 4.2.4 添加猪肝样品中五种 QNs 的 MRM 图（添加浓度 2.5g/kg）依次为：（1）环丙沙星（2）丹诺沙星（3）恩诺沙星（4）沙拉沙星（5）氟甲喹 332288,245 24SCX 离子交换柱 原理A+B+S A+S+B+例4：梨中吡虫啉的残留分析梨皮 提取称取5 g样品于均质器中加入50 mL乙腈，50 mL 5的氯化钠水溶液,100mL正己烷，均质3 min，净化1 提取液转移到抽滤漏斗中，用30 mL乙腈洗涤均质器，滤渣三次，将抽滤瓶中的液体倒入分液漏斗中，用乙腈洗抽滤瓶并将溶液倒入分液漏斗中。将下两层液体接到圆底烧瓶中，弃去正己烷层。将乙腈和水混合液旋蒸，蒸除乙腈。将剩余的水溶液转移到分液漏斗中，向其中加入0.5 mL 6 N HCL,用50、50、50二氯甲烷萃取三次，萃取液过装有无水硫酸钠的漏斗于圆底烧瓶中，浓缩，氮气吹干。25净化2 SCX填料在pH2的盐酸溶液中浸泡8小时后晾干，称取1g填到柱中。（用H+置换Na+）先用10mLpH2的盐酸进行平衡柱，而后将用甲醇溶解的样品上到SCX柱上。用甲醇淋洗。弃去1-2mL 收集36mL的流出液。浓缩至1mL后过0.45m微孔滤膜，用HPLC进行检测。梨中吡虫啉的残留分析梨果肉 提取准确称取10 g样品于均质器中，向其中加入100 mL甲醇，均质3 min，提取液转移到抽滤漏斗中，用30 mL甲醇洗涤均质器，残渣三次，合并滤液。净化1 滤液转移至分液漏斗中，向分液漏斗中加入100 mL 5的氯化钠水溶液，摇匀，再加入100 mL正己烷振荡萃取，待静置分层后，取下层于另一分液漏斗中，向其中加入 0.5 mL 6 N HCL,用70、70、50二氯甲烷萃取三次，二氯甲烷萃取液过装有无水硫酸钠的漏斗于圆底烧瓶中，浓缩，氮气吹干。26净化2 依次用乙酸乙酯、环己烷、乙酸乙酯各5 mL淋洗Envicarb柱，用乙酸乙酯将浓缩样品上样于Envicarb柱上，以10 mL乙酸乙酯淋洗，收集于KD浓缩瓶中，浓缩，吹干，用甲醇准确定容于 1 mL，待检测。Minutes246810121416mAU-2024Detector A-270 nmELJW-2blank002 果皮空白样品果皮中吡虫啉的测定Minutes246810121416mAU-2024Detector A-270 nmELJW-2tj-4001 果肉空白样品果肉中吡虫啉的测27（三）高分子聚合物（三）高分子聚合物 聚苯乙烯/二乙烯苯为基质 具有高纯度，高比表面的特点，比硅胶基质更强的吸附性。代表产品：1）Waters Oasis HLB(Hydrophilic-Lipophilic Balance)2）Cleanert PEP（Polarity Enhanced Polymer）特点：对各类极性、非极性化合物都具有均衡的吸附作用。（二）高分子聚合物（二）高分子聚合物28（二）高分子聚合物（二）高分子聚合物 相对于硅胶键合填料的优点相对于硅胶键合填料的优点-PEP(HLB)：极性官能团的引入，使材料对亲水型和亲酯性化合物具有均衡吸附。极性官能团的引入，使材料对亲水型和亲酯性化合物具有均衡吸附。-PCX（MCX)/PAX(MAX):进一步引入离子交换集团；混合机制（混合机制优点：可通过两种不同溶液的洗涤（混合机制优点：可通过两种不同溶液的洗涤-更干净的样品更干净的样品-灵敏度）灵敏度）更宽泛的pH值适用范围（1-14）29例5：固相萃取-HPLC法测定蜂蜜中残留的1O种磺胺类药物磺胺标准品：磺胺嘧啶、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶磺胺甲噻二唑、磺胺甲氧嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺甲基异嗯唑、磺胺二甲基异 唑、磺胺喹嗯啉 难溶于水，较易溶于稀酸、稀碱和有机溶剂。