生物化学简明教程 第二章 蛋白质.doc

生物化学简明教程（第四版）
第2章 蛋白质
1. 蛋白质：是由许多不同的α-氨基酸按一定的序列通过酰胺键（肽键）缩合而成的，具有较稳定的构象和一定生物功能的生物大分子。
2.蛋白质的生物学作用：蛋白质是生物体的重要组成成分；
蛋白质具有重要的生物学功能：
1）作为生物催化剂（酶）
2）物质的转运和储存
3）运动与支持作用
4）免疫保护作用
5）代谢调节作用
6）参与细胞间信息传递
氧化供能
3. 蛋白质是生物体的重要组成成分：
分布广：所有器官、组织都含有蛋白质；细胞的各个部分都含有蛋白质。
含量高：蛋白质是细胞内最丰富的有机分子，占人体干重的45％，某些组织含量更高，例如脾、肺及横纹肌等高达80％。
4. 蛋白质的元素组成：C（50~55%）、H（6~8%）、O（20~23%）、N（15~18%）、 S（0~4%）、…Others: P、Cu、Fe、Zn、Mn、Se、I等。
5. 每1g蛋白质中的氮相当于6.25g蛋白质。
6. 凯氏（Kjeldahl）定氮法：蛋白质含量=（总氮含量-无机氮含量）×6.25。
❤总结：从蛋白质水解物中分离出来的氨基酸有二十种，除脯氨酸和羟脯氨酸外，这些天然氨基酸在结构上的共同特点为：
(1)与羧基相邻的α-碳原子上都有一个氨基，因而称为α-氨基酸
(2)除甘氨酸外,其它所有氨基酸分子中的α-碳原子都为不对称碳原子,所以：
A.氨基酸都具有旋光性，[左旋（-）或右旋（+）]
B.每一种氨基酸都具有D-型和L-型两种立体异构体。目前已知的天然蛋白质中氨基酸都为L-型。

2.1 蛋白质的分类
2.1.1根据分子形状分类
1） 球状蛋白质：（globular protein）外形接近球形或椭圆形，溶解性较好，能形成结晶，大多数蛋白质属于这一类。颗星使多种多样的生物学功能。
2） 纤维状蛋白质(fibrous protein)分子构象类似纤维或细棒。它又可分为可溶性纤维状蛋白质和不溶性纤维状蛋白质。大多数不溶于水。
3） 膜蛋白质：一般折叠成近球形，插入生物膜。
2.1.2根据分子组成分类
1. 简单蛋白(simple protein) ：又称为单纯蛋白质；这类蛋白质只含由α-氨基酸组成的肽链，不含其它成分。（仅由肽链组成，不含有其他辅助成分的蛋白质。）
（1）清蛋白和球蛋白：（albumin and globulin）广泛存在于动物组织中。清蛋白易溶于水，球蛋白微溶于水，易溶于稀酸中。
（2）谷蛋白(glutelin)和醇溶谷蛋白(prolamin)：植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸、稀碱中，后者可溶于70－80％乙醇中。
（3）精蛋白和组蛋白：碱性蛋白质，存在与细胞核中。
（4）硬蛋白：存在于各种软骨、腱、毛、发、丝等组织中，分为角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白和丝蛋白。
2.结合蛋白(conjugated protein)：由简单蛋白与其它非蛋白成分结 合而成，其辅助成分通常称为辅基。
（1）核蛋白：由简单蛋白与核酸结合而成。如细胞核中的核糖核蛋白等。
（2）糖蛋白与蛋白聚糖：由简单蛋白与糖类物质组成。如细胞膜中的糖蛋白等。糖与蛋白质的结合方式：O连接和N连接
（3）脂蛋白：由简单蛋白与脂类结合而成。 如血清a-，b-脂蛋白等。
（4）色蛋白：由简单蛋白与色素结合而成。如血红素、过氧化氢酶、细胞色素c等。
（5）磷蛋白：由简单蛋白质和磷酸组成。如胃蛋白酶、酪蛋白、角蛋白、弹性蛋白、丝心蛋白等。
2.1.3根据功能分类
酶
调节蛋白
贮存蛋白
转运蛋白质
运动蛋白
防御蛋白和毒蛋白
受体蛋白
支架蛋白
结构蛋白
异常功能
2.2蛋白质的组成单位——氨基酸
氨基酸 （amino acid) 是蛋白质的基本组成单位。从细菌到人类，所有蛋白质都由20种标准氨基酸组成。
2.2.1氨基酸的结构通式

