微生物检测培养基原理.docx

微生物检测培养基及试剂原理

1.细菌与培养有关的生理结构。
1.1 细胞壁（cell wall）
主要成分：肽聚糖
革兰氏阳性菌（G+）:细胞壁有15-50层肽聚糖，厚20-80nm，组成三维立体框架，结构坚固致密。革兰氏染色紫色。
革兰氏阴性菌（G-）:细胞壁有1-2层肽聚糖，厚10-15nm，不能形成三维结构。但在肽聚糖之外，有G-特有的结构-外膜。革兰氏染色红色。
1.2 细胞膜（cell membrance）
细胞膜位于细胞壁内侧，紧包住细胞质，结构为平行的磷脂双分子层，其中镶嵌有多重蛋白质，大多为酶类和载体蛋白。
功能：物质转运 呼吸 分泌 生物合成
胞质周围间隙：G-菌的细胞膜与细胞壁之间的空间。此处聚集了若干种胞外酶，主要是水解酶。
1.3 细胞质（cytoplasm）
细胞质的主要成分是水、蛋白质、核酸、糖、无机盐等。细胞质含有多种酶系统，是细菌合成蛋白质和RNA的场所。细菌的分解代谢和合成代谢都在胞质中进行。
1.4 核蛋白体
核蛋白体是细菌合成蛋白质的场所。链霉素能与细菌核蛋白体的30s亚基结合；红霉素能与50s亚基结合，干扰细菌的蛋白质合成，从而杀灭细菌。
2. 细菌的物理性状
细菌虽小，也有独立的生命活动。能从外界环境中摄取营养原料，获得能量，合成菌体自身成分。同时排出废物，完成新陈代谢，从而得以生长繁殖。
-表面积
葡萄球菌直径约1um，则每立方厘米的表面积可达60000cm2.
一般生物体直径约1cm，则每立方厘米体积的表面积只有6cm2.
-带电现象
PH>PI(带负电) PH=PI PH<PI(带正电)
G+菌 PI=PH(2-3)
G-菌 PI=PH(4-5)
-光学性质
细菌为半透明体，光线不能完全通过，故悬液呈浑浊状，均量越大浊度越大。
-细菌的物理性状
细菌的细胞壁和细胞膜都为半透性。
细菌的渗透压比其它生物细胞为高。
3.细菌生长繁殖的营养物质和环境条件
自营菌：能以简单的无机物为原料，合成复杂的菌体原生质。
异营菌：必须供给多种有机物质，才能合成菌体原生质。所有的病原菌都是异养菌。
营养物质
水：（细菌80%，酵母菌75%，霉菌85%，霉菌孢子39%，细菌芽胞核心部分的含水量<=30%）细菌代谢过程中的一切反应都必须有水才能进行。培养基用水应为纯水（蒸留水，去离子水）。电导率—>0.
碳源（约占干重50%）：碳源是细菌合成菌体成分和获得能源的主要来源。
培养基碳源的供应主要来自糖类（C.H.O）、有机酸、醇类和脂类。
氮源（约占细胞干重的12%-15%）:构成重要生命物质蛋白质和核酸等的主要元素。
氨基酸异养型-需从外界吸收现成的氨基酸作为氮源；培养基中的氮源主要来自蛋白胨、氨基酸以及动、植物组织浸出液。
氨基酸自养型-能把尿素、铵盐、硝酸盐甚至氮气等简单氮源自行合成所要的氨基酸---菌体蛋白（SCP或食用菌）
无机盐：参与构成菌体成分：调节细胞内外渗透压：与酶活性有关。其中P、K、Na、Mg、S、Fe等需要量较多（K2HPO4、MgSO4）；Cl、Mn、Zn、Co、Cu等只需微量。
生长因子：许多细菌的生长还必需一些其自身不能合成的生长因子，主要是B族维生素（硫胺素VB1,核黄素VB2，泛酸VB3，吡哆素VB6,烟酸VB5，对氨基苯甲酸PABA）和某些氨基酸、嘌呤、嘧啶。
细菌摄取营养的机理：
1. 单纯扩散 被动吸收
2. 促进扩散（细胞膜上的特异性载体蛋白/渗透酶）
3. 主动吸收（耗能，通过膜上载体蛋白）
4. 基团转位（耗能，通过膜上载体蛋白，运送前后溶质分子改变）
环境条件：
5. PH值：大多数细菌生长最适酸碱度为中性或弱碱性即PH7.2-7.6。在此PH时，细菌的酶活性最强。考虑培养基成分对PH的调节能力（PH的内源）。
6. 1.1借助磷酸盐缓冲溶液（K2HPO4和KH2PO4）
7. 1.2 以CaCO3作“备用碱”进行调节。
8. 2.渗透压（由溶液中所含的分子或离子的数量决定）与细胞渗透压相等的等渗溶液最适宜微生物的生长，高渗透溶液则会使细胞发生质壁分离
9. 低渗溶液则会使细胞吸水膨胀，形成很高的膨压。
10. 水活度（aw）：表示微生物可实际利用的自由水或游离水的含量。
11. 氧（氧化还原电势）：需氧菌利用分子氧作为最后受氢体以完成呼吸作用。厌氧菌则在无氧环境中才能生长。
12. .二氧化碳：一般细菌在代谢过程中都需要CO2.
13. 温度：细菌生长的温度极限为-7_90度。病原菌最适生长温度为人体温度37±2℃.

