TCR的研究报告.docx

TCR 的研究进展一、 概述1、什么是肿瘤？肿瘤（Tumor）是机体在各种致癌因素作用下，局部组织的某一个细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，导致其克隆性异常增生而形成的新生物。一般认为，肿瘤细胞是单克隆性的，即一个肿瘤中的所有瘤细胞均是一个突变的细胞的后代。 一般将肿瘤分为良性和恶性两大类。所有的恶性肿瘤总称为癌症（cancer）。2、治疗肿瘤的常规方法 纵观传统治疗恶性肿瘤方法，肿瘤外科学、肿瘤放射学、肿瘤化学是现代肿瘤的三大支柱。三种手段各有千秋。 外科手术和放射都为局部方法，因为以往外科学家和放射学家对肿瘤的概念及结构的认识极为相似，两者都认为恶性肿瘤发生在局部，侵犯周围组织，经淋巴管、血管或通过自然腔隙转移，它的重点是原发病灶、局部侵犯和区域淋巴结转移。这两种，对大多数早、中期肿瘤是最有效的手段。但对中、晚期恶性肿瘤而言，往往因局部不彻底，残留病灶的复发及远地转移而毙命。当然手术和放疗在技术和措施上有较大差异，手术更能将相对静止细胞及对放疗不敏感的肿瘤，有根治的可能，但受细胞的缺氧程度、肿瘤类型与细胞修复等的因素的影响，对肿瘤局部的控制不如外科手术，但对因解剖部位肿瘤侵犯较为广泛的，特别是临近临近中要结构手术切除困难及亚临床灶的存在，放疗有更大的适应症及灵活性。 虽然手术与放疗控制局部肿瘤有效，但对大多数恶性肿瘤而言，一开始就应看作是全身性疾病，大多数需要与化疗结合。肿瘤化疗是一个发展迅速的领域。目前单用化疗即可以至于某些肿瘤如小二急淋等外，许多恶性肿瘤几乎必需有化疗参与才能治愈；对中期恶性肿瘤的术前、术中化疗、术后辅助化疗；对化疗有一定敏感性的肿瘤放疗增敏；手术、放疗后复发转移癌的姑息等应用日渐广泛。但尽管新药不断问世，化疗方法不断进步，但对大多数实体恶性肿瘤而言，因肿瘤对化疗药物的多药耐药、肿瘤的异质性、缺氧细胞的不敏感性等，都很难达到根治的效果。3、现代治疗肿瘤的新发现 80年代的开始的生物，不断推出新疗法，如过继性免疫疗法，细胞因子法，基因疫苗法等等。其中，过继细胞免疫治疗(ACT)在血液系统疾病 的临床应用已获得广泛认可，尤其在目前疫苗免疫治疗还存在着不能有效一直微小残留肿瘤生长等多种因素而限制了其临床应用的前提下，ACT在实体肿瘤治疗中的应用研究也引起了人们的普遍关注。ACT可通过体外扩增筛选出高活性的免疫效应细胞，将其转入宿主体内并建立长期的特异性抗肿瘤免疫效应，具有良好的应用前景，成为今年来肿瘤免疫治疗中十分活跃的研究领域。图表1：肿瘤各种疗法的对比图二、 过继细胞免疫治疗（ACT） 图表2：肿瘤生物治疗的发展史在发展的前期，肿瘤过继免疫疗法是将自身或异体的抗肿瘤效应细胞的前体细胞，在体外采用IL-2、抗CD3单抗，特异性多肽等激活剂进行诱导、激活和扩增，然后转输给肿瘤患者，提高患者抗肿瘤免疫力，以达到治疗和预防复发的目的。图表3：肿瘤过继免疫疗法的图解说明细胞免疫治疗的技术已经发展至第三代，第一代是CIK (自体细胞免疫疗法)，第二代是CA R -T (嵌合抗原受体T细胞免疫疗法)，第三代是T C R -T (特异性T细胞受体免疫疗法)。1、CAR-TCAR-T疗法的核心机制是通过特异性地识别肿瘤相关抗原，使效应T细胞的靶向性、杀伤活性和持久性较常规应用的免疫细胞大幅提高，从而打破宿主免疫耐受状态，克服免疫逃逸，最终杀灭肿瘤细胞。CAR结构自1989年起，不断改进，目前为止已发展到第4代。第1代CAR信号肽只有TCR/CD3链或免疫球蛋白Fc受体FcRI链单一信号分子，虽能识别靶抗原并靶向激活T细胞，但由于缺乏协同刺激分子不能充分激活T细胞，而且活化的T细胞在体内存在时间短。