2.2.2氨基酸的分类
1. 根据R基的化学结构，可将氨基酸分为
①脂肪族氨基酸（疏水性：Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Cys；极性：Arg、Lys、Asp、Glu、Asn、Gln、Ser、Thr）
②芳香族氨基酸：Phe、Tyr
③杂环氨基酸：Trp、His
④杂环亚氨基酸：Pro
2. 按照R基的极性：
①非极性R基氨基酸：Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Met、Pro、Trp
②不带电荷的极性R基氨基酸：Ser、Thr、Asn、Gln、Tyr、Cys
③极性带负电荷的R基氨基酸：Asp、Glu
④极性带正电荷的R基氨基酸：His、Lys、Arg
3. 20种常见氨基酸的名称和结构式（见教材P22-24）
4. 20种标准氨基酸

❤总结：①属于芳香族氨基酸的是：色氨酸Trp、酪氨酸Tyr、苯丙氨酸Phe
②属于亚氨基酸的是：脯氨酸Pro
③含硫氨基酸包括：半胱氨酸Cys、甲硫氨酸Met
④分子量最小的氨基酸是:甘氨酸Gly
⑤能形成二硫键的氨基酸是:半胱氨酸Cys
⑥含二羧基一氨基的氨基酸有：谷氨酸Glu、天冬氨酸Asp
2.2.3氨基酸的理化性质
◆一般物理性质：
1.①氨基酸一般有味（无味、甜、苦、鲜等）；②一般均溶于水，溶于酸、碱中；不溶于有机溶剂。③高熔点（200℃以上）
2.氨基酸的旋光性及立体异构：除甘氨酸外，氨基酸含有一个手性a-碳原子，因此都具有旋光性[左旋（-）或右旋（+）]，比旋光度是氨基酸的重要物理常数之一，是鉴别各种氨基酸的重要依据。
3.氨基酸的光吸收：①构成蛋白质的20种氨基酸在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区(<220nm)均有光吸收。②在近紫外区(220-300nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。③酪氨酸的lmax＝275nm，苯丙氨酸的lmax＝257nm，色氨酸的lmax＝280nm。
4.两性电离和等电点： 氨基酸在水溶液中或在晶体状态时都以离子形式存在，所谓两性离子是指在同一个氨基酸分子上带有能放出质子的—NH3+正离子和能接受质子的—COO-负离子，因此氨基酸为两性电解质。
5.等电点：调节氨基酸溶液的pH，使氨基酸分子上的—NH3+基和—COO-基的解离程度完全相等时，即所带净电荷为零，此时氨基酸所处溶液的pH值称为该氨基酸的等电点（pI）。 （当氨基酸相互连接成蛋白质时，只有其侧链基团和末端的α-氨基，α-羧基是可以离子化的。）
6.移动定义：在电场中，不向任何一极移动。（此时溶液的
PH也叫做氨基酸的等电点。）
7. 氨基酸等电点的确定：
①酸碱滴定（滴定曲线）
②根据pK值（该基团在此pH一半解离）计算：等电点等于两性离子两侧pK值的算术平均数。pI=或者 pI=
❤注意：对多氨基和多羧基氨基酸的解离原则：