提取 1O.O0 g样品于5OmL的具塞离心瓶中 加入5mL 5的乙醇一水溶液涡旋混匀 加入15mL三氯甲烷，旋涡混匀3min，离心3min，转移三氯甲烷于另一磨口离心管中，残渣用1OmL三氯甲烷提取1次，合并三氯甲烷。将三氯甲烷于40下浓缩至干，加入4mL10的碱性氯化钠溶液混匀溶解残渣。加入5mL磷酸二氢钠缓冲液，于旋涡混合器上混匀2O s。30样品净化 活化好的Oasis HLB固相萃取柱 上述混匀后的溶液在减压条件下样液过固相萃取小柱 待样品溶液过柱完成后，加15-mL超纯水淋洗，抽真空5min，用5mL乙腈洗脱于试管中。将乙腈洗脱液于40水浴中高纯氮气流浓缩至干，流动相溶解并定容至1 mL，0.45m的微孔滤膜过滤供液相色谱分析分析 流动相：A为0.O1 molL磷酸水溶液，B为乙腈：AB二元梯度洗脱程序：05 min(A与B体积比85：15)，510 min(A与B体积比75：25)，1014 min(A与B体积比65：35)，最后回到初始条件；流速1.0 mLmin；柱温45；紫外检测波长270 nm。各组分均在15min内出峰。10种磺胺类药物样品添加浓度为0.01mgkg，谱图的信噪比均大于10。因此，在本方法操作条件下10种磺胺类药物定量下限为0.005 mgkg，当试样称样量为10.00 g，定容量为1mL时，检出限为0.5gkg。其检出限标准图谱31（四）混合型及专用柱系列（四）混合型及专用柱系列 混合型填料混合型填料解决多样品成分及复杂基质的净化问题。C8/SCX,PestiCarb/NH2 专用柱：专用柱：针对特定样品专门开发的SPE产品SUL-5(磺胺专用柱),HXN（磺酰脲专用柱）DNPH专用于汽车空气质量检测（一一）PestiCarb/NH2 SPE产产品品 产品介绍产品介绍：由等量的石墨化碳（PestiCarb）和氨基（NH2）装填而成，用于检测日本肯定列表中的200多种农药（方法参考日本厚生劳动省颁布的GC/MS 农药等同时检测方法（农产品）和LC/MS 农药等同时检测方法I（农产品），同时可用于提取净化检测谷物中405种农药（方法可参考GB/T 19649-2005）样品前处理方法样品前处理方法：甲苯/乙腈=3：1预淋洗，上样后，甲苯/乙腈=3：1洗脱。Pesticides in food productsPesticides in food productsConcentration on(hot)water bath Dissolve in 1 ml isoC8/toluene Analysis via GC/MSConcentration on(hot)water bath Dissolve in 1 ml isoC8/toluene Analysis via GC/MS32Application Chem ElutPesticidesAdd water to 5 g or 10 g of dryor water containing sample(sum 10 ml)?Homogenize with 20 ml methanol;if necess.filtration or centrifugation?Add NaCl solution to