4. 细菌分类检测原理
革兰氏染色法的意义就在于鉴别细菌，把众多的细菌分为两大类，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
大多数化脓性球菌都属于革兰氏氏阳性菌，它们能产生外毒素使人致病。
而大多数肠道菌多属于革兰氏阴性菌，它们产生内毒素，靠内毒素使人致病。
1. 培养基中各种抑菌物质对革兰氏阴性，阳性细菌的不同影响。
2. 各种细菌发酵糖类物质的不同结果。产酸产气/产酸不产气/不产酸不产气
3. 对相应物质的代谢产物不同，各种生化鉴定。

5. 分离与鉴定培养基中相关物质的作用原理
5.1 对革兰氏阳性细菌（大肠菌群，沙门氏菌，）起抑制作用的物质。
1. 月桂基硫酸钠：别名月桂醇硫酸钠；十二烷基硫酸钠 ；K12；发泡粉；表面活性作用强，属阴离子表面活性剂具有乳化作用。

2. 胆盐/牛胆粉/三号胆盐/去氧胆酸钠：是一种胆酸的钠盐，是胆酸的羧基和甘氨酸或牛磺酸(C2H7NO3S)的氨基(C2H5NO2)，通过酰胺键结合而成。
可降低培养基与细菌细胞膜界面上的表面张力，使细胞膜紊乱，导致细菌自溶。
肠杆菌科细菌在肠道内长期与胆汁接触。对胆盐有一定的抵抗力。合适的胆盐量能促进该科细菌的生长。
胆盐遇酸生成沉淀，使菌落色素不致扩散从而有利于鉴别。
胆盐中含有一定量的胆红素、粘蛋白、色氨酸，对不受胆盐抑制的细菌生长有营养作用。
3. 煌绿：煌绿（亮绿）：（C27H35N3ClBr）
抑制革兰氏阳性菌和大多数非沙门氏菌的革兰氏阴性杆菌，通常抑制发酵乳糖、蔗糖的细菌，抑菌原理同结晶紫。
常用于分离除伤寒外的沙门氏菌培养基。
煌绿和枸櫞酸钠对大腸菌的生长、菌体蛋白质的合成和糖的利用都有显著的抑制作用,以煌绿的作用为较强。枸酸钠能抑制大腸菌的呼吸,而煌绿的抑制作用则较弱。混合胆盐及硫代硫酸钠对大腸菌的上述代谢活动都没有抑制作用。
4. 伊红-美兰：两种苯胺类染料，它们可以抑制革兰氏阳性菌的生长。
伊红美兰
5. 结晶紫：
结晶紫 是一种医药名称，俗称：紫药水，属三苯甲烷类染料消毒剂，能与微生物酶系统发生氢离子的竞争性对抗，使酶成为无活性的氧化状态，而发挥杀菌作用。主要对革兰阳性菌如葡萄球菌、白喉杆菌，以及绿脓杆菌、白念珠菌、表皮癣菌有杀灭作用，对其它革兰阴性菌和抗酸杆菌几乎无作用；无刺激性及毒性。1g溶于10ml乙醇、15ml甘油，溶于水和氯仿，水溶液和乙醇液呈紫色，几乎不溶于乙醚酸碱指示剂，pH 0.5(绿)～2.0(蓝)；非水溶液滴定指示剂