❤结论：①中性氨基酸：pK1为α—羧基的解离常数，pK2为α—氨基的解离常数。pI=(pK1+pK2)/2
②酸性氨基酸：pK1为α—羧基的解离常数，pK2为侧链羧基的解离常数。pI=(pK1+pK2)/2
③碱性氨基酸：pK2为α—氨基的解离常数，pK3为侧链氨基的解离常数。pI=(pK2+pK3)/2
8.等电点的应用：pH>pI，aa“-”，aa向正极移动
pH<pI，aa“+”，aa向负极移动
pH=pI，aa“0”，aa不移动
溶液的pH偏离pI越远，氨基酸带净电荷越多，在电场中越容易分离。
利用不同的氨基酸在同一pH下所带电荷不同而分离，如用阴离子交换树脂柱层析分离氨基酸。
等电点时,氨基酸溶解度最小，容易聚集沉淀。
◆化学性质：
1. 与茚三酮的反应：①氨基酸与水合茚三酮共热，发生氧化脱氨反应，生成NH3与酮酸。水合茚三酮变为还原型茚三酮。②加热过程中酮酸裂解，放出CO2，自身变为少一个碳的醛。水合茚三酮变为还原型茚三酮。③NH3与水合茚三酮及还原型茚三酮脱水缩合，生成蓝紫色化合物。

◎脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应产生黄色物质。
◎反应要点与应用：A.该反应由-NH2与-COOH共同参与B.茚三酮是强氧化剂C.用于氨基酸的定性、定量分析D.该反应非常灵敏，可在λ＝570nm测定吸光值E.测定范围：0.5~50µg/ml F.脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮直接生成黄色物质（不释放NH3）
2. 与甲醛的反应：氨基酸的甲醛滴定法
A.为α- NH2的反应

B.在常温，中性条件，甲醛与α- NH2很快反应，生成羟甲基衍生物，释放氢离子。
◎应用：①氨基酸定量分析---氨基酸的甲醛滴定法（间接滴定）
A.直接滴定，终点pH过高（12），没有适当指示剂。
B.与甲醛反应，滴定终点在9左右，可用酚酞作指示剂。
C.释放一个氢离子，相当于一个氨基（摩尔比1：1）
②简单快速，一般用于测定蛋白质的水解或合成的速度..
3. 与2,4-二硝基氟苯(DNFB)的反应：
A.为α- NH2的反应
B.氨基酸α- NH2的一个H原子，在弱碱性条件下，与DNFB发生芳环取代，生成黄色的2,4—二硝基苯基氨基酸（DNP—氨基酸，稳定）
◎应用：①鉴定多肽或蛋白质的N-末端氨基酸②此反应首先由Sanger应用测定蛋白质中氨基酸的排序，确定了胰岛素的一级结构
③5—二甲氨基萘磺酰氯（DNS—Cl，又称丹磺酰氯）可以代替DNFB试剂测定蛋白质的N端氨基酸，灵敏度高。
4. 与异硫氰酸苯酯（PITC）的反应：重复测定多肽链N端氨基酸排列顺序，设计出“多肽顺序自动分析仪”
在弱碱性条件下，氨基酸中的α—氨基与异硫氰酸苯酯（PITC）反应，生成相应的苯氨基硫甲酰氨基酸（PTC—氨基酸）
◎反应特点及应用：①为α- NH2的反应②由Edman于1950年首先提出用于N末端分析，又称Edman降解法,此法的特点是能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。
5. 与亚硝酸的反应：在标准条件下测定生成氮气的体积，可计算氨基酸的量，称为范斯莱克法。
6. 与荧光胺的反应：①氨基酸与荧光胺反应生成具有荧光的产物，是α- NH2的反应②用于氨基酸定量分析③根据荧光强度测定氨基酸含量（ng级）③激发波长λx=390nm，发射波长λm=475nm。灵敏度高。
7. 与5,5′-双硫基-双（2-)硝基苯甲酸反应：-SH的反应,测定样品中游离- SH的含量
2.3 肽
2.3.1肽的结构
1.一个氨基酸的α-羧基和另一个氨基酸的α-氨基脱水缩合而成的化合物称为肽。氨基酸之间脱水后形成的键称肽键（酰胺键）
2.多肽（链）：多个氨基酸残基之间以肽键连接起来的链状化合物叫多肽或多肽链。
3.氨基酸残基：肽链中的每个氨基酸单位在形成肽链时，释放一分子水，因此被称为一个氨基酸“残基”。
4.多肽链有方向性：N 末端：多肽链中有自由氨基的一端；C 末端：多肽链中有自由羧基的一端。 书写时规定将N端放在左边，C端放在右边；命名时，从N端开始，除C端氨基酸外其他氨基酸残基的名称均将“酸”改为“酰”。
5.肽键的特点：

肽键平面——由于肽键具有部分双键的性质，使参与肽键构成的六个原子被束缚在同一平面上，这一平面称为肽键平面或肽单元。
6.