第2代CAR信号肽添加了一个协同刺激分子，能够更好的为CAR-T细胞提供活化信号，这样CAR识别肿瘤细胞后能够同时活化协同刺激分子和胞内信号，实现双重活化，能明显提高T细胞增殖分泌能力和抗肿瘤效应。第3代CAR信号肽区整合2个以上的协同刺激分子，可使T细胞持续活化增殖，细胞因子持续分泌，增强杀伤肿瘤细胞作用。第4代CAR除了嵌合抗原受体基因外，增加了一个或多个可以编码CAR及其启动子的载体，该载体可通过某些细胞因子如IL-2成功激活CAR的信号通路。图表4：CAR-T免疫疗法的图解说明2、TCR-T 与CAR-T疗法不同，TCR-T的优势在于增强或重建患者的抗肿瘤免疫的同时副作用较少。TCR-T的核心机制是筛选获得了反应性T细胞克隆，继而见到了可特异性识别肿瘤抗原的T细胞受体基因，再将编码肿瘤特异性TCR的基因导入成熟T细胞，获得的TCR基因修饰T细胞可在体外特异性识别抗原阳性肿瘤细胞，并在回输患者体内候建立抗肿瘤免疫。它也包含3大方向：a、 通过肿瘤特异性TCR转染T细胞赋予其肿瘤识别功能：通过对癌症特异性的基因赋予T细胞抗原识别特异性，使其有效识别杀伤肿瘤细胞。b、 肿瘤特异性TCR基因转染T细胞活化诱导记忆性T细胞分化：研究肿瘤特异性TCR基因转染T细胞被肿瘤抗原充分激活后，记忆性T细胞的分化情况，并明确其表型和肿瘤反应性，为进一步获得TCR基因转染记忆性T 细胞奠定基础。c、 肿瘤特异性TCR基因转染纯化候中枢型记忆T细胞（Tcm）：由于记忆性T细胞的抗肿瘤免疫能力和体内生存能力都强于混合成分的CD8+T细胞。而T细胞的内在性质决定了其回输体内后的生存能力和长期免疫功能。3、源于IPSc的新“T细胞”疗法 IPSc细胞技术应用于一类免疫杀伤T细胞的建立T-IPSc细胞。这些T-IPSc细胞使用的是患者自身产生的T细胞和T细胞由其衍生的功能靶向特定病毒。自杀基因iCaspase9（IC9）引入T-IPSc细胞，然后再分化成杀手T细胞能够攻击只有特定的病毒。三、现今国内外主流药企在免疫治疗的布局近几年，癌症的免疫疗法研究成为癌症研究领域的热点，吸引了众多投资者的目光，也获得了制药企业的关注，全球著名的跨国制药企业如阿斯利康、辉瑞、葛兰素史克等纷纷涉足癌症免疫疗法，与生物技术合作是主要的途径。图表5：主要跨国制药企业投资免疫疗法免疫疗法预知的优势使其成为跨国制药巨头的追逐对象，另外，率先布局空白市场获得竞争优势也是各大制药巨头投资“不差钱”的主要原因。虽然相较于其他的药品市场，抗肿瘤药的市场竞争相对缓和，但随着专利到期、仿制药市场快速发展等的情况下，各制药企业还是感觉到了一定的竞争压力，尤其是对动辄单个药品销售几十亿美元的抗肿瘤药物行业来说，根据前瞻产业研究院发布的2015-2020年中国抗肿瘤药物行业市场前瞻与投资战略规划分析报告显示，2013年全球肿瘤药物销售TOP20中，有3个产品的销售规模超过60亿美元，7个产品的销售规模在25亿元以上，18个产品的销售规模超过10亿元。可见对于抗肿瘤药物生产企业来说，时间即是金钱。图表6：2013年全球肿瘤药TOP20（单位：亿美元）图表7：国内细胞治疗布局对于未来企业的竞争趋势，前瞻产业研究院认为，未来全球抗肿瘤药物行业市场竞争会加剧，但寡头垄断的竞争格局不会发生太大的变化。随着肿瘤疾病越来越成为威胁全球健康的一大杀手，各主要的制药企业均看好肿瘤药物市场前景，在肿瘤药物研发投入上也毫不吝惜，从肿瘤药物研发投入占到新药研发40%-50%的比例即可看出。随着越来越多的企业加入市场争夺中，必将带来市场竞争的加剧，但是，按照目前各主要行业巨头的投入和后备产品储备等情况来看，短期内，罗氏、诺华、赛诺菲、辉瑞等行业巨头的垄断地位不会受到大的动摇。 