6. 氰化钾（KCN）:氰化钾是剧毒药, 使用时应小心，切勿沾染，以免中毒。夏天分装培养基应在冰箱内进行。试验失败的主要原因是封口不严, 氰化钾逐渐分解，产生氢氰酸气体逸出，以致药物浓度降低，细菌生长，因而造成假阳性反应。试验时对每一环节都要特别注意。
7. 亚硫酸盐：是一类很早即在世界范围内广泛使用的食品添加剂:可作为食品漂白剂,防腐剂;可抑制非酶褐变和酶促褐变,防止食品褐变,使水果不至黑变,还能防止鲜虾生成黑斑;在酸性介质中,还是十分有效的抗菌剂.
5.2 对大肠埃希氏菌起抑制作用的试剂：
1.亚硒酸盐（Na2SeO3，NaHSeO3）:抑制大肠埃希氏菌，对沙门氏菌抑制较弱；应用不高于100℃的流动蒸汽灭菌。若灭菌不当，培养基出现红色，为硒析出，不能使用。
2.四硫磺酸盐（Na2S4O6）: Na2S2O3 + I2 = Na2S4O6 + 2NaI
抑制大肠埃希氏菌，对沙门氏菌无抑制作用。四硫磺酸钠对热颇为敏感，极易分解。故加碘后不能加热。
5.3 对革兰氏阴性菌起抑菌作用的试剂：
1.萘啶酮酸：抗细菌性合成化合物之一，具有宽广的抗菌谱，特别对革兰氏阴性菌有很强的效力，对大肠杆菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌及变形杆菌等，具抑菌和杀菌作用。对动物及人毒性低。其作用机制是抑制细菌脱氧核苷酸的合成。
2.吖啶黄素： 3,6-二氨基吖啶盐酸盐与氯化3,6-二氨基-10-甲基吖啶饯盐酸盐的混合物为吖啶黄素(acriflavine，熔点260℃[分解]):红棕色结晶粉末，水溶液为暗红色，稀释时带荧光；溶于醇，几乎不溶于氯仿、乙醚；用作抑菌剂，杀菌剂及荧光指示剂。也可作为酵母菌小菌落突变型的诱变剂和用于布鲁氏菌属(Brucetla)光滑型和粗糙型菌株的检出
3.多粘菌素：由多粘芽胞杆菌（bacilluspolymyxa）产生的一组多肽类抗生素。多粘菌素b和e供药用。常用其硫酸盐，为白色结晶性粉末，易溶于水，有引湿性。在酸性溶液中稳定，其中性溶液在室温放置一周不影响效价，碱性溶液不稳定。其抗菌谱及临床应用与多粘菌素E相似，对革兰阴性杆菌，如大肠杆菌、绿脓杆菌、副大肠杆菌、肺炎克雷白杆菌、嗜酸杆菌、百日咳杆菌及痢疾杆菌等有抑制或杀菌作用
4.头孢他啶：为半合成的第三代头孢菌素。抗菌活力较强，抗菌谱较广，对革兰阳性或阴性菌均具有较强作用。对革兰阳性菌、阴性菌产生的β内酰胺酶具有高度的稳定性，该品对绿脓杆菌、大肠杆菌、克雷白杆菌、变形杆菌、肠球菌、沙门菌、志贺菌、淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、金葡菌、溶血性链球菌、肺炎球菌及产气杆菌等具有强的抗菌活性，特别是对于绿脓杆菌作用最强抗生素。抗菌作用机制为影响细菌细胞壁的合成。与其它头孢菌素类药相似，该品能抑制转肽酶在细胞壁合成的最后一步交叉连接中的转肽作用，使交叉连接不能形成，从而影响细胞壁合成，导致细菌溶菌死亡
5.亚碲酸钾：抑制革兰氏阴性菌生长；由于弧菌对其抵抗力较强，故也常用于霍乱、副溶血弧菌的分离培养基中；一些细菌能还原亚碲酸钾，使菌落中心呈现黑褐色，便于鉴别。

5.4 对非葡球菌起抑制作用的试剂：
1. 2%,7.5%,10% NaCl 溶液：抑制大部分非葡球菌的生长。
2. 氯化锂（LiCl）

5.5 培养基中常用抗生素：多粘菌素B；链霉素；万古霉素；新生霉素；二性霉素；磺胺嘧啶；放线菌酮。
6. 培养基中常用的酸碱指示剂
指示剂大多为弱酸或弱碱物质，。
单色指示剂：如：酚酞（PH≥8.3红色，＜8.3无色）
双色指示剂：如：酚红 （分子态显色）Hind—>H+ + Ind-
用于观察细菌对糖、醇类是否利用分解。
氧化还原指示剂，如：美兰，刃天青等。
抑菌作用。
6.1 伊红-美兰（指示酸碱，产酸则出现紫黑色菌落，带金属光泽）