2.3.2生物活性肽的功能
生物活性肽（biological active peptide,BAP）是能够调节生物机体的生命活动或具有某些生理活性的寡肽和多肽的总称。
1.谷光甘肽（GSH）

分子中具有一个由谷氨酸的γ-羧基和半胱氨酸的α-氨基脱水缩合的γ-肽键。
谷胱甘肽的作用：含有自由的巯基，具有很强的还原性，可作为体内重要的还原剂，保护某些蛋白质或酶分子中的巯基免遭氧化，使其处于活性状态。

2.催产素和升压素

3. 促肾上腺皮质激素（ACTH）
39肽，活性部位为第4~10位的7肽片段：Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly。
4. 脑肽
脑啡肽具有强烈的镇痛作用（强于吗啡），不上瘾。
Met-脑啡肽 Tyr-Gly-Gly-Phe-Met
Leu-脑啡肽 Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu
β-内啡肽（31肽）具有较强的吗啡样活性与镇痛作用。
5.胰高血糖素
由胰岛α-细胞分泌（β-细胞分泌胰岛素），29肽。胰高血糖素调节 维持血糖浓度。
6.胃肠道活性肽
2.4蛋白质的结构
蛋白质是氨基酸以肽键相互连接的线性序列,在蛋白质中，多肽链折叠形成特殊的形状（构象,conformation）。在结构中，这种构象是原子的三维排列，由氨基酸序列决定。

2.4.1蛋白质的一级结构（化学结构）
1.蛋白质的一级结构指蛋白质多肽链中AA的序列，也包括二硫键的位置。
2.在基因编码的蛋白质中，这种序列是由mRNA中的核苷酸序列决定的。
3.一级结构中包含的共价键：主要指肽键（peptide bond）和二硫键（disulfide bond）
2.4.2 蛋白质的空间结构（构象、高级结构）
1. 构象是蛋白质分子中所有原子在三维空间的排列分布和肽链的走向。
2. 研究蛋白质构象的方法：
①X射线衍射法：
②研究溶液中蛋白质构象的光谱方法：紫外差光谱，荧光和荧光偏振，圆二色性，核磁共振（NMR）
3. 稳定蛋白质空间结构的作用力：

4. 蛋白质的二级结构：
①蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，即该段肽链主链骨架原子的相对空间位置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象 。
②主要的化学键：氢键
③蛋白质二级结构的主要形式：α-螺旋 (α-helix )，β-折叠 (β-pleated sheet )，β-转角 (β-turn )，无规卷曲 ( random coil )
♡α-螺旋 (α-helix ) Pauling和Corey于1951年提出
是多肽链的主链原子沿一中心轴盘绕所形成的有规律的螺旋构象
*要点：单链，右旋，一圈3.6残基，上升0.54nm
维系力：氢键，且全部平行，R－基指向外侧
*结构特征：
⑴螺旋的每圈有3.6个氨基酸残基，每个氨基酸残基的高度为0.15nm，螺旋间距离为0.54nm，每个残基沿轴旋转100°，螺旋直径0.6nm。
⑵每个肽键的羰基氧与远在第四个氨基酸氨基上的氢形成氢键，氢键的走向平行于螺旋轴，所有肽键都能参与链内氢键的形成。
—C—(NH—C—CO)3 N—
O
H
H
R