国外肿瘤免疫治疗产业以免疫治疗药物为主，而我国肿瘤免疫治疗产业主要包括三个部分，免疫细胞存储、肿瘤免疫治疗药物、细胞免疫疗法，其中以细胞免疫疗法为主。免疫系统是人体自身的医生，而肿瘤免疫治疗被认为是唯一有可能彻底治愈癌症的方法，目前肿瘤免疫治疗多数被用于晚期癌症患者，但将来可能会像化疗一样，成为癌症治疗的一线方法。预计到2025年有100-150亿美元的市场只是个开始，未来10年60%的癌症病人将采用免疫治疗，在美国达350亿美元。就国内而言，专家估计三年内将达到几百亿的市场规模。 国内能够开展肿瘤免疫的医疗机构及潜在对象包括：1）已经开展业务的500多家三甲医院，现有技术和管理不成熟，新技术代替可能性较大；2）尚未开展细胞治疗的500多家三甲医院，其中大部分可以推广；3）有条件的三乙、二甲等医疗机构；4）体检中心及高端会所，不属于医疗行为的亚健康人群保健，利润空间更大。 如按三甲医院，一家医院每月收30个病人、每个病人治疗3个疗程、3万/疗程计算（目前市场的评价情况和常规收费），单三甲医院近几年保守估计就能达到300多亿的市场规模。四、TCR修饰的T细胞疗法传统的特异性过继免疫治疗主要通过手术获得患者新鲜肿瘤组织，分离其中的肿瘤浸润性淋巴细胞单克隆扩大培养而得到的，或者通过自体和异基因抗原体外诱导患者自身外周血、淋巴结或脾脏中的淋巴细胞生成。但由于目前手段获取特异性t细胞的效率太低，操作过于复杂，扩增难、时间长且有限，因此往往达不到预期治疗效果。T细胞受体(T cell receptor，TCR)是T细胞表面特异性识别抗原和介导免疫应答的效应分子，是人类基因组中多态性最高的区域之一，决定着人的免疫系统如何适应环境的变化。近十年来，有学者相继分离到抗原特异TCR基因并将其转导至初始T细胞中，使该T细胞表达外源TCR并获得特异性识别抗原的能力，能够识别并杀伤携带相应肿瘤抗原的恶性细胞，通过这一方法，可短期内获得大量抗原特异性T细胞，使得T细胞过继性免疫治疗有了新途径。T细胞受体库的多样性(包括基因重组以及选择性表达)直接反映了机体免疫应答的状态。 TCR可分为TCR/和TCR/两种类型, 外周血T细胞主要为TCR/的T细胞, 是介导机体特异性细胞免疫反应的主要细胞。TCR基因由可变区(V)、多变区(D)、结合区(J)和恒定区(C)四部分基因片段组成，形成互补决定区(complementarities determining region, CDR)和间隔的4个骨架区(framework region, FR)。3在T细胞发育过程中CDR1，2和FR区域相对保守，CDR3区由V、 D和J 进行重排而形成具有功能的TCR编码基因(T细胞克隆)，由于V (65-100种)、D (2种)、J (13种)基因片段本身具有多样性，此外，由于在重排的过程中，在VD及D-J的连接区经常有非模板的核苷酸的随机插入或删除，进一步增加了CDR3区的多样性(连接形成的多样性约为2 1011)。这种基因片段连接的不准确性使TCR的表达呈多样性, 以识别各种不同的抗原。正常个体在无抗原刺激时，TCR基因重排是随机的，因此正常人外周T细胞呈多家族、多克隆性特点。不同抗原(肿瘤、疫苗、病院微生物或者移植物等)刺激后，TCR V区基因可对该抗原产生特异性识别，并使带有这类基因的 T细胞得到优势扩增，可用于分析不同 TCR V亚家族 T细胞的表达和利用。4通过TCR技术来实现T细胞的过继免疫治疗总的来说可以通过以下两种方法：1.利用分离得出的抗原特异性TCR基因，通过构建载体转染一般的T细胞，再扩增回输。2.利用分离得出的抗原特异性TCR基因，构建一个小分子代替TCR链接肿瘤细胞与T细胞。而要实现这些技术就要注意以下几点：1.T抗原表位的选择，T细胞表位是指抗原经过抗原提呈细胞加工后，由MHC分子提呈给TCR的短肽。