an aliquot and soak ChemElut?Elution with dichloromethane;Evaporate to dryness?Reconstitute in methanol/water(final sample concentration 1 g/ml)?Pass through a 0,45 m syringe filter?chromatography on 5 cm x 2 mm RP18-column,LC-MS/MS in MRM modeWork performed by Lutz Alder and Jeannette Klein,BgVV BerlinAnalytical MethodApplication Chem ElutPesticidesRecoveries of 109 pesticides Lemon with ChemElut at 0.01 mg/kg12481021162120140010203040n.m.0-20%20-40%40-60%60-80%80-100%100-120%120-140%140-160%160-180%180-200%200%number of pesticidesWork performed by Lutz Alder and Jeannette Klein,BgVV BerlinResults of recovery experiments例6：蔬菜中氨基甲酸酯类药物 残留分析 三种溶剂对黄瓜中氨基甲酸酯类药物的提取回收率（%）提取溶剂 提取液颜色 甲硫威 恶虫威异丙威 甲萘威 克百威 仲丁威乙腈 浅绿 94.6 93.8 96.1 93.2 95.0 97.2 甲醇 绿 94.2 96.4 96.3 94.9 93.5 97.7 丙酮 绿 95.8 95.5 93.7 92.9 94.6 95.3 ONHOONHOONHOONHOSOONHOOOONHO33ENVI-Carb/LC-NH2 SPE柱净化 5mL乙腈、10mL甲苯预淋洗SPE，10ml乙腈/甲苯（20/80）溶解上样后，再用5ml乙腈/甲苯（20/80）洗涤，10mL乙腈/甲苯（80/20）洗脱。表 4.4.4 SPE 洗脱实验 ENVI-Carb/LC-NH2（500mg/500mg）5mL 乙腈 活化 10mL 甲苯 上样 各 10ng 混标溶于 10mL 乙腈/甲苯（20/80）5mL 乙腈/甲苯（20/80）5mL 乙腈/甲苯（30/70）5mL 乙腈/甲苯（40/60）5mL 乙腈/甲苯（50/50）5mL 乙腈/甲苯（60/40）5mL 乙腈/甲苯（70/30）5mL 乙腈/甲苯（80/20）5mL 乙腈/甲苯（90/10）洗脱 5mL 乙腈 01020304050607080901000510 1520 2530 35 4045 5055 6065 70 7580 8590 95100105乙腈体积比%累积回收率%恶虫威克百威甲萘威异丙威仲丁威甲硫威5.47 6.24 7.65 1.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00Time5100%5100%5100%5100%5100%5100%图 4.4.3 添加黄瓜样品中氨基甲酸酯类药物的 MRM 色谱图（添加浓度 5ng/g）4.31 4.43 4.72 恶虫威 克百威 甲萘威 224167 224109 222165 222123 202145 202127 异丙威 仲丁威 甲硫威 194137 19495 208151 20895 226169 226121 1.