*结构的特点：
3.613螺旋(ns)
此外还有： 310， 4.416
⑶R侧链基团伸向螺旋的外侧。
⑷绝大多数天然蛋白质中的α-螺旋几乎都是右手螺旋
*影响α-螺旋形成的因素：①在多肽链中连续的出现带同种电荷的极性氨基酸，α-螺旋就不稳定。（Lys、Glu）②在多肽链中只要出现pro，α-螺旋就被中断，产生一个弯曲（bend）或结节。③Gly的R基太小，难以形成α-螺旋所需的两面角，所以和Pro一样也是螺旋的最大破坏者。④肽链中连续出现带庞大侧链的氨基酸如Ile，由于空间位阻，也难以形成α-螺旋。
♡β-折叠结构（β-pleated sheet）
①β-折叠或β-折叠片，也称β-结构或β-构象。
β-折叠是由两条或多条几乎完全伸展的多肽链平行排列，通过链间的氢键进行交联而形成的，或一条肽链内的不同肽段间靠氢键而形成的。肽链的主链呈锯齿状折叠构象。
β-折叠结构几乎所有肽键都参与链间氢键的形成，氢键与链的长轴接近垂直。
氨基酸侧链伸展在折叠片的上面和下面。
②β-折叠有两种类型：一种为平行式，另一种为反平行式
平行式：N端在同一端。氨基酸残基的长度0.325nm
反平行式：N端不在同一端。氨基酸残基的长度0.347nm
◇丝心蛋白的构象：⑴丝心蛋白的性能：丝心蛋白具有抗张强度高，质地柔软的特性。具有0.7nm的周期。⑵丝心蛋白(fibroin)是蚕丝和蜘蛛丝的一种蛋白质。⑶构象：丝心蛋白是典型的反平行β折叠片，多肽链取锯齿状折叠构象。侧链交替地分布在折叠片的两侧。反平行β折叠片以平行的方式堆积成多层结构。链间主要氢键连接，层间主要靠范德华力维系。
♡β-转角（β-turn）
①肽链回折180度,在β-转角部分，由四个氨基酸残基组成;(常见氨基酸：Pro,Gly)
②以主链间氢键维持稳定。弯曲处的第一个氨基酸残基的-C=O 和第四个残基的–N-H 之间形成氢键，形成一个不很稳定的环状结构。
③这类结构主要存在于球状蛋白分子中。
♡β凸起（β-bugle）
①在某些反平行的β片层中，有一股β折叠中有一个残基的肽键没有参与和相邻的β折叠间的氢键，致使这一部位有所凸起，这一现象被称为β凸起
②是一种小片的非重复性结构，能单独存在，但大多数经常作为反平行β折叠片中的一种不规则情况而存在。
③β凸起可认为是β折叠股中额外插入的一个残基，它使得在两个正常氢键之间、在凸起折叠股上是两个残基，而另一侧的正常股上是一个残基。
♡无规卷曲或自由回转(random coil)
①指无规律的松散肽链结构
②在一般球蛋白分子中，往往含有大量的无规则卷曲，它使蛋白质肽链从整体上形成球状构象。
③没有一定规律的松散肽链结构。常常是酶的活性部位。
5.超二级结构和结构域
①超二级结构(super-secondary structures) :是指若干相邻的二级结构中的构象单元彼此相互作用，形成有规则的，在空间上能辨认的二级结构组合体。是蛋白质二级结构至三级结构层次的一种过渡态构象层次。
②超二级结构的基本类型：αα，ββ，βαβ，βββ
③模体：在许多蛋白质分子中，可发现二个或三个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个特殊的空间构象，被称为模体(motif)。
④结构域：是球状蛋白质的折叠单位。多肽链在超二级结构的基础上进一步绕曲折叠成紧密的近似球形的结构，具有部分生物功能。
对于较大的蛋白质分子或亚基，多肽链往往由两个以上结构域缔合而成三级结构。
◆类型： α-螺旋域；β-折叠域；α+β域；α /β域；无规则卷曲+β-回折域；无规则卷曲+ α -螺旋结构域等
6. 蛋白质的三级结构
①多肽链在二级结构、超二级结构和结构域的基础上，主链构象和侧链构象相互作用，沿三维空间多方向卷曲，进一步盘曲折叠形成特定的球状分子结构。是多肽链上的所有原子（包括主链和侧链）在三维空间的分布。
②主要的化学键：疏水键、离子键、氢键和 Van der Waals力等。
③三级结构的特征：含多种二级结构单元，如α螺旋、β折叠等；
有明显的折叠层次；是紧密的球状或椭球状实体；分子表面有一空穴(活性部位)；疏水侧链埋藏在分子内部，亲水侧链暴露在分子表面。主要由疏水作用力维持
