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红细胞凝集试验
血球凝集(HA)试验: 有些病毒具有凝集某种(些)动物红细胞的能力，称为病毒的血凝，利用这种特性设计的试验称血球凝集(HA)试验
血球凝集抑制(HI)试验:病毒的凝集红细胞的能力可被相应的特异性抗体所抑制，即血球凝集抑制(HI)试验
阿氏液（Alsever）：即红细胞保养液

指红细胞凝集的现象。由病毒、细胞凝集素和抗体而引起的红细胞凝集。
（1）由病毒而引起的凝集：G．H．Hirst（1941）发现流感病毒能使鸡的红细胞发生凝集，其后又发现其它各种病毒也能引起同样的红细胞凝集反应。即红细胞表面存在着对各种病毒的受体，病毒与受体结合，以红细胞为桥梁的结果而引起凝集。利用此反应可以进行病毒的定性和定量。另外，如果存在抗病毒的抗体时，则由病毒引起的凝集作用将被抑制，所以可用于抗病毒抗体的检出。
（2）由抗体引起的凝集：（a）如果存在对红细胞表面决定基的抗体，则红细胞亦将凝集。可用于测定对抗红细胞的抗体的效价或鉴定人的血型。（b）在红细胞表面，如果人为地使之吸附或结合特定的抗原物质，则与该抗原相对应的抗体将引起红细胞凝集（被动凝集反应或间接凝集反应，psssive he-magglntination）。
　　血凝及血凝抑制试验
　　有些病毒具有凝集某种(些)动物红细胞的能力，称为病毒的血凝，利用这种特性设计的试验称血球凝集(HA)试验，以此来推测被检材料中有无病毒存在，是非特异性的，但病毒的凝集红细胞的能力可被相应的特异性抗体所抑制，即血球凝集抑制(HI)试验，具有特异性。通过HA-HI试验，可用已知血清来鉴定未知病毒，也可用已知病毒来检查被检血清中的相应抗体和滴定抗体的含量。 
　　[目的要求]
　　掌握病毒HA和HI试验的原理和基本操作方法，了解其实用价值。
　　[材料与试剂]
　　1. 96孔“U”形或“V”形微量反应板，50 uL定量移液器，滴头，微型振荡器。
　　2. 生理盐水，0.5%鸡红细胞悬液，新城疫病毒液（尿囊液或冻干疫苗液），新城疫阳性血清，被检鸡血清。
　　[实验内容及操作方法]
　　（一）血球凝集(HA)试验 
　　1. 在96孔微量反应板上进行，自左至右各孔加50 uL生理盐水。
　　2. 于左侧第1孔加50 uL病毒液（尿囊液或冻干疫苗液），混合均匀后，吸50 uL至第2孔，依次倍比稀释至第11孔，吸弃50 uL；第12孔为红细胞对照。
　　3. 自右至左依次向各孔加入0.5%鸡红细胞悬液50 uL，在振荡器上振荡，室温下静置后观察结果（表4-1）。
　　表4-1 病毒血凝试验的操作方法（单位：uL）

孔 号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
病毒稀释度
1:2
1:4
1:8
1:16
1:32
1:64
1:128
1:256
1:512
1:1024
1:2048
对照
生理盐水
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
病毒液
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50

0.5%红细胞
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
弃50

结果观察
++++
++++
++++
++++
++++
++++
​
+++
+
+
-
-
4. 结果判定：从静置后10 min开始观察结果，待对照孔红细胞已沉淀即可进行结果观察。红细胞全部凝集，沉于孔底，平铺呈网状，即为100% 凝集（++++），不凝集者（-）红细胞沉于孔底呈点状。
　　以100% 凝集的病毒最大稀释度为该病毒血凝价，即为一个凝集单位。从表4-1看出，该新城疫病毒液的血凝价为1:128，则l:128为1个血凝单位，1:64、l:32分别为2、4个血凝单位，或将128/4=32，即1:32稀释的病毒液为4个血凝单位。
　　(二) 血球凝集抑制(HI)试验
　　1. 根据HA试验结果，确定病毒的血凝价，配制出4个血凝单位的病毒液。
　　2. 在96孔微量反应板上进行，用固定病毒稀释血清的方法，自第1孔至第11孔各加50 uL生理盐水。
　　3. 第1孔加被检鸡血清50 uL，吹吸混合均匀，吸50 uL至第2孔，依此倍比稀释至第10孔，吸弃50 uL，稀释度分别为：1:2、1:4、1:8 …… ；第12孔加新城疫阳性血清50 uL，作为血清对照。
　　4. 自第1孔至12孔各加50 uL 4个血凝单位的新城疫病毒液，其中第11孔为4单位新城疫病毒液对照，振荡混合均匀，置室温中作用10min 。
　　5. 自第l孔至12孔各加0.5% 鸡红细胞悬液50 uL，振荡混合均匀，室温下静置后观察结果（表4-2）。
　　表4-2 病毒血凝抑制试验的操作方法（单位：mL）

孔 号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
血清稀释度
1:2
1:4
1:8
1:16
1:32
1:64
1:128
1:256
1:512
1:1024
病毒
对照
血清
对照
生理盐水
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
​
被检鸡血清
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
​
50
4单位病毒
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
室温中静置 10 min