伊红为酸性染料，美蓝为碱性染料。当大肠杆菌分解乳糖产酸时细菌带正电荷被染成红色，再与美蓝结合形成紫黑色菌落，并带有绿色金属光泽。而产气杆菌则形成呈棕色的大菌落。
　　在碱性环境中不分解乳糖产酸的细菌不着色，伊红和美蓝不能结合，故沙门氏菌等为无色或琥珀色半透明菌落。金葡菌在此培养基上不生长。
常用的伊红美蓝乳糖培养基，可用来鉴别饮用水和乳制品中是否存在大肠杆菌等细菌。如果有大肠杆菌，因其强烈分解乳糖而产生大量的混合酸，菌体带H+，故菌落被染成深紫色，从菌落表面的反射光中还可以看到金属光泽。
6.2 对二甲基苯甲醛（用于生化鉴定-吲哚鉴定实验）
对二甲氨基苯甲醛称为埃利希试剂（Ehrlich reagent）,用于检测及定量分析色氨酸的反应。它可使吡咯、吲哚衍生物显色，在被测试溶液中加入数滴稀盐酸或稀硫酸时，加热后则呈现紫红色。显色是由于引起吡咯环的α位与试剂发生缩合反应，产生有色物质所致。该反应广泛用于含色氨酸蛋白质的定量分析。在临床上还可用于检测尿中色胆素原。
二甲氨基苯甲醛还可用于定量测定微量联氨，原理是：在酸性条件下，联氨与对二甲氨基苯甲醛生成黄色的络合物，然后采用分光光度法测定。
用于测定吲哚、粪臭素、尿蓝母、色氨酸、白蛋白、过氧化氢、胂凡钠明、邻氨基苯甲酸、安替比林麦角碱等，还用以区别血清发疹和腥红热。制造染料。
吲哚：吲哚及其同系物和衍生物广泛存在于自然界，主要存在于天然花油，如茉莉花、苦橙花、水仙花、香罗兰等中。。吲哚是一种亚胺，具有弱碱性；杂环的双键一般不发生加成反应；在强酸的作用下可发生二聚合和三聚合作用；在特殊的条件下，能进行芳香亲电取代反应，3位上的氢优先被取代，如用磺酰氯反应，可以得到3-氯吲哚。3位上还可发生多种反应，如形成格氏试剂，与醛缩合，以及发生曼尼希反应等。
色氨酸：　色氨酸是植物体内生长素生物合成重要的前体物质，其结构与IAA相似，在高等植物中普遍存在。可以通过 色氨酸合成生长素，有两条途径：
　　（1）色氨酸首先氧化脱氨形成吲哚丙酮，再脱羧形成吲哚乙醛；吲哚乙醛在相应酶的催化下最终氧化为吲哚乙酸。
　　（2）色氨酸先脱羧形成色胺，然后再由色胺氧化脱氨形成吲哚乙酸。

6.3甲基红　甲基红是常用的酸碱指示剂之一，常浓度为0.1%乙醇溶液，也用于原生动物活体染色。pH变色范围4.4(红)～6.2(黄)；滴定氨、弱有机碱和生物碱，但不适用于除草酸和苦味酸以外的有机酸；可与溴甲酚绿和亚甲基蓝组成混合指示剂以缩短变色域和提高变色的敏锐性；沉淀滴定的吸附指示剂，如用硝酸钍滴定氟离子；检定游离氯、亚氯酸盐等氧化剂；

甲基红（MR）试验：肠杆菌科的细菌在糖代谢过程中，分解葡萄糖，产生丙酮酸，丙酮酸再被分解，生成甲酸、乙酸、乳酸、琥珀酸。大肠杆菌分解丙酮 酸，次生的酸类较多，pH为4.5或更低，甲基红呈现红色（阳性）。在产气杆菌的培养液中一部分丙酮酸变为中性的乙酰甲基甲醇，生成的酸类较少，pH在5.4以上，甲基红呈现桔黄色（阴性）。  
丙酮酸：体内产生的三碳酮酸，它是糖酵解途径的最终产物，在细胞浆中还原成乳酸供能，或进入线粒体内氧化生成乙酰CoA，进入三羧酸循环，被氧化成二氧化碳和水，完成葡萄糖的有氧氧化供能过程。因此，丙酮酸是糖代谢中具有关键作用的中间产物。丙酮酸可通过乙酰CoA和三羧酸循环实现体内糖、脂肪和氨基酸间的互相转化，因此，丙酮酸在三大营养物质的代谢联系中起着重要的枢纽作用。
乙酰甲基甲醇生成试验（V—P试验）：细菌发酵葡萄糖生成丙酮酸，某些细菌可使丙酮酸脱羧形成乙酰甲基甲醇。在碱性溶液中，乙酰甲基甲醇可在空气中氧化成二乙酰（丁二酮）。二乙酰再与蛋白胨中精氨酸的胍基作用，生成红色化合物。试验中加入α—萘酚是作催化剂，使反应的颜色加深，提高反应的敏感性。

精氨酸：精氨酸可以算为一种双性氨基酸，这是因与主链最接近的旁链部份是较长、有机及疏水的，而 另一端的旁链则是一个胍基。这个胍基的酸度系数（pKa值）为12.48，在中性、酸性或碱性的环境下都是带正电殛的。因为在其双键及氮孤立电子对之间的共轭体系，使得其正电殛离开原位。这个胍基能形成多重的氢键。