实例：肌红蛋白
肌红蛋白的结构与功能：
⑴功能：哺乳动物肌肉中储存氧并运输氧的蛋白。
⑵肌红蛋白的结构特点：
a. 一条多肽链，153个氨基酸残基，一个血红素辅基，分子量17800道尔顿。
b. 肌红蛋白的整个分子具有外圆中空的不对称结构，肽链共折叠成8段长度不等的α-螺旋体（A-H），最长的有23个氨基酸残基，最短的有7个氨基酸残基。拐弯处多由Pro、Ser、Ile、Thr等组成。
c.具有极性侧链的氨基酸残基分布于分子表面，而带非极性侧链的氨基酸残基多分布于分子内部，使肌红蛋白成为可溶性蛋白。
⑶辅基血红素：Fe原子被称为原卟啉IX（9）的有机分子固定的，共称血红素（Heme），使血液呈红色。Fe有六个配位键，其中四个与卟啉的吡咯环的N原子相连。Fe2+称亚铁血红素，Fe3+为高铁血红素，只有Fe2+的蛋白才能结合氧。
7. 蛋白质的四级结构：
①四级结构是指由两个或两个以上具有三级结构的多肽链按一定方式聚合而成的特定构象的蛋白质分子。其中每条多肽链称为亚基(subunit)。
②通常亚基只有一条多肽链，但有的亚基由两条或多条多肽链组成，亚基单独存在时无生物学活性。当亚基聚合成为具有完整四级结构的蛋白质后，才有功能。
③亚基之间的结合力主要是疏水作用，其次是氢键和离子键。
④一般来说具有四级结构的蛋白属于寡聚蛋白。
例如：血红蛋白。
⑤四级缔合在结构和功能上的优越性：
a.降低比表面积，增加蛋白质的稳定性。
b.丰富蛋白质的结构，以行使更复杂的功能。
c.提高基因编码的效率和经济性。
d.使酶的催化基团汇集，提高催化效率。
e.形成一定的几何形状，如细菌鞭毛。
f.适当降低溶液渗透压。
g.具有协同效应和别构效应，实现对酶活性的调节。
●总结：
蛋白质的一级结构是它的氨基酸序列
蛋白质的二级结构是由氢键导致的肽链卷曲与折叠
蛋白质的三级结构是多肽链自然形成的三维结构
蛋白质的四级结构是亚基的空间排列
一个天然蛋白质在一定条件下，往往只有一种或很少几种构象。
用一个蛋白质中各个原子范德华体积的总和，除以蛋白质所占体积即得装配密度，一般0.73~0.77
由两条或两条以上的肽链组成，亚基的种类和数目都不一定相同。
2.5 蛋白质结构与功能的关系
蛋白质分子具有多样的生物学功能，需要一定的化学结构，还需要一定的空间构象。
2.5.1 蛋白质一级结构与功能的关系
1.种属差异：蛋白质一级结构的种属差异十分明显，但相同部分氨基酸对蛋白质的功能起决定作用。
根据蛋白质结构上的差异，可以断定它们在亲缘关系上的远近。举例——胰岛素，细胞色素C
一级结构相似的多肽或蛋白质，其空间构象以及功能也相似。
2.分子病：分子病的概念：由于遗传基因的突变导致蛋白质分子结构的改变或某种蛋白质缺乏引起的疾病。例如：镰刀性贫血病
结论：蛋白质的一级结构决定它的空间结构，而特定的空间结构是蛋白质具有生物活性的保证。
2.5.2蛋白质构象与功能的关系
1.别构效应：又称变构效应，是指寡聚蛋白与配基结合，改变蛋白质构象，导致蛋白质生物活性改变的现象。
例：血红蛋白的别构效应
2. 蛋白质构象改变与疾病：
蛋白质构象疾病：若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生。
蛋白质构象改变导致疾病的机理：有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。
这类疾病包括：人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。
2.6 蛋白质的性质与分离、分析技术
2.6.1 蛋白质的性质
1. 蛋白质相对分子量：在10 000~1 000 000之间。测定分子量的主要方法有渗透压法、超离心法、凝胶过滤法、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。
2. 蛋白质的两性电离及等电点：
①蛋白质的等电点( isoelectric point, pI)调节溶液的pH，使蛋白质所带的正、负电荷相等，即成为兼性离子，净电荷为零，在电场中既不向阳极移动，也不向阴极移动，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。
