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信 息 检 索 月 报

科研开发部 2013年12月

本期是2013年的最后一期，在过去的一年里感谢公司各部门对我部科技信息工作支持，使得科技信息工作得以顺利完成。在新的一年里我们将携手共进，为公司的整体发展做出贡献。
本期推出菌苗制品，供全公司科研人员参阅。

1.百日咳疫苗免疫接种策略及相关研究进展

中华预防医学杂志 2013年1期
作者单位 ：1.中国食品药品检定研究院血清室卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室
2.成都生物制品研究所有限责任公司

摘要：
百日咳是由百日咳杆菌引起的细菌性呼吸系统传染病,其典型的特征是发作性咳嗽,可持续几个星期甚至更久.所有年龄段人群均对其易感,但婴幼儿及儿童感染后病情较成年人严重.近年来,基础免疫的实行,使疫苗接种覆盖率大大提高,在很大程度上降低了百日咳的发病,但其仍是导致婴幼儿死亡的重要因素.百日咳的自然感染和计划免疫都不能使机体产生针对百日咳杆菌的终身免疫,所以,尽管儿童计划免疫的覆盖率很高,百日咳仍在流行,甚至在局部地区暴发.据估计,全球每年感染百日咳的患者约5000万例,死亡30万例百日咳在青少年和成人中的感染率并不低,在几个国家均发现其发病率有大龄化的趋势,但是由于该病临床症状不典型,或较轻微,常被忽视或误诊,使此类患者成为潜在的传染源.因此,考虑到百日咳最新流行趋势及疫苗免疫持久性等问题,一些国家和地区对百日咳疫苗加强免疫的适用年龄进行了大量研究,并在其免疫程序中推荐青少年或成年人进行加强免疫,以保护个体不受感染,并切断传播途径,保护未能完成计划免疫或从未进行过计划免疫的儿童不受感染.在此,笔者就百日咳疾病的预防策略及加强免疫的必要性进行综述.

2.低抗原含量百日咳疫苗效力评价研究
国际检验医学杂志 2012年21期
作者单位 ：中国食品药品检定研究院百白破疫苗和毒素室,卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室

摘要：
目的：应用改良小鼠脑腔攻击试验(MICA)检测评价低抗原含量百日咳疫苗效力.方法 通过中检院和国外实验室平行应用改良小鼠脑腔攻击试验进行不同稀释度相同批次低抗原含量百日咳疫苗的效力,并应用统计软件分析.结果 中检院与国外实验室所获得低抗原含量百日咳疫苗的MICA试验效力结果数据均较低(<1.1 IU/mL),中检院计算出的效价均在国外实验室分析得出效价的95%可信区间内.结论 MICA方法可应用于低抗原含量百日咳疫苗效力检测分析,该研究为进一步确定中国低抗原含量百日咳疫苗的MICA试验检定标准奠定了基础.

3.用鸡胚成纤维细胞生产传染性喉气管炎活疫苗的工艺探索

中国农资 2013年28期  
作者单位 ：青岛易邦生物工程有限公司

摘要：
《兽医生物制品规程》中规定鸡传染性喉气管炎活疫苗的生产及生产用种毒的繁殖都是接种SPF鸡胚,收获绒毛尿囊膜来进行的.SPF鸡胚价格昂贵,绒毛尿囊膜产量少,挑膜工艺容易污染,造成损失和浪费.用鸡胚成纤维(CEF)二代细胞代替鸡胚绒毛尿囊膜制备生产用种毒及疫苗,所制备的种毒及疫苗各项指标均符合《规程》规定的标准,提高了疫苗的批产量,降低了生产成本.

4.鸡传染性支气管炎病毒疫苗研究概述

畜牧兽医科技信息 2013年 第8期
作者单位；吉林省梅河口市动物疫病预防控制中心

摘要：
鸡传染性支气管炎（AvianInfectiousBronchitis，IB）是一种由鸡传染性支气管炎病毒（InfectiousBronchitisVirus，IBV）引起的急性、高度接触传染性、病毒性呼吸道疾病，呼吸道上皮细胞为IBV最初感染和主要的增殖部位，部分病毒株可在感染鸡的肾脏、输卵管和肠道等组织器官的上皮细胞中增殖。其主要特征为：病鸡咳嗽、喷嚏、气管哕音；肾脏肿大、苍白、有大量尿酸盐沉积，严重者呈现“花斑肾”。该病能感染不同日龄、品种和性别的鸡，可导致雏鸡死亡；可引起蛋鸡产蛋数量和蛋的品质下降及肉鸡的增重和饲料报酬下降；IBV常伴有混合感染并可继发细菌性疾病。长期以来，IB给世界各国养禽业带来严重的经济损失。IBV血清型众多，并且不同血清型之间较差保护性较差，给IBV的预防带来诸多困难。随着IBV分子生物学研究、免疫机制探索以及病原变异机制探讨等工作的逐步深入，IB疫苗研究工作也取得了一系列进展。