6.4溴麝香草酚蓝（酸碱指示剂，用于枸橼酸盐利用实验）：也叫溴百里酚蓝。浅玫瑰色结晶性粉末，熔点200~202℃， 易溶于乙醇﹑醚﹑甲醇及稀氢氧化碱溶液。稍溶于苯﹑甲苯及二甲苯，微溶于水，几乎不溶于石油醚。 在碱性溶液中呈蓝色，在酸性溶液中呈黄色。 变色范围pH6.0(黄)～7.6(蓝)。 普通水是中性，pH也就是7左右，差不多呈淡蓝. 溶有二氧化碳后，由于会形成碳酸，碳酸是弱酸，因此pH不会降太多，变黄。当中过渡颜色是绿色或检测CO2的产生：使澄清石灰水变浑浊，并使溴麝香草酚蓝水溶液由蓝变绿再变黄
6.5 中性红：学名“3-氨基-7-甲氨基-2-甲基吩嗪盐酸盐”，是细胞活体染色和酸碱性指示剂的一种碱性吩嗪染料。中性红是一种弱碱性 pH 指示剂，变色范围 pH6.4～8.0之间（由红变黄）。在中性或微碱性环境中，植物的活细胞能大量吸收中性红并向液泡中排泌，由于液泡在一般情况下呈酸性反应，因此，进入液泡的中性红便解离出大量阳离子而呈现樱桃红色，在这种情况下，原生质和细胞壁一般不着色；死细胞由于原生质变性凝固，细胞液不能维持在液泡内，因此，用中性红染色后，不产生液泡着色现象，相反，中性红的阳离子，却与带有一定负电荷的原生质及细胞核结合，而使原生质与细胞核染色。
　　中性红的0.1%的60%乙醇溶液的变色范围是 6.8～8.0 红黄橙 pK=7.4
　　配方:中性红0.1 g; 蒸馏水100 ml. 使用时再稀释10倍左右.
6.6 革兰氏染液：

6.7硫酸亚铁-亚硫酸铋/柠檬酸铋铵-亚硫酸钠 ：亚硫酸产生硫化氢，并与铁产生沉淀，
亚硫酸铋被还原生成金属铋，使阳性培养物为具有金属光泽的棕色到黑色菌落,亚硫酸铋被还原生成金属铋
6.8苯酚红：由酚红(Phenolsulfonphthalein)所配制成的0.02~0.05%的醇溶液。当被测溶液的pH值小于6.8，则指示剂呈现黄色的酸性反应；若被测溶液的pH值大于8.4，则指示剂呈现红色的碱性反应。
赖氨酸：赖氨酸是人体必需氨基酸之一，能促进人体发育、增强免疫功能，并有提高中枢神经组织功能的作用。赖氨酸为碱性必需氨基酸。由于谷物食品中的赖氨酸含量甚低，且在加工过程中易被破坏而缺乏，故称为第一限制性氨基酸。
6.9酸性复红： 酸性复红，绿色金属光泽的深红色粉末或橄榄色到深橄榄绿色粗粉或小块；为玫苯胺(RosAnilinE)二磺酸钠盐和三磺酸钠盐、铵盐的混合物；1g溶于7ml水，微溶于乙醇；稀水溶液呈紫红色，极稀的水溶液(1∶10000)滴入浓氢氧化钠溶液而褪色，但对浓盐酸不褪色；红色到无色的pH为12～14；最大吸收波长 540～545nm(10mg/L,0.01%盐酸)；有刺激性
6.10 溴甲酚紫：酸碱指示剂，也可以用作乳酸乳球菌的培养基制备时的指示剂，其pH变色范围5.2(黄色)～6.8(紫色)；吸附指示剂；氨基酸色谱法内标；银盐法滴定硫氰酸盐；分光光度法沉淀血清蛋白。

6.11 ONPG: ONPG可迅速进入细菌细胞，被半乳糖苷酶水解，释出黄色的邻位硝基苯酚 (Orthonitrphenyl，ONP)，可以比色测定。乳糖测定就比较麻烦。另外，乳糖迟缓发酵菌只有β-D—半乳糖苷酶(胞内酶)，而缺乏β-半乳糖苷酶透性酶，因而乳糖进入细菌细胞很慢
6.11 七叶苷
具有抗炎、抗菌、抗血凝、镇痛等活性，对小鼠有显著的利尿作用。可抑制大鼠眼晶状体的醛糖还原酶，是枯草杆菌的生长抑制剂，同时对化学性至癌亦有抑制作用。
6，7二羟基香豆素：
　　白色或淡黄色针状结晶

6.12甘露醇：白色针状结晶。熔点166，相对密度1.52，1.489（20℃），沸点290-295℃（467kPa）。1g该品可溶于约5.5ml水(约18%，25℃)、83ml醇，较多地溶于热水，溶于吡啶和苯胺，不溶于醚。水溶液呈碱性。该品是山梨糖醇的异构化体，山梨糖醇的吸湿性很强，而该品完全没有吸湿性。甘露醇有甜味，其甜度相当于蔗糖的70%。

