脑囊尾蚴病脑脊液差异凝胶电泳方法的建立.pdf

中国寄生虫学与寄生虫病杂志2 0 0 8年6月第2 6卷第3期C h i nJ P a r a s i t o l P a r a s i t D i sJ u n e2 0 0 8,V o l.2 6,N o.3基金项目:中国国际科技合作计划(N o.2 0 0 6 F D A 3 2 3 1 0)作者单位:1北京热带医学研究所,首都医科大学附属北京友谊医院,北京1 0 0 0 5 0;2山东省寄生虫病防治所,济宁2 7 2 0 3 3*通讯作者,E-m a i l:y p x u e s o h u.c o m(1B e i j i n gT r o p i c a lMe d i c i n eR e s e a r c hI n s t i t u t e,B e i j i n gF r i e n d s h i pH o s p i t a l,C a p i t a lMe d i c a lU n i v e r s i t y,B e i j i n g1 0 0 0 5 0,C h i n a;2S h a n d o n gI n s t i t u t eo fP a r a s i t i cD i s e a s e s,J i n i n g2 7 2 0 3 3,C h i n a)【A b s t r a c t】O b j e c t i v eT oe s t a b l i s ht h em e t h o do f t w o-d i m e n s i o n a l d i f f e r e n t i a l g e l e l e c t r o p h o r e s i sa n do b t a i nh i g hr e s o l u t i o n2 Di m a g e sf r o m c e r e b r o s p i n a lf l u i d(C S F)o fp a t i e n t sw i t hn e u r o c y s t i c e r c o s i s.Me t h o d s C S Fs a m p l e sw e r ec o l l e c t e df r o m f o u rp a t i e n t sd i a g n o s e da sn e u r o c y s t i c e r c o s i sc l i n i c a l l ya n db yE L I S A,c o m p u t e dt o m o g r a p h y(C T)o rm a g n e t i cr e s o n a n c ei m a g i n g(M R I),a n df r o m f o u rh e a l t h ys u b j e c t sw i t h o u tn e u r o l o g i c a ld i s o r d e r s.T h eC S Fs a m p l e sw e r ep r e c i p i t a t e d w i t h c o l d a c e t o n e,t h e n p o o l e d b ye q u a la m o u n ta sp a t i e n t sa n d c o n t r o l s.T h ei n t e r n a ls t a n d a r dc o m p r i s e de q u a la m o u n t so fp r o t e i n se x t r a c t e df r o m b o t hg r o u p s.I n t e r n a ls t a n d a r d,a n dp r o t e i n sf r o m t h et w og r o u p sw e r el a b e l e dp r i o rt oe l e c t r o p h o r e s i sw i t hs p e c t r a l l yr e s o l v a b l ef l u o r e s c e n td y e s,c y a n i nd y e 2(C y 2),C y 3a n dC y 5.S o d i u m d o d e c y l s u l f o n a t e p o l y a c r y l a m i d e g e lc h r o m a t o g r a p h y(S D S-P A G E)a n d t w o-d i m e n s i o n a ld i f f e r e n t i a li n-g e le l e c t r o p h o r e s i s(2-DD I G E)o fl a b e l e ds a m p l e sw e r et h e nr u n.T h ed i f f e r e n t i a le