一．我公司在研课题的国内外进展

1.戊型肝炎病毒及其病毒样颗粒疫苗的研究进展

国际生物制品学杂志 2013年1期
作者单位 ：上海生物制品研究所有限责任公司第二研究室

摘要：
戊型肝炎(hepatitis E,HE)是全球最主要的病毒性肝炎之一,由戊型肝炎病毒(hepatitis E virus,HEV)感染导致.因为HEV不能在体外细胞培养体系中有效生长,因此HE灭活或减毒活疫苗的研制不可行.目前HE疫苗研究主要集中在有免疫原性的重组病毒衣壳蛋白上.HEV的开放读码框架2编码的蛋白为病毒衣壳蛋白,可在体外自行组装成病毒样颗粒(virus-like particle,VLP).形成的VLP在动物和人体中均可诱导产生高滴度的保护性抗体,是理想的预防性疫苗组分.此文就HEV的流行病学、HEV VLP的形成机制和结构特征以及VLP疫苗的研究现状作一综述.

2.甲型肝炎灭活疫苗(SH株)接种食蟹猴的免疫原性研究

中华微生物学和免疫学杂志 2013年2期
作者单位 ：1.北京民海生物科技有限公司
2.国家药物安全评价监测中心

摘要：
目的:研究甲型肝炎灭活疫苗(SH株)食蟹猴的免疫原性.方法 甲型肝炎病毒SH株接种人胚肺二倍体细胞(MRC-5),培养、收获的病毒液,经纯化、灭活后铝佐剂吸附制成甲型肝炎灭活疫苗.采用食蟹猴进行疫苗的免疫原性研究.结果 接种疫苗后的食蟹猴,体内产生抗HAV抗体和中和抗体,抗核抗体结果为阴性.结论该疫苗具有良好的免疫原性.

3.成人剂量型流行性感冒病毒裂解疫苗的稳定性研究

国际检验医学杂志 2013年12期
作者单位 ：1.中国医学科学院
2.北京协和医学院医学生物学研究所
3.云南省重大传染病疫苗研发重点实验室

摘要：
目的：了解疫苗在不同温度和不同时间存放的质量变化,为研制安全有效的流感疫苗提供依据.方法 将流感疫苗放置在4 ℃和37 ℃进行长期稳定性和加速稳定性试验,不同存放时间点测定流感病毒血凝素(HA)含量及各项质量指标.结果 疫苗经4 ℃保存18个月和37 ℃保存2周,HA含量和其他质量指标都符合药典要求.结论 成品流感疫苗在1年有效期内均合格.

4.戊型肝炎病毒细胞培养模型的研究进展
微生物学免疫学进展 2013年5期
作者单位 ：北京大学医学部病原生物学系和感染病中心

摘要：
戊型肝炎病毒（ HEV）体外细胞培养模型的建立有助于阐明HEV的感染、复制及其致病机理，有利于新型抗病毒药物和疫苗的研发与评估。近年来国内外对HEV细胞培养模型的报道很多，但所用细胞系、感染方法及病毒的复制效果等不尽相同。因此，对近年来HEV细胞培养模型的研究进展进行了综述。

5.重组人生长激素脂质体的处方和制备工艺研究

科技信息 2013年14期
作者单位 ：河北联合大学药学院唐山市新药基础研究重点实验室

摘要：
目的:优化筛选rhGH脂质体的处方和制备工艺.方法:建立制备rhGH脂质体的乙醇注入法,以包封率为指标,通过单因素试验考察制备工艺,并用正交设计实验优化处方.结果:最佳制备工艺条件为膜材乙醇溶液注入速度2ml·min-1,磁力搅拌速度60 r·min-1,水浴温度45 ℃,最优处方为脂药比的用量8∶1,磷脂与胆固醇质量比为2∶1,磷酸盐缓冲液的浓度为0.02mol/L.采用该工艺条件制备rhGH脂质体三批,平均包封率为64.9％,平均粒径为211.4nm.结论:乙醇注入法制备工艺简单,易于掌握,优选得到的脂质体处方和制备工艺稳定可行.