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00Time5100%5100%5100%5100%5100%5100%常用的固相萃取填料常用的固相萃取填料 按保留机理分为：?正相正相:Silica,NH2,CN,Diol,Florisil,Alumina?反相：反相：C18,C8,NH2,CN等等?离子交换：离子交换：SCX,SAX,COOH,NH2等等?混合型混合型：PCX,PAX等等34相 相的极性 名称 十八(烷)基，封端 强极性 C18 封端 十八(烷)基 强极性 C18 辛基 极性 C8 乙烷基 弱极性 C2 环己基 弱极性 CH 苯基 弱极性 PH 丙基氰 极性 CN 二醇 极性 2OH 硅石 极性 SiOH 羧甲基 弱阳离子交换剂 CBA 氨丙基 弱阴离子交换剂 NH2 丙苯，磺酰 强阳离子交换剂 SCX 三甲胺丙基 强阴离子交换剂 SAX SPE在残留分析中的应用SPE方法的建立1.杀虫剂：有机氯、有机磷、有机氮、拟除虫菊酯非极性或弱极性水溶性差可被极性吸附剂吸附，易被洗脱蔬菜中的共萃物（干扰物）白菜、卷心菜、油菜、韭菜、菠菜叶菜尖椒、黄瓜、番茄、茄子果菜胡萝卜根菜品种类型白菜、卷心菜、油菜、韭菜、菠菜叶菜尖椒、黄瓜、番茄、茄子果菜胡萝卜根菜品种类型 色素：叶绿素，类胡萝卜素、番茄红素，辣椒红素 油脂、蜡质 酚类 脂肪酸类35不同蔬菜的不同蔬菜的GC-MS总离子流色谱图总离子流色谱图油菜、番茄、尖椒、韭菜和胡萝卜;提取溶剂:丙酮/二氯甲烷(4:4,V/V)1 OHC(CH3)3 3-叔丁基苯酚 Sim:810 M.W.150 2 OHC(CH3)3C(CH3)3 2,5-二叔丁基-4-甲基-苯酚Sim:734 M.W.220 3 OHC(CH3)3OCH3 3-叔丁基-对甲氧基-苯酚 Sim:718 M.W.180 4 COOH(CH2)14CH3 正十六酸 Sim:744 M.W.256 5 COHO(CH2)7CHC HCHCH(C H2)5C H3 9,11-二烯-十八酸 Sim:731 M.W.280 6 COHO(CH2)4COOCH2CH(CH2)3CH3C2H5 己二酸-2-乙基单己酯 Sim:687 M.W.258 7 CCH(CH2CH2CCH)4CH2CH2CHC(CH3)2 三十碳六烯 Sim:741 M.W.410 8 (CH2)5CONHH3COOH 辣椒素 Sim:727 M.W.305 36 OH 菜油甾醇 Sim:703 M.W.400 OH 谷甾醇 Sim:711 M.W.414 OO 豆固醇酯 Sim:722 M.W.456 各种蔬菜中所含的基质干扰物主要包括各种蔬菜中所含的基质干扰物主要包括：小分子干扰物(1-3):(烷基酚类)出峰时间为8-15min；M.W200，含量较小,分布不集中,会对分子量较小的农药产生干扰（如有机磷）。脂肪酸（4-8）：出峰时间15-30min、200M.W400，含量大,分布集中,会对大多数农药产生干扰。大分子干扰物（9-11）：(色素、谷甾醇、菜油甾醇和豆固油酯)30-40min之间，分子量M.W400，含量大,分布不集中会干扰菊酯类农药的检测。同时由于沸点高、难以气化会对仪器造成污染。