x p r e s s e dp r o t e i n ss h o w e di nt h ei m a g e so fS D S-P A G E a n d2-D D I G E g e l ss c a n n e d w i t h 4 8 8n m,5 3 2n m a n d 6 3 3n m w a v e l e n g t h l a s e rw e r ea n a l y z e d b yI m a g e Q u a n ta n dD e C y d e5.0r e s p e c t i v e l y.S p o td e t e c t i o n a n d q u a n t i f i c a t i o n w a sp e r f o r m e d f o rt h ed i f f e r e n t i a li n-g e la n a l y s i s(D I A)m o d u l eo f D e C y d e r.B i o l o g i c a l v a r i a t i o na n a l y s i s(B V A)m o d u l eo fD e C y d e rw a sm a t c h e dg e l1a n dg e l 2i m a g e st op r o v i d ed a t ao nd i f f e r e n t i a l p r o t e i ne x p r e s s i o nl e v e l sb e t w e e nt h et w og r o u p s.R e s u l t s T h eI m a g e Q u a n tr e s u l t d i s p l a y e dt h a t t h eC S Fp r o t e i nw a sc o m p a t i b l ew i t ht h ed y e,a n dt h ed i f f e r e n c eo f p r o t e i na m o u n t w a sr e v e a l e db yt h ed i f f e r e n c eo ff l u o r e s c e n c ei n t e n s i t y.D I A i n d i c a t e dt h a tt h e r ew e r e8 9 6a n d8 9 4p r o t e i nd o t so ng e l1a n dg e l2r e s p e c t i v e l y,a n d9 0%o ft h e m w e r em a t c h e de a c ho t h e r.B V A s h o w e dt h a tt h e r ew e r e5 5p r o t e i ns p o t sw i t hd i f f e r e n te x p r e s s i o n a l l e v e l b e t w e e nn e u r o c y s t i c e r c o s i sa n dc o n t r o l g r o u p s.P r o t e i ns p o t sw i t ht w o-f o l di n c r e a s eo rd e c r e a s ew e r e4 7脑囊尾蚴病脑脊液差异凝胶电泳方法的建立【论著】文章编号:1 0 0 0-7 4 2 3(2 0 0 8)-0 3-0 1 7 4-0 5李静宜1,田小军1,黄勇2,杨艳君2,马巧荣2,薛燕萍1*【摘要】目的建立脑脊液差异凝胶电泳方法,以获得高分辨率的荧光差异双向电泳图谱。方法取确诊的4例脑囊尾蚴病患者脑脊液和4位健康人脑脊液,分别用冰丙酮沉淀法除盐提取蛋白,均等量混合后为脑囊尾蚴病组与健康人对照组,两组总蛋白等量混合为内标组。将各组蛋白分别经花青染料2(C y 2)、C y 3和C y 5标记,再进行单向十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(S D S-P A G E)和双向差异凝胶电泳(2-DD I G E),分别在波长4 8 8 n m、5 3 2 n m和6 3 3 n m激发光下扫描,所呈图像分别用I m a g e Q u a n t和D e C y d e r5.0图像分析软件进行蛋白表达差异分析。用D e C y d e r中的胶内差异分析(D I A)模块对2-DD I G E扫描图像进行蛋白质点检测和含量分析。用D e C y d e r中的生物学差异分析(B V A)模块分析两组蛋白表达的生物学差异。结果I m a g e Q u a n t分析结果表明,所有脑脊液全蛋白样品均能被C y 2、C y 3和C y 5标记,荧光强度随蛋白含量的上升而增强。D I A分析显示,胶1和胶2分别检测到8 9 6和8 9 4个蛋白质点。胶2与胶1进行匹配,蛋白质点匹配率达9 0%。