6.甲型肝炎灭活疫苗(人二倍体细胞)生产中去氧胆酸钠残留量测定方法的建立

河北联合大学学报（医学版）2013年2期
作者单位 ：唐山怡安生物工程有限公司

摘要：
甲型肝炎灭活疫苗(人二倍体细胞)生产流程中提纯工艺阶段需用去氧胆酸钠进行细胞裂解,为此须控制生产工艺中残留去氧胆酸钠的含量.本文应用紫外分光光度法对残留去氧胆酸钠浓度进行比色测定,结果表明在此实验条件下,标准去氧胆酸钠浓度在10～80μg/mL范围内呈现比较好的线性关系(r2在0.96～0.99之间),提示该方法可用于甲型肝炎灭活疫苗残留去氧胆酸钠残留量的测定.

7.流感病毒裂解疫苗儿童剂型在小鼠中的安全性及免疫原性研究

国际检验医学杂志 2012年15期
作者单位 ：1.中国医学科学院
2.北京协和医学院医学生物学研究所
3.云南省重大传染病疫苗研发重点实验室

摘要：
目的：比较本研究所制备的流感病毒裂解疫苗儿童剂型(昆明疫苗)与赛诺菲巴斯德流感裂解疫苗儿童剂型(巴斯德疫苗)在动物中的安全性和免疫效果.方法 用流感病毒裂解疫苗儿童剂型于0 d和14 d,腹腔内接种ICR小鼠.每天称取体质量,免疫后35 d,眼眶采血分离血清,用微量血凝抑制(HI)法测定小鼠血清中特异性抗体滴度,计算抗体阳转率、保护率及几何平均滴度(GMT)增长倍数.结果 免疫后小鼠体质量逐渐增加,组间无明显差异;两组间HI抗体阳转率、保护率及H1N1、H3N2型和B型HI抗体倍数差异无显著意义.结论 两种疫苗均具有很好的安全性和免疫原性.

8.戊型肝炎病毒衣壳表面功能区域的研究

学位论文（2012） 学位授予单位：厦门大学
作者：郑子峥

论文要点：
本论文建立了广泛识别HEV衣壳表面结构的单抗盘,并以单抗作为工具深入研究了HEV衣壳表面表位区与其所行使的功能之间的联系。
　　首先本研究创新性的将统计学聚类分析应用于单抗盘识别表位的分析上,发现HEV衣壳外表面上至少存在4个相对独立的表位区。并通过抗原基因改造、抗原反应检测、病毒反应检测、类病毒颗粒(Virus-like particle,VLP)细胞模型、病毒细胞模型以及恒河猴感染模型等,对识别各表位区的代表性单抗的反应性、中和活性以及对氨基酸变异的敏感性等性质进行了深入分析,揭示了4个表位区在HEV衣壳表面的位置以及各它们在病毒免疫及感染过程中所发挥的重要作用。
　　4个表位区域中3个为构象性表位区(C1、C2及C3),定位于a.a.459-606所形成的构象结构上,1个为线性表位区(L)定位于a.a.403-457之间。
　　C1表位区跨越范围较广,相对位置上处于C2与C3表位区之间,其覆盖位点以二聚体界面处的a.a.542、a.a.553、a.a.564及a.a.606为核心向两翼延伸。识别该表位区的代表性单抗8G12对不同基因型HEV均有良好的反应性,并在细胞模型上展现出对不同基因型HEV的很好的中和活性。该表位区所包含的单抗识别位点很有可能是HEV只具有一个血清型,以及戊肝疫苗对不同基因型HEV均有良好保护性的分子基础。
　　C2表位区相较于其他两个构象表位区更靠HEV衣壳内侧,其核心位点已被精确定位于a.a.512附近。本研究发现该表位区的暴露程度易受到邻近区域其他氨基酸的影响而减弱。C2表位区是一个已经被证实的中和表位区域,识别该区域的单抗对1型HEV的中和效果要明显强于4型。
　　C3表位区位于二聚体上靠近顶端的位置,为3/4型HEV所特有的表位区。本研究证明了该表位区的存在完全依赖于1/2型与3/4型HEV间保守差异氨基酸位点(a.a.483、a.a.490、a.a.492、a.a.497以及a.a.599)的变异,并发现该表位区的存在使3/4型HEV能够识别更为广泛的细胞受体位点。提示1/2型与3/4型HEV间在氨基酸水平上的保守性差异引发了二者从衣壳表面结构到细胞受体识别上的显著差别,并很可能最终导致了二者在宿主嗜性及流行方式上的不同。此外本研究还在L表位区上发现了新的HEV潜在中和活性表位a.a.423-437,并证明该表位为非免疫优势表位。这一发现补充了对HEV中和表位的认识,并为那些优势表位变异较大、易发生免疫逃逸的病毒(流感、HIV、HCV及HBV等)的疫苗设计展示了一条可能的思路。
　　综上所述,本论文将统计学聚类分析与单抗盘检测相结合,发现了位于HEV衣壳表面上的数个表位区域,并利用单抗的特殊性质找到了这些区域在HEV的免疫中和过程,以及宿主差异性识别过程中所发挥的作用。为解释HEV的单一血清型问题、疫苗广谱中和问题以及不同基因型的宿主差异问题等HEV感染与免疫中尚有待解决的重要问题提供了可能的分子机制。为研究HEV潜在免疫逃逸,实现对HEV长期有效的防控提供分子层面的理论基础。也为其他病毒的研究提供方法学及认识上的参考与借鉴。