3. 菌落总数测定。
注：cfu（colony forming units）菌落形成单位
3.1 平板计数琼脂（ plate count agar ，PCA ）培养基
3.1.1 成分
胰蛋白胨 5.0 g 碳源、氮源、维生素、生长因子
酵母浸膏 2.5 g 碳源、氮源、维生素、生长因子
葡萄糖 1.0 g 可发酵糖，碳源
琼脂 15.0 g 凝固剂
蒸馏水 1000 ml
pH 7.0±0.2
3.1.2 制法
将上述成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH。分装试管或锥形瓶，121℃高压灭菌15 min。
3.2磷酸盐缓冲液
3.2.1 成分
磷酸二氢钾（KH2 PO4） 34.0g
蒸馏水 500ml
pH 7.2
3.2.2 制法
贮存液：称取34.0g的磷酸二氢钾溶于500ml蒸馏水中，用大约175 ml的1 mol/L氢氧化钠溶液调节
pH，用蒸馏水稀释至1 000 ml后贮存于冰箱。
稀释液：取贮存液1.25 ml，用蒸馏水稀释至1000 ml，分装于适宜容器中，121 ℃高压灭菌15 min 。
3.3 无菌生理盐水
3.3.1 成分
氯化钠 8.5g
蒸馏水 1000ml
3.3.2 制法
称取8.5ｇ氯化钠溶于1 000 mL 蒸馏水中，121 ℃高压灭菌15 min 。

分离与鉴别培养基中相关物质的作用原理
一． 大肠菌群、粪大肠菌群、大肠杆菌。
1. 定义
1.1大肠菌群：在一定培养条件（37℃）下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。
包括：艾希氏菌属（大肠艾希氏菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）—大肠杆菌属， 柠檬酸杆菌属，克雷伯氏菌属，肠杆菌属。
1.2粪大肠菌群：一群在44.5℃培养24h-48h能发酵乳糖、产酸产气的需氧兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。改菌群来自人和温血动物粪便，作为粪便污染指标评价食品的卫生状况，推断食品中肠道致病菌污染的可能性。
1.3大肠杆菌：大肠埃希氏菌，属肠杆菌科，埃希氏菌，为革兰氏阴性无芽孢杆菌，发酵乳糖产酸、产气，靛基质（I）、甲基红（MR）、V-P和枸橼酸（C）,四个生化反应为“++--”（典型大肠杆菌）或“-+--”（非典型大肠杆菌）
1.4肠杆菌科：伯杰氏细菌学分类手册将肠杆菌科定义为：革兰氏阴性无芽孢杆菌，需氧、兼性厌氧，还原硝酸盐为亚硝酸盐，发酵利用葡萄糖产酸产气，氧化酶阴性。（肠杆菌科作为指示菌仅限于欧洲）
2.关系：若大肠菌群和粪大肠菌群均高，一般多考虑为近期污染；若大肠菌群高，而粪大肠菌群低，则应着重考虑粪便的远期污染，这在一定条件下，对污染的来源以及工艺学意义可作恰当判断。大肠杆菌作为确证的粪便污染指标菌。其存在，暗示食品中可能存在肠道致病菌。
3.培养基组成及原理
3.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤
原    理：月桂基硫酸钠，别名月桂醇硫酸钠；十二烷基硫酸钠 ；K12；发泡粉；表面活性作用强，具有乳化作用
一种优质蛋白胨，是以新鲜牛肉和牛骨经胰酶消化，浓缩干燥而成的浅黄色粉末。具有色浅、易溶、透明、无沉淀等良好的物理性状。含有丰富的氮源、氨基酸等，可配制各种微生物培养基，用于细菌的培养、分离、增殖、鉴定，以及无菌试验培养基、厌氧菌培养基等细菌生化特性试验用培养基的配置。
配方（每升）：
胰蛋白胨或胰酪胨 20g 提供碳源和氮源满足细菌生长的需求
氯化钠 5g 氯化钠可维持均衡的渗透压
乳糖 5g 乳糖是大肠菌群可发酵的糖类
磷酸二氢钾 2.75g 缓冲剂
磷酸氢二钾 2.75g 缓冲剂
月桂基硫酸钠 0.1g 可抑制非大肠菌群细菌的生长。
最终 pH6.8±0.2
质控菌株接种后于36±1℃培养24h结果如下：
质控菌株
菌株编号
生长情况
其它特征
原因
肺炎克雷伯氏菌
ATCC10031
+++
产气