B V A分析发现,在脑囊尾蚴病组与健康人组脑脊液蛋白共有表达量变化超过两倍的差异蛋白质点5 5个,其中在脑囊尾蚴病组中表达上调2倍的有4 7个蛋白质点,下调2倍以上的有8个蛋白质点。结论以脑囊尾蚴病患者脑脊液建立的差异凝胶电泳方法,获得的2-DD I G E图谱,图像清晰,分辨率高,为脑囊尾蚴病蛋白质组学研究奠定了基础。【关键词】脑囊尾蚴病;脑脊液;蛋白质组;双向差异凝胶电泳E s t a b l i s h me n to fT w o-d i me n s i o n a l D i f f e r e n t i a l G e l E l e c t r o p h o r e s i sU s i n gC e r e b r o s p i n a l F l u i df r o m N e u r o c y s t i c e r c o s i sP a t i e n t sL IJ i n g-y i1,T I A NX i a o-j u n1,H U A N GY o n g2,Y A N GY a n-j u n2,M AQ i a o-r o n g2,X U EY a n-p i n g1*中图分类号:R 3 8 3.3 4,R 5 3 2.3 3文献标识码:A1 7 4中国寄生虫学与寄生虫病杂志2 0 0 8年6月第2 6卷第3期C h i nJ P a r a s i t o l P a r a s i t D i sJ u n e2 0 0 8,V o l.2 6,N o.3a n d8r e s p e c t i v e l yi nn e u r o c y s t i c e r c o s i sp a t i e n t sc o m p a r e dw i t hh e a l t h yc o n t r o l s.C o n c l u s i o n T h em e t h o do f2-DD I G Eh a sb e e ne s t a b l i s h e dw i t hh i g h-r e s o l u t i o ni m a g e sf o rt h ee x a m i n a t i o no f c e r e b r o s p i n a l f l u i d,p r o v i d i n gaf o u n d a t i o nf o rf u r-t h e rs t u d yo f n e u r o c y s t i c e r c o s i sc o m p a r a t i v ep r o t e o m i c s.【K e yw o r d s】N e u r o c y s t i c e r c o s i s;C e r e b r o s p i n a l f l u i d;P r o t e o mi c s;D i f f e r e n t i a l g e l e l e c t r o p h o r e s i sS u p p o r t e db yt h eI n t e r n a t i o n a l S c i e n c ea n dT e c h n o l o g yC o o p e r a t i o nP r o g r a m o f C h i n a(N o.2 0 0 6 F D A 3 2 3 1 0)*C o r r e s p o n d i n ga u t h o r,E-m a i l:y p x u e s o h u.c o m蛋白质组学的研究已成为生命科学领域十分有效的研究手段。其中,比较蛋白质组学被广泛应用于生命科学各个领域,即通过比较正常及病变标本中的蛋白种类及表达含量的变化,以发现与疾病相关的特异性蛋白,这对阐明发病机制,寻找疾病诊断的特异性蛋白标记和治疗的蛋白靶点均具有重要意义1。近年来,国外已开展对寄生虫蛋白质组及与寄生虫病有关的许多相关领域的研究2,3,但国内这方面的工作起步较晚,相关报道甚少。脑囊尾蚴病是猪囊尾蚴寄生于人体中枢神经系统所引起的。目前对虫体的机械性刺激和毒素作用所致的脑组织损伤的病理过程尚未完全清楚。脑脊液蛋白成分的变化和(/或)修饰均能精确反映中枢神经系统疾病的病理生理状态4。国外已有研究从脑脊液入手,探讨研究中枢神经系统疾病的标志物和病理机制5,6。但国内尚未见脑囊尾蚴病患者脑脊液的蛋白质组学研究的报道。本研究采用双向差异凝胶电泳(t w o-d i m e n s i o n a ld i f f e r e n c eg e l e l e c t r o p h o r e s i s,2-DD I G E)技术建立脑囊尾蚴病患者与健康人脑脊液蛋白质图谱,为脑囊尾蚴病的蛋白质组学进一步研究打下基础。材料与方法1材料1.1脑脊液标本脑囊尾蚴病患者组与健康人对照组脑脊液均来自首都医科大学附属北京友谊医院。