9.全球重组人生长激素行业发展现状分析

中国药物评价 2012年1期
作者单位 ：华北制药新药研究开发有限责任公司

摘要：
生长激素的定义脑垂体前叶分泌的能促进身体生长的一种激素.生长激素能通过促进肝脏产生生长激素介质间接促进生长期的骨骺软骨形成,促进骨及软骨的生长,从而使躯体增高生长激素对中间代谢及能量代谢也有影响,可促进蛋白质合成,增强对钠、钾、钙、磷、硫等重要元素的摄取与利用,同时通过抑制糖的消耗,加速脂肪分解,使能量来源由糖代谢转向脂肪代谢.人在幼年时,如果生长激素分泌不足,会导致生长发育迟缓,身体长得特别矮小,称"侏儒症";如果生长激素分泌过多,可引起全身各部过度生长,骨胳生长尤为显著,致使身材异常高大,称"巨人症".成年后,骨骺已融合,长骨不再生长,此时如生长激素分泌过多,将刺激肢端骨、面骨、软组织等增生,表现为手、足、鼻、下颌、耳、舌以及肝、肾等内脏显示出不相称的增大,称"肢端肥大症".巨人症和肢端肥大症如果是垂体前叶肿瘤所致,可进行局部放射线照射治疗或手术切除,大剂量雌激素有抑制垂体分泌生长激素的作用.目前科学家已试用基因工程方法将人类生长激素基因从染色体DNA链上分离出来,重组到质粒上,用发酵的方法生产人类的生长激素.

10.干扰素-γ研究进展

生物技术通报2010年8期
作者单位 ：1.中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室
2.农业部畜禽病毒学重点开放实验室

摘要：
干扰素-γ(interferon-gamma,IFN-γ)是一种具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用的细胞因子,主要由活化的T细胞和NK细胞产生.IFN-γ对机体免疫系统具有强大的调节作用,是机体发挥免疫功能、清除体内病原体不可缺少的成分.因此,IFN-γ在疾病的诊断、治疗和疫苗免疫效果检测等方面起着重大作用,是现代分子生物学、免疫学和临床医学研究的热点之一.对干扰素-γ产生、分子结构、生物学活性及作用机制等方面做以下简要综述.

二．我公司在产产品的国内外进展

1.中、美、英、欧药典无菌检查用培养基促微生物生长能力对比研究

西北药学杂志 2013年6期
作者单位 ：陕西省食品药品检验所
摘要：
目的：研究改良马丁培养基（MM）和胰酪胨大豆液体培养基（TSB）的促需气菌和霉菌生长能力的差异。方法以进口T SB培养基为对照，采用培养基灵敏度检查法和平皿计数法分别对2个批号的5家国产T SB与M M培养基，6种实验菌进行实验，每个批号平行实验3次，并对实验数据进行统计学分析。结果 M M培养基与T SB培养基在促微生物生长能力（灵敏性）和适于微生物生长的种群（广谱性）上无显著性差异。结论无菌检查法可以采用T SB替代M M培养基或二者并行。