选择合适的T细胞表位可以在增加转导细胞特异性识别肿瘤抗原能力的同时减少移植物抗宿主病。根据目前对肿瘤抗原的分类，C-T抗原、基因突变所致的抗原由于在正常组织仲不表达被认为是T细胞抗原表位的最佳选择。目前被鉴定且应用于TCR治疗的肿瘤抗原主要有：MART-1、gp-100、CEA、NY-ESO1、MAGE-A3等。体外实验已经证明，联合两个及两个以上的T细胞表位进行TCR基因修饰的治疗比单个表位会获得更好的抗肿瘤能力，且同时转导MHC-1、MHC-2限制性TCR分子可能提高临床治疗效果。2. TCR基因转导系统 基因转导过程中，最关键的问题是选择合适的载体系统来携带目的基因，使其在靶细胞中得以稳定高效地表达。目前常用的载体系统包括病毒载体系统和非病毒载体系统两大类。理想的病毒载体系统应有较高的转导效率，同时出于安全考虑，应避免含有多个插入位点以防外源基因整合人宿主细胞染色体中。病毒载体系统目前常用的病毒载体包括逆转录病毒载体和慢病毒载体。逆转录病毒载体因其宿主细胞广泛，能高效感染分裂期细胞，可同时感染大量细胞并整合到基因组中长期稳定表达而在基因转导过程中经常被采用，至今它的应用已经超过了20年。慢病毒载体主要感染非分裂相细胞(比如造血干细胞)、低分化T细胞或初始T细胞。与逆转录病毒相比，慢病毒载体有更大的基因容量，转导造血干细胞时插入突变率低，也不易导致转录沉默。慢病毒载体本身携带有启动子，而不需要修饰细胞上的长末端重复序列(10ng terminal repeat，LTR)，故提高了基因转导的安全性。非病毒载体系统转座子是近几年来新兴的一种非病毒基因转导系统，Sleeping Beauty与PiggyBac作为最早被用于基因转导研究的两个转座子，因其具有一定的随机整合特性与基因转导效率，转导技术要求低，转座子的获得方便快捷等，为后期应用于临床提供了潜在可能性归。RNA电穿孔可产生与病毒载体同等的转染效率，但该方法技术要求高，RNA的半衰期短，易被环境中的RNA酶降解等，限制了它在临床上的应用。3. 提高外源性TCR基因表达的方法TCR的功能取决于转导TCR的亲和力及其在修饰T细胞表面的表达水平。高亲和力TCR可识别低浓度的抗原并传递活化信号，增加抗原识别的敏感性与特异性。采用以下几种方法可获得高亲和力的TCR：(1)抗原肽刺激同种异体反应性T细胞产生肽特异TCR；(2)抗原肽免疫HLA转基因鼠得到鼠源性TCR；(3)体外针对互补决定区3（CDR3)对TCR进行突变，使得突变后的TCR具有更高的抗原肽MHC结合特性；(4)使用密码子优化TCR；(5)清除TCR、链c区中的N-糖基化位点。另外文献报道，T细胞表面转导TCR的密度降低时，细胞被抗原刺激增殖的能力下降，IFN-、IL-2、IL-4的分泌量均减少，故推测，转导TCR在细胞表面的表达水平决定了被修饰细胞的功能活性，足够数量的转导TCR是T细胞发挥免疫效应的前提。但是在TCR基因转导过程中，内源性与外源性TCR、链之间的配对形成的杂合TCR将会稀释转导TCR在T细胞表面的表达，导致细胞表面转导TCR的表达量下降、细胞活性降低。且此杂合TCR因未经历过胸腺阴性选择，可能存在增加自身免疫的风险。为了减少内外源性TCR、链之间的错配并提高转导TCR在细胞表面的表达水平，有研究者尝试：(1)用鼠TCR、链c区替换人c区。有文献报道鼠源化c区更易表达于人T细胞表面，使细胞表面TCR表达水平增多，进而介导细胞因子分泌功能与杀伤活性的增强，更重要的是，鼠源化TCR更倾向于自身配对从而减少与内源性TCR配对的几率。(2)在TCR、链之间引入半胱氨酸，由此形成的第2个链内二硫键可介导外源性TCR、链配对，进而增强外源TCR表面表达水平与功能口。