4例脑囊尾蚴病患者(T 14)均为首次发病,临床与流行病学史符合脑囊尾蚴病表现;E L I S A检查血清抗囊尾蚴抗体阳性,计算机X射线断层扫描技术(C T)及磁共振成像(M R I)显示为脑囊尾蚴病活动期改变,均排除其他神经系统等疾病。4名健康对照人员(C 14)全部排除中枢神经系统疾病,脑脊液检查无异常。将获取的脑脊液分别4 2 0 0 0 g离心1 0 m i n,去除细胞和其他不溶解成分后,分别取上清,-8 0 冻存。1.2主要试剂和仪器丙烯酰胺、N,N 甲叉双丙烯酰胺、十二烷基硫酸钠(S D S)、过硫酸铵、四甲基乙二胺、尿素、硫脲、3-(3-胆酰胺丙基)-乙二胺-1-丙磺酸(C H A P S)、二硫苏糖醇(d i t h i o t h r e i t o l,D T T)、两性电解质(p h a r m a l y t e,p H 31 0)、碘乙酰胺、三羟甲基氨基甲烷(T r i s)、甘氨酸、琼脂糖、牛血清白蛋白、2 4c m非 线 性 固 相p H梯 度(i m m o b i l i z e d p Hg r a d i e n t,I P G)干胶条(p H 31 0)、I P G缓冲液(p H31 0)、固相p H梯度干胶条覆盖油(I P Go i l)和花青荧光染料(c y a n i n ed y e s,C y D y e)C y 2、C y 3及C y 5均购自美国G e n e r a lE l e c t r i cH e a l t h c a r e公司。蛋白酶抑制剂复合片(p r o t e a s ei n h i b i t o rc o c k t a i l t a b l e t,E D T A-f r e e)购自瑞士R o c h e公司。B r a d f o r d蛋白定量试剂购自美国B i o-R a d公司。等电聚焦仪(E t t a nI P G p h o r)、垂直电泳仪(E t t a nD A L T-s i x)、多功能激光扫描成像系统(T y p h o o n9 4 1 0)和差异分析软件(D e C y d eV 5.0)均购自美国G e n e r a l E l e c t r i cH e a l t h c a r e公司。2方法2.1样品制备2.1.1丙酮沉淀脑脊液蛋白质7分别取冻存于-8 0 的脑脊液,4 解冻,8 0 0 0 g离心1 0 m i n。每2 5 0 l脑脊液上清加入1 0 0 0 l冰丙酮(1 4)颠倒混匀后,于-2 0 冻存2 h沉淀蛋白。取出后于4 1 5 0 0 0 g离心1 5 m i n,倒置弃上清,晾干5 m i n。加入适量裂解液(7m o l/L尿素、2m o l/L硫脲、4%C H A P S和3 0 m m o l/LT r i s-H C l p H8.5),轻吹溶解沉淀,同时用5 0 m m o l/LN a O H调节至p H8.5。2.1.2蛋白定量考马斯亮蓝(B r a d f o r d)法测定蛋白质浓度。标准牛血清白蛋白梯度稀释后,分别加入考马斯亮蓝染色剂,测定吸光度(A5 9 5值),建立标准蛋白浓度与A5 9 5值的标准曲线。同法处理待测各个脑脊液样品,将检测的A5 9 5值以内插法代入标准曲线,计算样品蛋白浓度。2.1.3蛋白样品分组4例脑囊尾蚴病患者脑脊液样品均各取2 5 g蛋白,混合后补加裂解液调节蛋白终浓度至4 g/l,为脑囊尾蚴病组。4例健康人脑脊液同法处理(健康人对照组)。从脑囊尾蚴病组与健康人对照组各取2 5 g蛋白混合为内标组。2.2荧光标记标记方法采用C y D y eD I G E最小标记法荧光染料标记蛋白。1 7 5中国寄生虫学与寄生虫病杂志2 0 0 8年6月第2 6卷第3期C h i nJ P a r a s i t o l P a r a s i t D i sJ u n e2 0 0 8,V o l.2 6,N o.32.2.1标记效率实验按4 0 0 p m o l染料/5 0 g蛋白进行标记,取各组样品2 5 g进行标记效率实验。C y 2标记内标组,C y 3标记健康人对照组,C y 5标记脑囊尾蚴病组。取各组蛋白各2 5 g,分别加入0.5 l相应荧光染料工作液(4 0 0 p m o l/l)。避光冰浴3 0 m i n使荧光与蛋白结合,加入1 l赖氨酸(1 0 m m o l/L)继续避光冰浴1 0 m i n中和未反应的荧光。标记反应完成后,分别加入2倍上样缓冲液,按4 2 1的比例上样(即脑囊尾蚴病组、组与内标组每组样品上样量均分别为1 2.5、6.2 5和3.1 2 5 g),进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(S D S-P A G E)。扫描凝胶,激发光波长分别为C y 24 8 8n m、C y 35 3 2n m和C y 56 3 3n m。扫描结果用I m a g e Q u a n t软件进行分析,并考察荧光强度与蛋白上样量之间的定量关系。