柱层析法优化柱层析法优化 选用四大类型41种农药标准品有机氯-666，-666，-666，-666，O,P-DDT;P,P-DDT;P,P-DDE;P,P-DDD;-硫丹，-硫丹有机磷甲胺磷，敌敌畏，氧乐果，甲拌磷，乐果，二嗪农，磷胺，久效磷，甲基对硫磷，杀螟松，倍硫磷，水胺硫磷，甲基异柳磷，杀扑磷，丙溴磷，三唑磷氨基甲酸酯涕灭威，灭多威，叶蝉散，残杀威，仲丁威，呋喃丹，抗蚜威，3-OH呋喃丹，西维因拟除虫菊酯氯氰菊酯，氰戊菊酯，溴氰菊酯37叶菜类蔬菜中农药多残留分析方法的研究使用叶菜类蔬菜中农药多残留分析方法的研究使用SPE的策略的策略 选用叶菜品种以甘蓝、生菜、韭菜作为代表样本 净化目的 主要除去叶绿素的干扰 净化方法 柱层析 改良、确定适合的吸附剂和淋洗液 直接用柱层析筛选条件过程繁琐对净化方法的研究对净化方法的研究 薄层色谱法初步选择吸附剂、淋洗液 特点：操作简单，结果直观点样位置混合吸附剂示意图单一吸附剂示意图薄层色谱法吸附植物色素的研究混合溶剂混合溶剂体积比体积比展开结果叶绿素和农药是否分开展开结果叶绿素和农药是否分开丙酮/乙酸乙酯丙酮/乙酸乙酯2:82:8农药在前沿，几乎与叶绿素在同一位置农药在前沿，几乎与叶绿素在同一位置1:33:71:11:33:71:1农药在前沿，叶绿素基本被吸附在活性炭层农药在前沿，叶绿素基本被吸附在活性炭层丙酮/二氯甲烷丙酮/二氯甲烷1:22:31:22:3不易观察结果不易观察结果石油醚/乙酸乙酯石油醚/乙酸乙酯10:110:1农药未见展开农药未见展开石油醚/丙酮石油醚/丙酮10:110:1农药未见展开农药未见展开石油醚丙酮/乙酸乙酯石油醚丙酮/乙酸乙酯1:41:51:41:5农药和叶绿素未分开农药和叶绿素未分开38净化净化叶绿素吸附率叶绿素吸附率过柱前叶绿素总含量过柱前叶绿素总含量过柱后叶绿素总含量过柱后叶绿素总含量色素吸附率色素吸附率=100%过柱前叶绿素总含量过柱前叶绿素总含量叶绿素总含量叶绿素总含量=叶绿素叶绿素A含量 叶绿素含量 叶绿素B含量叶绿素含量叶绿素A含量含量 Ca=12.7A663 2.69A645叶绿素叶绿素B含量含量 Cb=22.9A645 4.68A663其中其中A663、A645为为663nm、645nm波长下的吸光度波长下的吸光度实验方法实验方法SPE对农药的吸附对农药的吸附 代表农药代表农药-666、甲基对硫磷、甲胺磷-666、甲基对硫磷、甲胺磷 淋洗曲线淋洗曲线0.5mL/次接收淋洗液，计算各段淋洗液中农药组分占总加量的百分比。0.5mL/次接收淋洗液，计算各段淋洗液中农药组分占总加量的百分比。实验方法实验方法净化净化淋出曲线淋出曲线表3 1g硅胶柱淋洗曲线淋洗体积ml淋出百分率%r-666甲基对硫磷甲胺磷表3 1g硅胶柱淋洗曲线淋洗体积ml淋出百分率%r-666甲基对硫磷甲胺磷055109380739380731015 720277202715200.50.50.50.52025 2530实验结果实验结果39(3)固相萃取技术例7：蔬菜中农药残留的分析提取50g样品加100mL乙腈后均质5分钟，加入10g氯化钠，再均质5分钟，使农药转移到乙腈中。.净化（SPE）用乙腈对C18固相萃取柱进行预淋洗。将15mL的乙腈提取液加到柱头上，在重力作用下将洗脱液收集在一个15mL的离心管中。当洗脱液的体积达到13mL时停止收集。向离心管中加无水硫酸钠直到体积增至15mL。给离心管加盖，摇匀。高速离心5分钟。将离心管中一等份提取液10mL(相当于5.0g的样品)转移到另一个15mL离心管中。用氮气将提取液浓缩至0.5mL（A液）。将氨基丙基柱连接到石墨化碳黑固相萃取柱的底端，用乙腈-甲苯（3+1）的平衡柱子。