2.胰酪胨大豆培养基和改良马丁培养基的微生物促生长能力考察

中国药品标准 2013年4期

作者单位 ：1.上海市食品药品检验所
2.国家药典委员会

摘要：
目的:考察国产胰酪胨大豆培养基(TSB)和改良马丁培养基(MMB)对微生物的促生长能力,为<中国药典>无菌检查法培养基的选择提供依据.方法:采用培养基灵敏度检查法和菌数平皿计数法,以BD公司生产的TSB为对照,对微生物的促生长情况进行考察.结果:单因素方差分析结果显示,所用国产TSB和MMB培养基在两种方法中对代表性微生物促生长能力无显著性差异.结论:<中国药典>无菌检查用培养基应与国际先进国家药典保持一致,采用TSB替代MMB培养基用于需气菌和真菌的培养.

3.肠康宁多元释药片剂的制备工艺研究

中药与临床 2013年2期
作者单位 ：成都中医药大学中药材标准化教育部重点实验室 中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地

摘要：
目的:以肠康宁为模型药物,制得胃溶型的黄芪片和pH敏感-酶触发型黄连片,从而达到多元释药、标本兼治的目的.方法:压片过程中采用湿法制颗粒后压片,根据浸膏性质选择适宜辅料配比或/和辅料加入方式,以片芯的硬度、崩解时限等为考察指标,完成压片步骤；采用多层包衣法,以盐酸小檗碱体外释放度等为考察指标,对包衣处方中成膜剂种类及比例、增塑剂种类及用量、包衣增重进行筛选.结果:黄芪片芯药辅比为黄芪浸膏∶微晶纤维素(MCC)∶低取代羟丙甲基纤维素(L-HPC)∶硬脂酸镁=100∶67.43∶4∶1,其中MCC向纯化液中加65％,整粒完成后加2.43％,L-HPC采用内外加法,内加2％,外加2％；黄连片芯药辅比为黄连浸膏∶MCC∶乳糖∶L-HPC∶硬脂酸镁=100∶69.94∶29.96∶5∶2.黄芪包衣工艺为:取Eudragit E 100,乙醇溶解,加15％的PEG-6000,配制成聚合物浓度为10％的包衣液,包衣增重4％；黄连包衣工艺为:先包聚合物浓度为10％的Eudragit E 100隔离层,再包质量浓度为2％、加聚合物干重5％的邻苯二甲酸二丁酯的壳聚糖溶液,最后包Eudragit L30D55分散体比Eudragit S 100为1∶5比例的pH敏感层(加入聚合物干重20％的柠檬酸三乙酯作增塑剂),最终测得包衣增重在7％时,黄连片能较好的达到结肠靶向释药的目的.结论:经体外溶出度试验,该制剂较好的达到多元释药目的.

4.小白鼠妊娠期及产后的饲养管理

湖北畜牧兽医 2013年6期 
作者单位 ：黄淮学院生物工程系

摘要：
介绍了小白鼠妊娠期及产后饲养管理注意事项,对小白鼠的饲养提供了参考.

5.流感疫苗生产新技术研究综述

北方药学 2012年5期
作者单位 ：济宁市药品检验所

摘要：
流行感冒是一种发病率和死亡率很高的呼吸系统疾病,接种疫苗是预防流感的有效手段.传统的流感疫苗生产存在一些不足,需要更加迅速有效的疫苗生产技术来满足市场的需求.本文对弥补传统疫苗生产技术不足采用的一些新技术进行综述.

6.昆虫杆状病毒表达系统生产流感疫苗的研究进展

中国兽药杂志 2012年12期
作者单位 ：武汉中博生物股份有限公司

摘要：
综述了昆虫杆状病毒表达系统生产流感疫苗的研究进展，同时分析了昆虫杆状病毒表达系统表达流感病毒样颗粒用于流感疫苗的优势和前景，以期为兽用流感病毒VLPs疫苗研发提供参考。