2.2.2 2-DD I G E样品标记胶1:C y 2标记内标组,C y 3标记健康人对照组,C y 5标记脑囊尾蚴病组;胶2:C y 2标记内标组,C y 3标记脑囊尾蚴病组,C y 5标记健康人对照组。剂量均为5 0 g。2.3 2-DD I G E2.3.1等电聚焦将胶1(方法同2.2.2)中C y 2、C y 3、C y 5分别标记的5 0 g蛋白样品混合,加入水化泡胀液(7 m o l/L尿素、2 m o l/L硫脲、4%C H A P S、3 0 m m o l/LT r i s-H C l p H8.5、2%二硫苏糖醇和1%两性电解质)至总体积为4 5 0 l。将制备好的胶1样品溶液加入等电聚焦胶槽中。将2 4 c mI P G干胶条(p H31 0)胶面朝下放入胶槽,使胶面与样品溶液充分接触。确保胶面下无任何起泡后,加入I P G覆盖油,防止干胶。然后将准备好的等电聚焦槽置于等电聚焦电泳仪上,5 0V水化1 2 h。然后进行等电聚焦。电压设置为2 0 0 V1 h、5 0 0 V1.5 h、1 0 0 0 V1.5 h,线性升压3 h至1 0 0 0 0 V后维持电压1 0 0 0 0 V聚焦至6 00 0 0伏小时(V h)。胶2样品同法处理。2.3.2 S D S-P A G E等电聚焦完成后,将胶1和胶2的I P G胶条分别置于含有1%二硫苏糖醇的平衡液(6 m o l/L尿素、2%S D S、7 5m m o l/LT r i s-H C lp H8.8和3 0%丙三醇)的试管中,于水平摇床平衡1 5 m i n。然后分别在含有4%碘乙酰胺的平衡液中再平衡1 5 m i n。最后将I P G胶条分别放置于1 2.5%的S D S-聚丙烯酰胺凝胶顶端上,用0.5%琼脂糖封顶,进行S D S-P A G E,参数为2 5 m A/胶,持续4 0 m i n后调至5 0 m A/胶,直至溴酚蓝染料迁移到胶的底部边缘结束电泳。2.4凝胶图像扫描分析用扫描仪于荧光模式下进行C y 2、C y 3及C y 5成像扫描,所有的成像均先选择像素为1 0 0 0 m的快速预扫描,确定合适光电倍增管(P M T)电压。C y 2、C y 3及C y 5标记的蛋白图像分别由波长4 8 8 n m、5 3 2 n m和6 3 3 n m激光激发,终图像使用像素为1 0 0 m的精细扫描。调节扫描控制软件中的P M T电压值,使各图像的M a xV a l u e值于7万左右。使用D e c y d e r图像分析软件中的胶内差异分析(d i f f e r e n t i a li n-g e la n a l y s i s,D I A)模块和生物学差异分析(b i o l o g i c a lv a r i a t i o na n a l y s i s,B V A)模块分析电泳结果。D I A模块自动将拥有最多蛋白点数量的凝胶识别为主胶,所有其他胶的成像均与主胶进行匹配。两组脑脊液蛋白点的确认、匹配与表达差异的比较均在B V A模块中进行。结果1样品标记评价不同荧光标记的脑囊尾蚴病组、健康人对照组与内标组等3组样品分别按4 2 1的比例进行S D S-P A G E,理论上荧光强度值应符合4 2 1的关系。从图1 A可见,荧光强度随上样量的减少而下降。用I m a g e Q u a n软件分析结果表明,各泳道的荧光强度值非常接近4 2 1的比例关系(图1 B)。另外,各组荧光染料标记相同上样量的泳道的荧光强度值也比较接近。表明脑脊液全蛋白样品能被C y 2、C y 3和C y 5最小标记法荧光染料标记,且不同荧光染料标记同一蛋白样品的效率无明显差异,荧光强度所反应的蛋白含量的差别真实可信。该标记脑脊液蛋白样品可以用于下一步D I G E分析。2 D I G E图谱分析经过D I G E,在p H31 0的梯度胶条上,脑脊液蛋白图谱清晰。对C y 2、C y 3及C y 5进行成像扫描,不同荧光染料标记样品呈现不同颜色。其中,C y 2标记的内标组脑脊液蛋白,显示蓝色图谱(图2 B);C y 5标记的健康人对照组脑脊液蛋白,显示红色图谱(图2 C);C y 3标记的脑囊尾蚴病组脑脊液蛋白,显示绿色图谱(图2 D)。2-D D I G E图像蛋白点识别和定量分析结果表明,胶1和胶2分别检测到8 9 6和8 9 4个蛋白质点,以胶1为m a s t e r胶,胶2与胶1进行匹配,蛋白质点匹配率达9 0%。生物学差异分析结果表明,在脑囊尾蚴病组与健康人对照组脑脊液蛋白共存在有表达量变化超过两倍的差异蛋白质点5 5个,其中在脑囊尾蚴病组中表达上调2倍的有4 7个蛋白质点,下调2倍以上的有8个蛋白质点。图2-A中黄色蛋白质点为在健康人对照组和脑囊尾蚴病组表达量大致相等的蛋白质点,红色蛋白质点为在健康人对照组高表达,绿色蛋白质点为在脑囊尾蚴病组表达含量较高。1 7 6中国寄生虫学与寄生虫病杂志2 0 0 8年6月第2 6卷第3期C h i nJ P a r a s i t o l P a r a s i t D i sJ u n e2 0 0 8,V o l.2 6,N o.3BA123456789C y 2C y 5C y 3A:脑脊液蛋白不同荧光定量标记的聚丙烯酰胺凝胶电泳,B:聚丙烯酰胺凝胶电泳后荧光强度分析;C y 2:内标组,C y 3:健康人对照组,C y 5:脑囊尾蚴病组;1、4、7:1 2.5 g,2、5、8:6.2 5 g,3、6、9:3.1 2 5 g。