0.5%红细胞
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
弃去50

结果观察
-
-
-
-
-
-
+
++
+++
++++
++++
-
6. 结果判定：待病毒对照孔（第11孔）出现红细胞100%凝集（++++），而血清对照孔（第12孔）为完全不凝集（-）时，即可进行结果观察。
　　以100%抑制凝集（完全不凝集）的被检血清最大稀释度为该血清的血凝抑制效价，即HI效价。凡被已知新城疫阳性血清抑制血凝者，该病毒为新城疫病毒。
　　从表4-2看出，该血清的HI效价为1:64，用以2为底的负对数(-log2)表示，即6log2。
　　附录
　　1. 阿氏液（Alsever）：即红细胞保养液
　　枸橼酸钠（5H2O） 0.80g
　　枸橼酸（H2O） 0.055g
　　葡萄糖 2.05g
　　氯化钠 0.42g
　　双蒸水 加至 100 ml 
　　将以上试剂加热溶解于双蒸水中，调整pH至6.8，115℃灭菌10min,4℃保存备用。
　　2. 0.5% 鸡红细胞制备方法
　　先用灭菌注射器吸取3.8% 枸橼酸钠溶液(其量为所需血量的1/5)，从鸡翅静脉或心脏采血至需要血量，置灭菌离心管内，加灭菌生理盐水为抗凝血的2倍，以2000r/min离心10min，弃上清液，再加生理盐水悬浮血球，同上法离心沉淀，如此将红细胞洗涤三次，最后根据所需用量，用灭菌生理盐水配成0.5%鸡红细胞悬液。
　　3. 96孔微量反应板的清洗
　　将浸泡有75%乙醇的棉签放入微量反应板的每个孔内旋转，用自来水冲洗反应板5次，再用蒸馏水冲洗3次以上，置37℃温箱中干燥。

家禽采血技术

在血清学检测和实验研究中，采血技术是一项前提性工作，采血质量的好坏，直接影响实验和判定实验结果。在操作时，应注意严格消毒，无菌操作。
一、鸡冠采血法：多用于需血量较少的采血。用针头刺破鸡冠吸取血液或在鸡冠的尖端部用剪刀剪去一小片即可。吸取血液时需用手挤压鸡冠一次可吸取30～80ul血液。此法操作简便，但要十分注意伤口的止血预防感染,最方便有效的消毒止血方法是用浓碘酒涂抹伤口。
二、鸡颈静脉采血法：右侧颈静脉较左侧粗，故常采用右侧颈静脉取血。左手以食指和中指夹住家禽头部，并使头偏向一侧，无名指、小指和手掌握住躯干，拇指轻压颈椎部以使静脉充血怒张。右手持注射器，针头倾斜45度沿血管方向一侧0.3～0.5cm挑破皮肤前行0.3～0.5cm刺人静脉，再与血管平行进针0.2～0.5cm抽取血液。采血完毕后压迫伤口处止血。这种方法采血可应用于15～45日龄的锥鸡，成年鸡单人操作保定较难，皮色较深不易找到血管。
三、鸡心脏采血法：右侧卧保定，在左侧胸部触摸心搏动最明显的地方进行穿刺，连接注射器吸取血液。成年鸡心脏穿刺部位是：
1、从胸骨峭前端至背部下凹处连接线的1/2处。用细针头在穿刺部位与皮肤垂直刺入约2～3cm即可。
2、采血部位 选定鸡的左侧或右侧胸部,由“飞天穴、股端角、膝盖骨角”三点连接成一个三角形,在三角形的正当中是进针点。
手指压摸感到心脏跳动明显(见图家禽品种和个体大小不同进针位置和深度不同要作适当调整。心脏采血可大量采血,但不宜连续使用,因有一定的死亡率。特别是对雏禽，常因针头刺破心脏导致出血过多而死亡，而且心脏的修复能力特别差，对畜禽后期影响较大。
四、胸外静脉采血法：胸外静脉采血该脉管在翼下无毛区前方,呈上下偏斜走向,清晰可见。但由于皮下质肌肉疏松,不易刺中血管,而且血流量不多,所以一般不用。
五、鸡翼下静脉采血法：静脉又称容量血管，其内含血量较多且流速较慢，位于翼下静脉具此特点，此静脉易找到，健康安全范围内在此可采血10～20ml。而且操作方便，单人即可完成，采血量极易控制，止血彻底，对家禽影响小。实验者右手持注射器，左手将家禽双翼提起，露出翼静脉的采血位置，把覆盖血管的羽毛拔开，即可见到明显一条较粗的静脉血管。采血时用左手大拇指夹住覆盖静脉的羽毛，食指协调大拇指夹住双翼，中指、无名指和手掌轻轻提起或轻按背部保定鸡只，待其安静方可刺针。针头在距静脉血管0.3～0.5cm一旁倾斜刺入皮肤，再与血管平行进针0.2～0.4cm后刺入血管，见有少量回血即可采集血液，采血完成后马上用手压迫伤口止血。
六、注意事项：1、采血场所要有充足的光线，室温夏季最好在25～28℃，冬季14～20℃为宜。2、采血所用器具：注射器或盛血容器等必须保持清洁干燥；消毒采用部位。3、采血时小心一些鸡只顽强的争扎而把翅膀弄断或抓伤实验者的双手，要待鸡只保定平静下来，再实施采血工作。4、静脉采血时抽血速度要保持缓慢，静脉血管回血流速较慢，内压突然降低致使血管壁接触而阻塞了针头，影响继续采血量。5、静脉采血时,若需反复多次,应自远离心脏端开始,以免发生栓塞而影响整条静脉。