7.利用家蚕丝腺表达人干扰素 -w 的研究

实验动物与比较医学 2012年4期
作者单位 ：西南大学蚕学与系统生物学研究所,家蚕基因组学国家重点实验室

摘要：
目的:建立家蚕丝腺生物反应器表达外源蛋白的平台,并评估家蚕中表达的外源蛋白的实用性.方法 将人干扰素-w基因(huIFN-w),构建到来源于鳞翅目昆虫粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)的piggyBac转座子基础载体中,以家蚕中部丝腺特异表达基因Ser1为启动子,眼睛和神经特异表达的增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)作为报告基因,构建家蚕中部丝腺特异表达载体pBac[ser1-huIFN-w,3xp3-EGFP].经显微注射入产后1-3h的大造(蚕种系大造P50)早期胚胎,筛选阳性个体.并对阳性个体进行分子和蛋白水平检测.结果 获得了家蚕转基因阳性个体,huIFN-w基因在家蚕中部丝腺高量转录表达,重组蛋白huIFN-w具有一定的抗细胞增殖活性.结论 利用家蚕丝腺生物反应器表达的huIFN-w蛋白正确并具有生物活性,表明可将家蚕丝腺作为“生物工厂”,大量和高效生产高附加值外源蛋白,同时也为生物制品的大量推广和应用奠定理论基础.
8.不同接头的白蛋白干扰素在毕赤酵母中表达的研究

生物学杂志 2012年2期
作者单位 ：1.安徽大学,生命科学学院
2.安徽安科生物股份有限公司
3.安徽医科大学,基础医学院

摘要：
毕赤酵母作为比较成熟的真核表达系统[1],它具有许多优点,表达产物直接分泌到胞外,这有利于产物的分离纯化.白蛋白干扰素在毕赤酵母中表达的研究也具有很重要的意义.研究白蛋白与干扰素之间的接头蛋白不同对表达量的影响.通过重叠PCR构建不同接头的白蛋白干扰素重组子,然后分别用salⅠ酶切线性化,通过电转仪转入毕赤酵母SMD1168,在MD板上进行培养,分别挑取10个克隆进行甲醇诱导表达,筛选出表达量最高的一个.最后在相同的条件下,分别将表达量高的进行诱导表达,表达产物通过SDS-PAGE鉴定,由于表达产物中有杂蛋白,通过酶联免疫吸附法(ELISA)测定融合白蛋白干扰素的表达量,由已知浓度的白蛋白干扰素标准曲线,可以计算出不同接头的白蛋白干扰素的表达量,这对工业化生产具有指导意义.

9.浅谈小白鼠的养殖

中国科技纵横 2012年14期
作者单位 ：哈药集团制药总厂

摘要：
本文对小白鼠的养殖的饲养条件和管理原则进行了研究

10.增加环境丰富化模具对实验豚鼠生长及行为的影响

中国比较医学杂志 2012年12期
作者单位：华兰生物工程股份有限公司

摘要：
目的：在实验豚鼠饲养盒内增加梯形和管形两种不同的模具,进行环境丰富化模具对豚鼠生长及行为影响的研究.方法 每组豚鼠饲养4周,每周称1次体重,记录体重变化趋势,并观察豚鼠行为变化.结果 放入模具的豚鼠生长情况优越于对照组,管形模具优于其他实验组.结论 增加环境丰富化模具有利于豚鼠生长,且管形模具更接近豚鼠自然洞穴状态,更加有利于豚鼠实现自然躲藏行为和良好的生长、生活.

11.肿瘤坏死因子受体2编码基因重组质粒的构建及意义

中国药物与临床 2012年6期
作者单位 ：山西医科大学第二医院心内科
山西医科大学第一医院
摘要：
目的:构建真核表达质粒pcDNA6.0-TNFR2196MET和pcDNA6.0-TNFR2196ARG.方法 人工合成TNFR2196MET目的 片段,与pMD18-T simple 载体连接形成克隆载体,再通过设计突变引物,PCR定点突变扩增出含有突变位点的质粒,转化到肠埃希菌感受态细胞JM109中,通过氨苄青霉素抗药性筛选出成功转化的阳性克隆,并进行扩增.抽提质粒进行测序鉴定,得到pMD18-T simple-TNFR2196ARG.双酶切pMD18-T simple-TN-FR2196MET、pMD18-T simple-TNFR2196ARG及pcDNA6.0,将TNFR2196MET、TNFR2196ARG插入pcDNA6.0线性质粒,即构建成pcDNA6.0-TNFR2196MET和pcDNA6.0-TNFR2196ARG真核表达质粒,转化到Ecoli感受态中,筛选阳性克隆行菌液PCR和双酶切及测序鉴定.结果 酶切鉴定和测序分析验证TNFR2基因196MET和196ARG表达载体构建成功.
结论：成功构建表达载体为下一步心血管疾病研究奠定了实验基础.
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