将A液用乙腈-甲苯（3+1）转移到石墨化碳黑固相萃取柱上，然后用20mL乙腈-甲苯（3+1）进行洗脱。将洗脱液用旋转蒸发仪浓缩至小体积。加入10mL的丙酮两次，每次加入后都用旋转蒸发仪浓缩近干，从而将溶剂替换成丙酮。40例例8：蔬菜中农药多残留分析：蔬菜中农药多残留分析 吸附剂：活性炭、吸附剂：活性炭、GCB(石墨化碳黑石墨化碳黑)、Florisil、NH2、Al2O3 蔬菜样品：油菜、番茄、尖椒蔬菜样品：油菜、番茄、尖椒 洗脱溶剂洗脱溶剂A：丙酮：丙酮/乙酸乙酯（乙酸乙酯（1+1，V/V）B：丙酮：丙酮/甲苯（甲苯（3+1，V/V）C：乙酸乙酯：乙酸乙酯/环己烷（环己烷（1+1，V/V）1.1.各种吸附剂对基质干扰物的吸附模型各种吸附剂对基质干扰物的吸附模型1 活 性 炭吸附能力：吸附能力：80g/g，以油菜质量计算，以油菜质量计算2 GCBABC吸附能力：10g/g；对叶黄素和叶绿素选择性吸附41Florisil和NH2Florisil:对叶黄素弱吸附;NH2不能吸附色素2.脂肪酸的净化脂肪酸的净化 表表 2-1 吸附剂对脂肪酸的吸附作用吸附剂对脂肪酸的吸附作用能去除脂肪酸，一般10g样品需要500mg的NH2。此外，淋洗液对NH2吸附脂肪酸的能力有影响NH2能去除脂肪酸，但是吸附效果与吸附剂用量或样品种类存在显著关系。Florisil不能去除脂肪酸GCBGC-MS分析结果吸附剂图图2-1 番茄、油菜和尖椒番茄、油菜和尖椒GCB净化后的净化后的GC-MS总离子流色谱图总离子流色谱图42图图 2-2 不同用量不同用量Florisil对番茄中脂肪酸的净化效果对番茄中脂肪酸的净化效果200mg（上）、（上）、100mg（下）（下）图图 2-3尖椒经尖椒经NH2净化后洗脱液净化后洗脱液A和和B 的的GC-MS图图A(上)、B(下）图图2-4尖椒经尖椒经Flori净化后净化后GC-MS对照图对照图A(上)、B(下）432.吸附剂对农药的吸附作用吸附剂对农药的吸附作用2.1 两种两种GCB对农药的吸附作用对农药的吸附作用待测农药在两种待测农药在两种GCB上的洗脱顺序和洗脱体积相同上的洗脱顺序和洗脱体积相同待测农药在待测农药在GCB上的洗脱顺序不受洗脱溶剂的影响。但洗脱体积与洗脱溶剂密切相关上的洗脱顺序不受洗脱溶剂的影响。但洗脱体积与洗脱溶剂密切相关。451035洗脱体积（mL）CBA洗脱溶剂表表 3-2 农药在农药在GCB上的洗脱顺序和结构特征上的洗脱顺序和结构特征弱极性；整个分子是平面、对称的芳香环结构，如百菌清和六氯苯。氯硝胺、百菌清15-20六氯苯30-35定菌磷、蝇毒磷、六氯苯20-30中等极性；具有平面的芳香环状结构如苯硫磷和亚胺硫磷。伐灭磷、甲基硫环磷、皮蝇磷、敌稗、灭菌磷、毒死蜱、五氯硝基苯、苯硫磷、谷硫磷、杀虫畏、苯硫磷、乙酯杀螨醇、亚胺硫磷等5-15极性化合物；或没有平面芳香环结构，如甲胺磷和速灭磷。敌敌畏、甲胺磷、速灭磷、丙线磷、久效磷、西玛津、特丁磷、胺菊酯、溴氰菊酯乙酰、甲胺磷、二氯苯醚菊酯等1-5 极性和结构特点被洗脱农药洗脱体积极性和结构特点被洗脱农药洗脱体积(mL)NCH2SP(OCH3)2OOSCNClCNClClClClClClClClCl2.2 Florisil和和NH2 对农药的吸附作用对农药的吸附作用 Florisil:正相萃取柱，对目标农药的洗脱顺序一般是从非极性弱极性极性正相萃取柱，对目标农药的洗脱顺序一般是从非极性弱极性极性;洗脱体积与洗脱液的强度密切相关。洗脱体积与洗脱液的强度密切相关。NH2:弱的离子交换柱，对目标农药的吸附没有表现明显的规律性，吸附力较弱，洗脱体积小。