3. 蛋白质的变性(denaturation)：
①概念：在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失。
②变性的本质：破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白质的一级结构。
③造成变性的因素：如加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂等 。
④复性(renaturation)：若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性。
⑤变性蛋白质的特点：失去生物活性 ，溶解度减小，粘度加大，结晶能力减弱，容易被酶水解消化。
⑥变性的分类：
a.可逆变性：例如，把经过短时间煮沸的胰蛋白酶冷却，可以恢复天然胰蛋白酶的性质(如结晶性、活性等)。
b.不可逆变性：例如，煮熟的鸡蛋
⑦变性应用：变性在医学上有很重要意义。临床上常用高温、紫外线、酒精等物理或化学方法使细菌或病毒的蛋白质变性而失去致病及繁殖能力。在实践中，也有许多为提高某些生物制品的活性，要防止蛋白质的变性，如制取抗血清、疫苗等。
4. 蛋白质的凝固作用(protein coagulation)：蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。
5. 蛋白质的胶体性质：
①蛋白质分子的颗粒直径已达1~100nm，处于胶体颗粒的范围。
②布朗运动、丁道尔现象、电泳现象，不能透过半透膜，具有吸附能力
③蛋白质溶液稳定的原因：表面形成水膜（水化层）；带相同电荷。
④透析：由于蛋白质分子体积很大,不能透过半透膜,而小分子物质能透过半透膜,这样可把蛋白质分子与小分子物质分开,这个过程叫透析.
6. 蛋白质的沉淀反应：
①中性盐沉淀反应 ：
加盐使蛋白质沉淀析出---------盐析
稀盐可使蛋白质表面同性电荷增加，增加蛋白质分子间的排斥, 同时与水分子间的作用增强,而增加溶解性—盐溶作用；高盐破坏水膜、中和电荷, 蛋白质聚集沉淀—盐析, 不同蛋白质盐析的盐浓度不同, 故用不同盐浓度分级沉淀蛋白质, 分离的蛋白质不变性。
分段盐析：调节盐浓度，可使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分段析出。如：血清球蛋白（50%(NH4)2SO4饱和度），清蛋白（饱和(NH4)2SO4)。
②有机溶剂沉淀反应：用与水互溶的乙醇、丙酮等夺取水膜, 等电点时加入更易沉淀, 不同蛋白质所需溶剂浓度不同-------分级沉淀, 但易引起变性，与有机溶剂浓度、作用时间和沉淀温度有关
条件：低温（0~4。C），PH=PI
③重金属盐沉淀反应： 蛋白质在pH＞pI时为负离子, 可与Cu2+/Hg2+/ Ag+/Pb2+等结合为不溶性蛋白盐而沉淀
④加某些酸类的沉淀反应：蛋白质在pH<pI时带正电荷, 可与苦味酸 、磷钨酸、鞣酸、三氯醋酸、磺基水杨酸等结合沉淀。苦味酸、钼酸、钨酸、三氯乙酸、单宁酸、能沉淀生物碱，称生物碱试剂。
◇可逆沉淀
(1)在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。
(2) 在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀。
(3)可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。
◇不可逆沉淀
(1)在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。
(2)由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。
(3)如加热沉淀、强酸、碱沉淀、重金属盐沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。