大肠埃希氏菌
ATCC25922
+++
产气

沙门氏菌
ATCC14028
+++
不产气

变形杆菌
ATCC13315
++
不产气

弗氏柠檬酸杆菌
ATCC43864
+++
产气

金黄色葡萄球菌
ATCC25923
-
 /

3.2 煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤（Brilliant Green Lactose Bile Broth）
配方：（g/L）
蛋白胨 10.0 提供氮源，碳源
乳糖 10.0 大肠菌群发酵乳糖产酸、产气
牛胆粉 20.0 抑制非肠杆菌科细菌
煌绿 0.0133 抑制非肠杆菌科细菌，此处不作为指示剂使用
pH值 7.2±0.1   25℃
原理：
       胆盐（Bile Salt）：是一种胆酸的钠盐，是胆酸的羧基和甘氨酸或牛磺酸(C2H7NO3S)的氨基(C2H5NO2)，通过酰胺键结合而成。
1. 可降低培养基与细菌细胞膜界面上的表面张力，使细胞膜紊乱，导致细菌自溶。
2. 肠杆菌科细菌在肠道内长期与胆汁接触。对胆盐有一定的抵抗力。合适的胆盐量能促进该科细菌的生长。
3. 胆盐遇酸生成沉淀，使菌落色素不致扩散从而有利于鉴别。
4. 胆盐中含有一定量的胆红素、粘蛋白、色氨酸，对不受胆盐抑制的细菌生长有营养作用。
煌绿（亮绿）：抑制革兰氏阳性菌和大多数非沙门氏菌的革兰氏阴性杆菌，通常抑制发酵乳糖、蔗糖的细菌。煌绿和枸櫞酸钠对大腸菌的生长、菌体蛋白质的合成和糖的利用都有显著的抑制作用,以煌绿的作用为较强。枸酸钠能抑制大腸菌的呼吸,而煌绿的抑制作用则较弱。混合胆盐及硫代硫酸钠对大腸菌的上述代谢活动都没有抑制作用。
用法：
将蛋白胨、乳糖溶于约500 ml蒸馏水中，加入牛胆粉溶液200 ml（将20.0 g 脱水牛胆粉溶于200 ml
蒸馏水中，调节pH至7.0～7.5），用蒸馏水稀释到975 ml，调节pH，再加入0.1%煌绿水溶液13.3 ml，
用蒸馏水补足到1000 ml，用棉花过滤后，分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10ml 。121 ℃高压灭
15 min 。
质量控制： 在36±1℃培养24-48小时。
质控菌株
菌株编号
生长情况
其它特征
肺炎克雷伯氏菌
ATCC13883
+++
产气
大肠埃希氏菌
ATCC25922
+++
产气
沙门氏菌
ATCC14028
+++
不产气
变形杆菌
ATCC13315
++
不产气
弗氏柠檬酸杆菌
ATCC8090
+++
产气
金黄色葡萄球菌
ATCC25923
-
 /

3.EC肉汤 (E.Coli Broth)
用途：用于粪大肠菌群、大肠杆菌的测定(GB2008、SN标准)
配方：（g/L）
胰蛋白胨 20.0 提供碳源，氮源
乳糖 5.0 大肠菌群利用乳糖产酸产气
氯化钠 5.0 维持平衡渗透压
磷酸氢二钾 4.0 缓冲剂
磷酸二氢钾 1.5 缓冲剂
三号胆盐 1.5 抑制革兰氏阳性菌的生长
pH值  6.9±0.2  25℃
质量控制：
 在44.5℃培养24-48小时。
质控菌株
菌株编号
生长情况
其它特征
粪大肠菌群