(3)将TCR、链C区下游与CD3分子融合，促进外源性TCR 、链配对并利于TCR信号传导。(4)将人TCR、链C区上最关键的9个氨基酸替换为鼠源性氨基酸，不仅极大地降低全鼠C区替换带来的免疫原性，同时也可提高外源TCR的细胞表面表达水平和功能。(5)对TCR、链C区关键位点的氨基酸进行突变，突变后的TCR可优先配对。(6)将TCR、链基因转导至T细胞中。(7)采用小干扰RNA(siRNA)下凋内源性TCR的表达。(8)使用小核糖核酸病毒核糖体跳过肽链接TCR、链，以实现外源性、链的等量表达，减少因、链表达不平衡引起的错配。上图为immunocore公司基于TCR重新设计的小分子；这也是想学团队的李懿教授所设想的。五、T-IPSc作为一种新的T细胞疗法的优势 诱导多能干细胞（IPSc）的发现，在再生医学疗法创造了充满希望的新途径。然而，未分化的IPSc的致瘤性是临床转化的一个主要的安全问题。为了解决这个问题，我们通过引入诱导胱天蛋白酶-9（IC9）插入的iPSC证实自杀基因疗法的功效。IC9的激活协同的二聚（CID）的特定化学诱导启动胱天蛋白酶级联消除的iPSC和肿瘤源于iPS细胞。我们介绍的这款IC9 / CID保障体系到IPSC衍生，重新焕发活力的细胞毒性T淋巴细胞（rejCTL）的治疗模式。实验证实，我们可以生成iPS细胞表达高水平IC9而不干扰抗原特异性杀伤活性拒绝。rejCTLs表达IC9在体内发挥的抗肿瘤作用。该系统高效，安全地诱导这些rejCTLs凋亡。这些结果联合起来，表明IC9 / CID保障体系是一个行之有效的手段为未来的iPSC介导的方法来指导临床合理用药。图表8：rejT-IC9-CTL产生的原理图我们的研究突出IC9保障体系的潜在临床意义。最近的研究引入自杀基为基础的保障系统导入小鼠或恒河猴的iPSCs报告畸胎瘤形成被显著延迟或仅抑制当治疗注射iPSC之前或之后不久。在我们的研究中，对于不加CID处理;当后IC9-iPSC的注入开始30天，就引起了巨大的畸胎瘤回归。这些结果表明，我们的慢病毒IC9 / CID保障系统可能是有用的实际；引入IC9成iPS细胞不与他们的多能性和分化能力产生干扰。rejT-IC9-CTL在体内的抗肿瘤效果是令人鼓舞，使用rejT-IC9-CTL靶向肿瘤继性T细胞疗法将是临床可行，特别是EBV相关肿瘤如霍奇金病，鼻NK细胞淋巴瘤，鼻咽癌，和EBV相关感染淋巴增生性疾病。如果需要此IC9/ CID系统的效率提高，所述蛋白酶体抑制剂硼替佐米都可以使用。硼替佐米和IC9/ CID有很强的协同作用，增强凋亡在肺癌细胞通过阻断活性caspase-3和caspase-9的降解。在这方面的兴趣的是，E3泛素连接酶XIAP，凋亡抑制剂，结合caspase-3和靶向它的蛋白酶体降解。 XIAP增强IC9诱导的凋亡，表明硼替佐米最大化IC9诱导的细胞凋亡。鉴于硼替佐米下调核因子KB，这是XIAP的转录靶，硼替佐米可能下调XIAP表达。技术难点：1、CTL的重编程2、T-IPSc的体外培养与扩增3、IC9/CID基因的合成与转导4、防止rejT-IC9-CTL的再分化5、rejT-IC9-CTL的筛选六、展望目前TCR基因治疗领域的两个研究热点是：(1)对CDR区进行突变以提高转导TCR的亲和力；(2)促使转导TCR d、B链配对。未来TCR基因治疗领域主要面临的3个方面问题：(1)输注后T细胞的体内环境问题；(2)输入T细胞的质量问题；(3)转导TCR的安全性问题 所述的IC9保障系统可能是一种有效和可靠的方法为免疫过继治疗提供安全的保障，然而这个系统只在小鼠实验中进行，还没进入临床阶段，展望对引进IC9 / CID保障体系到临床使用中，希望该系统可在临床上实际工作。