弱的离子交换柱，对目标农药的吸附没有表现明显的规律性，吸附力较弱，洗脱体积小。8mL15mLNH230mL10 mL25mLFlorisilCBA吸附剂（吸附剂（500mg）表表3-3不同洗脱液的洗脱体积不同洗脱液的洗脱体积443.三种蔬菜的净化方法三种蔬菜的净化方法 表表4-1 三种蔬菜中的主基质干扰物三种蔬菜中的主基质干扰物 表表 4-2 各种蔬菜的净化方法各种蔬菜的净化方法E:丙酮丙酮/乙酸乙酯乙酸乙酯/环己烷环己烷(25:15:10,v/v/v)色素、辣椒素和蜡脂色素、脂肪酸番茄红素、脂肪酸干扰物尖椒油菜番茄蔬菜色素、辣椒素和蜡脂色素、脂肪酸番茄红素、脂肪酸干扰物尖椒油菜番茄蔬菜GPC+FL(500mg+700mg)GCB+Flori(500mg+500mg)GCB+Flori(300mg+500mg)SPE柱柱GPC+FL(500mg+500mg)GCB+NH2(500mg+500mg)GCB+NH2(300mg+500mg)SPE柱淋洗液淋洗液柱淋洗液淋洗液A(35mL),B(10mL)A(35mL),B(10mL)尖椒尖椒A(35mL),B(10mL)A(35mL),B(10mL)油菜油菜B(10mL),E(25mL)B(10mL),E(25mL)番茄净化方法番茄净化方法2净化方法净化方法1样品样品第三节 方法验证第三节 方法验证 实验方法实验方法添加了0.02mg/kg和0.10mg/kg两个水平，每个水平重复四次。两种洗脱液A和B。方法准确度和灵敏度方法准确度和灵敏度大部分农药回收率为70-120%，标准偏差15%。方法的检测限方法的检测限大多数农药在0.02mg/kg-0.10mg/kg SPE的应用的注意事项 基本操作步骤基本操作步骤分析物干扰物柱预处理样品添加柱洗涤分析物洗脱45基本操作步骤基本操作步骤 固相萃取操作一般有四步：固相萃取操作一般有四步：?固定相活化-除去柱子内的杂质并创造一定的溶剂环境。固定相活化-除去柱子内的杂质并创造一定的溶剂环境。?样品上柱-将样品用一定的溶剂溶解，转移入柱并使组分保留在柱 上。样品上柱-将样品用一定的溶剂溶解，转移入柱并使组分保留在柱 上。?淋洗-除去不需要的组分或保留干扰杂质。淋洗-除去不需要的组分或保留干扰杂质。?洗脱-用小体积的溶剂将组分淋洗下来并收集。洗脱-用小体积的溶剂将组分淋洗下来并收集。各步骤注意事项各步骤注意事项柱预处理柱预处理 1.强洗脱液除杂质 2.弱洗脱液活化或恢复SPE柱的活性点 3.弱洗脱液上样。46上样上样-Load Sample预处理后，试样溶液被加至并通过SPE柱，分析物及杂质被保留在吸附剂上。为了防止分析物的流失，应注意以下几点：为了防止分析物的流失，应注意以下几点：1）试样溶剂强度不宜过高。当以反相机理萃取时，以水或缓冲剂作为溶剂，其中有机溶剂量不超过10%（V/V）。2）合适的样品溶液pH值.3）其他：减少试样体积、增加SPE柱中的填料量和选择对分析物有较强保留的吸附剂等手段。淋洗淋洗除去或保留干扰杂质除去或保留干扰杂质用中等强度的溶剂，将干扰组分洗脱下来，同时保持分析物仍留在柱上。为了决定最佳清洗溶剂的浓度和体积，加试样于SPE柱上，用510倍柱床体积的溶剂清洗，依次收集和分析流出液，得到清洗溶剂对分析物洗脱廓形。增加清洗溶剂强度，根据不同强度下分析物的洗脱廓形，决定清洗溶剂合适的强度和体积。分析物的洗脱和收集分析物的洗脱和收集-Elution这一步骤的目的是将分析物完全洗脱并收集在最小体积的组分中。洗脱溶剂的强度是至关重要的。