A:I m a g eo fC S Fp r o t e i ns a m p l el a b e l e dw i t hd i f f e r e n t i a lf l u o r e s c e n c ed y e a f t e rS D S-P A G E,B:F l u o r e s c e n c e i n t e n s i t y o fC S F p r o t e i ns a m p l e l a b e l e d w i t h d i f f e r e n t i a lf l u o r e s c e n c e d y e a f t e rS D S-P A G E;C y 2:I n t e r n a l s t a n d a r d,C y 3:C o n t r o l g r o u p,C y 5:N e u r o c y s t i c e r c o s i sg r o u p;1,4,7:1 2.5 g,2,5,8:6.2 5 g,3,6,9:3.1 2 5 g.图1脑脊液蛋白荧光定量标记评估F i g.1 E v a l u a t i o no ft h el a b e l i n go fC S Fp r o t e i ns a mp l eu s i n gI ma g eQ u a n tb yS D S-P A G E123456789C y 2C y 3C y 5荧光强度F l u o r e s c e n c ei n t e n s i t y(1 07)9876543210A:C y 3和C y 5融合的图像,B:C y 2内标组,C:C y 5健康人对照组,D:C y 3脑囊尾蚴病组。A:C y 3,C y 5m e r g e di m a g e,B:C y 2i n t e r n a ls t a n d a r d,C:C y 5c o n t r o l g r o u p,D:C y 3n e u r o c y s t i c e r c o s i sg r o u p.图2脑脊液全蛋白不同荧光标记的2-D I G E图谱F i g.2 I ma g e so fC S Fp r o t e i nl a b e l e dw i t hd i f f e r e n t i a l f l u o r e s c e n c ed y e sa f t e rt w o-d i me n s i o n a l e l e c t r o p h o r e s i sABCDp H 3p H 1 0p H 3p H 1 0讨论蛋白质组是指在特定的时间和空间内,一个基因组、一种细胞组织或一种生物体所表达的全部蛋白质8。了解疾病的蛋白质组学信息已成为继基因组学后的又一重要的研究领域。对中枢神经系统疾病,如阿尔茨海默氏病、帕金森氏病和多发性硬化等疾病,以脑脊液作为研究对象的蛋白质组学研究目前已揭示出多种与疾病相关的蛋白4,9-1 1。蛋白质组学研究为中枢神经系统疾病的研究指出了新方向,已成为目前研究中枢神经系统疾病的重要手段。双向电泳是蛋白质组学研究的核心技术之一。但传统的双向电泳(2-D E)的样品制备、电泳条件和凝胶染色等条件无法完全一致而产生的胶间差异,常导致试验重复性差、敏感度低。甚至可能掩盖样品间真正的生物学差异,或产生假阳性1 2。为解决这些问题,U n l 等1 3提出荧光双向差异凝胶电泳(2-DD I G E)。该系统可以使标记不同荧光染料的不同样品混合在同一胶上共分离,不同组的蛋白质点之间的差异可通过不同的荧光信号来展现。C y D y eD I G E最小标记染料含有一个N-羟基丁二酰亚胺集团,可与蛋白的赖氨酸残基的氨基形成酰胺键,当使用的荧光染料浓度极低时,可导致被标记的每个蛋白分子仅带有一个染料分子1 2,因此荧光强度可反映蛋白含量的表达变化。同时该系统通过相同的内标对蛋白含量进行自动校准,从而消除了胶间误差,解决了胶图间的匹配问题,能真实反映蛋白质表达的改变。另外,该法灵敏度高,线性关系好,仅需少量蛋白就可完成表达差异分析1 4。本研究以患者脑影像学表现为基础,同时根据病例特点进行了筛选,并将脑脊液样品等量混合用于试验研究,目的在于最大限度地降低组内的个体差异带来的影响,发现最具代表性的改变。脑脊液有高丰度蛋白,如白蛋白和免疫球蛋白占总蛋白的6 5%以上,为了避免因去除高丰度蛋白而造成的与高丰度蛋白相互作用的低丰度蛋白的丢失问题,本研究建立了未去除高丰度蛋白条件下脑囊尾蚴病患者脑脊液蛋白质的2-DD I G E图谱,以期了解脑囊尾蚴病患者脑脊液蛋白质的2-DD I G E的原始状态。