+++
产气
大肠埃希氏菌
ATCC25922
+++
产气
金黄色葡萄球菌
ATCC25923
-
 /
沙门氏菌
ATCC14028
+++
不产气

4.伊红美蓝琼脂(EMB)Eosin-Methylene Blue Agar
用途：弱选择性培养基，用于肠道菌的选择性分离
蛋白胨：是有机化合物。蛋白胨是将肉、酪素或明胶用酸或蛋白酶水解后干燥而成的外观呈淡黄色的粉剂，具有肉香的特殊气息。蛋白质经酸、碱或蛋白酶分解后也可形成蛋白胨。在胃内蛋白质的初步消化产物之一就是蛋白胨。蛋白胨富含有机氮化合物，也含有一些维生素和糖类。它可以作为微生物培养基的主要原料，在抗生素、医药工业、发酵工业、生化制品及微生物学科研等领域中的用量均很大，可以用来治疗消化道疾病；不同的生物体需要特定的氨基酸和多肽，因此存在着各种蛋白胨，一般来说，用于蛋白胨生产的蛋白包括动物蛋白（酪蛋白、肉类）和植物蛋白（豆类）等两种。
蛋白胨从来源上可分为动物性蛋白胨和植物性蛋白胨。胰胨、肉胨、骨胨等都是动物性蛋白胨，而大豆蛋白胨等则是植物性蛋白胨。
配方：（g/L）
蛋白胨 10.0 碳源、氮源、维生素、生长因子
乳糖 10.0 碳源，提供能量
磷酸氢二钾 2.0 缓冲剂
琼脂 15.0 凝固剂
伊红 0.4 抑菌剂、显色剂
美蓝   0.065 抑菌剂、显色剂
pH值 7.1 ± 0.2 25℃
原理：
伊红美蓝琼脂含有伊红和美蓝两种苯胺类染料，它们可以抑制革兰氏阳性菌的生长。
       伊红为酸性染料，美蓝为碱性染料。当大肠杆菌分解乳糖产酸时细菌带正电荷被染成红色，再与美蓝结合形成紫黑色菌落，并带有绿色金属光泽。而产气杆菌则形成呈棕色的大菌落。
　　在碱性环境中不分解乳糖产酸的细菌不着色，伊红和美蓝不能结合，故沙门氏菌等为无色或琥珀色半透明菌落。金葡菌在此培养基上不生长。
常用的伊红美蓝乳糖培养基，可用来鉴别饮用水和乳制品中是否存在大肠杆菌等细菌。如果有大肠杆菌，因其强烈分解乳糖而产生大量的混合酸，菌体带H+，故菌落被染成深紫色，从菌落表面的反射光中还可以看到金属光泽。
用法：
        称取本品  37.4g,加热搅拌溶解于 1000ml 蒸馏水中,分装三角瓶,121℃高压灭菌 15分钟, 备用。
质量控制：
 在36±1℃培养18-24小时。
质控菌株
菌株编号
生长情况
其它特征
金黄色葡萄球菌
ATCC25923
-
 /
大肠埃希氏菌
ATCC25922
+++
紫黑色菌落，有金属光泽
沙门氏菌
ATCC14028
+++
灰白色半透明菌落
福氏志贺氏菌
ATCC12022
+++
灰白色半透明菌落

5.营养琼脂斜面 营养琼脂（NA）Nutrient Agar
用途：细菌计数、不含糖，可作血琼脂基础和传代用(GB标准)
配方：（g/L）
蛋白胨  　 10.0g 碳源，氮源，维生素，氨基酸
牛肉粉      3.0g 碳源，氮源，维生素，氨基酸
氯化钠　　　 5.0g 保持渗透压
琼脂   　　 15.0g 凝固剂
PH值   7.3±0.1
质量控制：
 在36±1℃培养18-24小时。
质控菌株
菌株编号
生长情况
其它特征
金黄色葡萄球菌
ATCC 25923
+++
有黄色色素
化脓性链球菌
ATCC 12344
+++
无色透明小菌落
单增李斯特氏菌
ATCC 19114
+++
无色透明小菌落
大肠埃希氏菌
ATCC 25922
+++
无色透明大菌落
沙门氏菌
ATCC 14028
+++
无色大菌落
铜绿假单胞菌
CMCC 10104
+++
有绿色色素
蜡样芽孢杆菌
ATCC 11778
+++
白色不规则菌落
生化试验培养基配方原理
6.色氨酸肉汤
胰蛋白胨或胰酪蛋白胨 10.0g
蒸馏水 1000.0mL
试剂： Kovacs氏靛基质试剂
对二甲氨基苯甲醛 5.0g
戊醇 75.0mL
盐酸(浓) 25.0mL
将对二甲氨基苯甲醛溶于戊醇中，然后慢慢加入浓盐酸即可。
原理：细菌产生色氨酸酶，可分解蛋白胨中的色氨酸，生成靛基质（吲哚），靛基质与试剂对二甲基苯甲醛作用，生成玫瑰色靛基质。
7.MR-VP培养基Methyl Red Voges Proskauer Broth
用途：用于大肠杆菌的甲基红和VP试验(SN标准)
配方：（g/L）
月示胨 7.0
葡萄糖 5.0
磷酸氢二钾 5.0
pH值6.9 ± 0.2   25℃
试剂：甲基红
NaOH溶液
甲基红指示剂
甲基红 0.1g
95%乙醇 300mL
将甲基红溶解于300mL乙醇中，加水稀释至500mL
       甲基红（MR）试验：肠杆菌科的细菌在糖代谢过程中，分解葡萄糖，产生丙酮酸，丙酮酸再被分解，生成甲酸、乙酸、乳酸、琥珀酸。大肠杆菌分解丙酮 酸，次生的酸类较多，pH为4.5或更低，甲基红呈现红色（阳性）。在产气杆菌的培养液中一部分丙酮酸变为中性的乙酰甲基甲醇，生成的酸类较少，pH在5.4以上，甲基红呈现桔黄色（阴性）。  
Voges-Pros kauer (V-P)试剂
甲液
a-奈酚 5.0g 催化剂
无水乙醇 100.0mL
乙液
氢氧化钾 40.0g 调PH值至碱性
甩蒸馏水加至 100.0mL