较强的溶剂能够使分析物洗脱并收集在一个小体积的级分中，但有较多的强保留杂质同时被洗脱下来。当用较弱的溶剂洗脱，分析物级分的体积较大，但含较少的杂质。为了提高分析物的浓度或要进行溶剂转换，可以把收集到的分析物级分用氮气吹干，再溶于小体积适当的溶剂中。47流出曲线：常用的固相萃取填料常用的固相萃取填料SPE粒度分布粒度分布对流速的影响如何选择合适的如何选择合适的SPE柱柱 1）柱填料（固定相）选择）柱填料（固定相）选择48SPE柱及一些参数的选择柱及一些参数的选择 2）固相萃取柱规格的选择固相萃取柱规格的选择对于反相、正相和吸附型固相萃取柱来说，被萃取样品的质量不超SPE柱填料的5%；离子交换型的固相萃取柱，必须考虑离子交换的容量。SAX和SCX其吸附容量为0.2mg/g。下表附SPE小柱的容量和洗脱参数SPE柱及一些参数的选择柱及一些参数的选择附：附：固相萃取柱规格及上样、洗脱参数的选择固相萃取柱规格及上样、洗脱参数的选择SPE小柱的容量和洗脱参数SPE柱参数柱参数穿透体积穿透体积当样品的流出量为5，即J/J00.05时，n5时（相对保留体积）约为0.5，n25时约为0.7。这些数据可用来估计给定尺寸的固相萃取柱的穿透体积（VB）。例如填充柱的柱长为10mm，内径为5mm，空体积的比例是33时，这根柱子的空体积是(2.5)2(10)(0.33)65mm30.065ml。柱子的容量因子k1000，保留体积VR0.065（1000）65ml。如果柱子的理论塔板数为5，J/J00.05时，穿透体积VB为0.5(65ml32.5ml；如果柱子的理论塔板数为25，穿透体积VB0.765ml45.5ml。浓缩浓缩3V03(0.0650.2ml。n25时最高浓缩倍数可达45.5/2227倍。49萃取方法的建立萃取方法的建立反相（反相（C18,C8,CN,NH2）?分析物：非极性至中等极性?基质：水溶性?方法：1.活化：通常用水溶性有机溶剂，如甲醇活化，然后用水或缓冲溶液平衡。2.淋洗：含5%-50%极性溶剂的缓冲溶液淋洗3.洗脱：极性或非极性溶剂洗脱，缓冲液等。洗脱溶剂：甲醇异丙醇乙腈乙酸乙酯丙酮四氢呋喃萃取方法的建立萃取方法的建立阴离子交换（阴离子交换（SAX,PSA,NH2，PAX/MAX）分析物：阴离子（酸性）化合物方法：1.活化：用于非极性有机溶剂中的样品时，可用样品溶剂来淋洗；在用于极性溶剂中的样品时，可用水溶性有机溶剂淋洗后，再用适当pH值，并含有一定有机溶剂和盐的水溶液进行淋洗。2.上样：样品溶液pH值要大于大于其pKa两个单位3.洗脱：洗脱溶液pH值要小于小于其pKa两个单位萃取方法的建立萃取方法的建立正相（正相（Silica,Florisil,Diol,NH2）?分析物：非极性或中等极性（强极性）?基质：非极性至中等极性?方法：1.活化：通常用目标化合物所在的有机溶剂（样品基体）进行活化。2.淋洗：含少量（1-5%）中等极性到弱极性有机溶剂的非极性溶剂3.洗脱：含高浓度（5%-50%）中等极性到强极性有机溶剂的非极性有溶剂洗脱溶剂：异丙醇乙腈丙酮四氢呋喃二氯甲烷50初步萃取方法的建立初步萃取方法的建立阳离子交换（阳离子交换（SCX,PRS,COOH，PCX）?分析物：阳离子（碱性）化合物?方法：1.活化：用于非极性有机溶剂中的样品时，可用样品溶剂来淋洗；在用于极 性溶剂中的样品时，可用水溶性有机溶剂淋洗后，再用适当pH值，并含有一定有机溶剂和盐的水溶液进行淋洗。2.上样：样品溶液pH值要小于小于其pKa两个单位（以保证其带电荷）3.洗脱：洗脱溶液pH值要大于大于其pKa两