8. 蛋白质含量的测定：考马斯亮蓝G-250法，紫外吸收法，凯氏定氮法，其它方法。
9. 蛋白质的紫外吸收：由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。
2.6.2蛋白质的分离和分析技术
1.根据蛋白质溶解度不同进行分离
①盐析(salt precipitation)是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。
②使用丙酮沉淀时，必须在0～4℃低温下进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。
2. 根据蛋白质分子大小进行分离
①透析及超滤法：a.透析(dialysis):利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。
b.超滤法:应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。
②层析法
③凝胶过滤(gel filtration)又称分子筛层析，利用各蛋白质分子大小不同分离。
④离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。
3. 根据蛋白质带电性质进行分离
蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术, 称为电泳(elctrophoresis) 。
根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电泳等。
*SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质分子量的测定。
*等电聚焦电泳，通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。
*双向凝胶电泳是蛋白质组学研究的重要技术。
4. 根据配体特异性进行分离
亲和层析法:亲和层析利用待分离物质和它的特异性配体间具有特异的亲和力，从而达到分离的目的。
2.6.3蛋白质分子中氨基酸序列的测定
1.测定蛋白质分子中氨基酸序列的测定要求：
a、样品必须是均一的，纯度应在97%以上；
b、知道蛋白质的分子质量，其误差允许在10%左右。
2.基本原理：
(1)测定末端氨基酸数目，确定蛋白质分子是由几条肽链构成的；
(2)拆分蛋白质分子的多肽链，断开多肽链内二硫键并分离出每条肽链。
(3)将肽链完全水解，测定每条多肽链的氨基酸组成
(4)鉴定多肽链N－末端、C－末端氨基酸残基
(5)至少用两种方法将多肽链水解成较小的片段；
(6)分离并测定各肽段的氨基酸序列；
(7)片段重叠法重建完整多肽链一级结构；
(8)确定半胱氨酸残基间形成二硫键交联桥的位置。
3.具体方法：
①多肽链的分离：如果蛋白质含有一条以上的肽链，须分离纯化各肽链。试剂：8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍或高浓度盐
②拆分蛋白质的多肽链，断开多肽链内二硫键,方法如下:
⑴过甲酸氧化法：用过甲酸氧化，使胱氨酸部分氧化成2个半胱氨磺酸。
⑵还原法：几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的β-巯基乙醇（或二硫苏糖醇）处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂（ICH2COOH）保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。
⑶Cleland试剂的还原作用
③分析每一条多肽链的氨基酸组成：经分离、纯化的多肽链一部分样品进行完全水解，测定它的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比或各种残基的数目。常用6mol/LHCl水解蛋白质。
④鉴定多肽链N－末端残基：
方法:Sanger法（二硝基氟苯反应），DNS法（丹磺酰氯反应），Edman法（异硫氰酸苯脂反应），氨肽酶法。
⑤C－末端分析方法：肼解法，羧肽酶法（羧肽酶是一种肽链外切酶，它专一地从肽链的C端依次切下一个氨基酸残基，释放出游离的氨基酸。
），LiBH4还原法。
⑥裂解多肽链成较小的片段：
酶解法：如：胰蛋白酶（Lys和Arg侧链专一性较强，水解速度快。
Pro水解受抑。），糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶，胰凝乳蛋白酶（Phe, Trp,Tyr时水解快;Leu，Met和His水解稍慢。）
化学法（可获得较大的肽段）：溴化氰法（能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。），羟胺法（专一性断裂-Asp-Gly-之间的肽键。也能部分裂解-Asn-Leu-之间的肽键以及-Asn-Ala-之间的肽键。）
●常用的断裂多肽链的方法：
溴化氰裂解法：专一性水解Met的羧基端；
胰蛋白酶水解法：专一性水解Lys、Arg的羧基端；
胰凝乳蛋白酶水；解法：专一性水解Tyr、Phe、Trp的羧基端；
胃蛋白酶水解法：专一性断裂键两端都是疏水氨基酸；
金黄色葡萄球菌
蛋白酶水解法：专一性水解Glu、 Asp的羧基端；
梭状芽孢杆菌蛋白酶水解法：专一性水解Arg的羧基端。
⑦肽段氨基酸序列的测定：Edman降解法，质谱法，通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列
⑧肽段的拼接：将两套不同肽段的氨基酸顺序进行比较，以获得完整的蛋白质分子的氨基酸顺序。
⑨确定半胱氨酸残基间形成二硫键交联桥的位置： 蛋白质一级结构的顺序测定完成后，将未拆开二硫键的同一种蛋白质再一次进行专一性的酶解，由此就可以确定完整的蛋白质中二硫键的位置。
方法：
采用胃蛋白酶水解：切点多，生成的肽段包括含二硫键的肽段都比较小；酸性环境下防止二硫键发生交换，二硫键稳定。
将所得的肽段利用对角线电泳技术进行分离。
然后同其它方法分析的肽段进行比较，确定二硫键的位置。