但这些高丰度蛋白的存在也可能会影响等电聚焦过程,或对一些低丰度蛋1 7 7中国寄生虫学与寄生虫病杂志2 0 0 8年6月第2 6卷第3期C h i nJ P a r a s i t o l P a r a s i t D i sJ u n e2 0 0 8,V o l.2 6,N o.3白的分离造成影响,从而掩盖了某些可能与疾病有关的低丰度蛋白的表达变化1 5。脑脊液盐浓度高达1 5 0 m m o l/L,高浓度的金属离子可致溶液的电导率增大,使等电聚焦失败。另外,脑脊液的蛋白含量一般为2 0 07 0 0 g/m l或更低,且取材困难,样本量较少。因此,如何处理样品以最大限度地提高蛋白回收率和电泳分辨率就成为本实验的关键步骤。脑脊液除盐和浓缩的办法主要有超滤法、透析法、蛋白质沉淀法及旋转柱除盐法1 6,1 7。有报道表明,沉淀法中预冷丙酮沉淀法回收蛋白效率可达9 4%,对牛脑脊液的研究也表明预冷丙酮沉淀法匹配率为9 1%,远高于旋转柱除盐法和商用的2-D样品处理试剂盒(2-Dc l e a n-u pk i t)法1 8。本研究采用预冷丙酮沉淀法,结合既可以促进高分子量蛋白进入胶条中,同时也可用降低残存盐离子对高压聚焦的影响的低电压水化上样法,以获得清晰D I G E图谱。但在碱性端,仍有些蛋白聚焦不完全,这可能与I P G碱性端缓冲能力差,易发生氧化还原反应而造成拖尾有关。也可能是因为经丙酮沉淀后仍有少量干扰物质存在,从而影响了等电聚焦过程。H a n s s o n等1 9的研究通过液相-等电聚焦电泳将集落刺激因子(C S F)蛋白按不同的p H范围粗分成若干个部分,然后分别选取相应p H梯度的I P G胶条进行等电点聚焦,认为样品预分离方法能提高电泳分辨率,减少横竖条纹的出现,显示更多的蛋白质点。综上所述,本研究利用二维差异凝胶电泳技术首次建立的脑囊尾蚴病患者与健康人脑脊液蛋白质的清晰的D I G E图谱,为深入研究脑囊尾蚴病患者脑脊液差异蛋白质组的分析奠定了基础。参考文献1K u b o t aK,K o s a k aT,I c h i k a w aK,e ta l.C o m b i n a t i o no ft w o-d i m e n s i o n a l e l e c t r o p h o r e s i s a n ds h o t g u np e p t i d es e q u e n c i n gi nc o m-p a r a t i v ep r o t e o m i c sJ.JC h r o m a t o g rB A n a l y tT e c h n o lB i o m e dL i f eS c i,2 0 0 5,8 1 5(1-2):3-9.2R o b i n s o nM W,C o n n o l l yB.P r o t e o m i ca n a l y s i so ft h ee x c r e t o r y-s e c r e t o r yp r o t e i n so f t h eT r i c h i n e l l as p i r a l i sL 1l a r v a,an e m a t o d ep a r a s i t eo fs k e l e t a lm u s c l eJ.P r o t e o m i c s,2 0 0 5,5(1 7):4 5 2 5-4 5 3.3F o u n t o u l a k i sM,K o s s i d aS.P r o t e o m i c s-d r i v e np r o g r e s si nn e u r-o d e g e n e r a t i o nr e s e a r c hJ.E l e c t r o p h o r e s i s,2 0 0 6,2 7(8):1 5 5 6-1 5 7 3.4L iX,M i y a j i m aM,M i n e k iR,e ta l.A n a l y s i so fp o t e n t i a ld i a g-n o s t i cb i o m a r k e r si nc e r e b r o s p i n a lf l u i do fi d i o p a t h i cn o r m a lp r e-s s u r eh y d r o c e p h a l u sb yp r o t e o m i c sJ.A c t aN e u r o c h i r,2 0 0 6,1 4 8(8):8 5 9-8 6 4.5R a n g a n a t h a nS,Wi l l i a m sE,G a n c h e vP,e t a l.P r o t e o m i cp r o f i l-i n go fc e r e b r o s p i n a lf l u i d i d e n t i f i e sb i o m a r k e r sf o ra m y o t r o p h i cl a t e r