“百会”“大椎”穴电针预处理减轻反复丙泊酚麻醉诱导的大鼠学习记忆障碍.pdf

.78“百会”“大椎”穴电针预处理减轻反复丙泊酚麻醉诱导的大鼠学习记忆障碍JCAM.Aug.2023,Vol.39,NO.8范舜钦1,王喜军1，韦松里,陆思施,郭永榕（1.广西中医药大学附属国际壮医医院，广西南宁530 2 0 1;2.广西中医药大学，广西南宁530 2 0 0）摘要目的：观察“百会”“大椎”穴电针预处理减轻反复丙泊酚麻醉诱发大鼠学习记忆障碍的作用。方法：通过给予连续5d丙泊酚麻醉诱导学习记忆障碍模型，在丙泊酚给药前给予电针预处理连续5d完成电针干预。Morris水迷宫检测大鼠学习记忆能力;HE染色用于观察海马神经细胞数量及形态改变；免疫荧光染色检测海马DentateGyrus区磷酸化环磷腺苷效应元件结合蛋白（pCREB）蛋白表达；用Western Blotting测定B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）、B细胞淋巴瘤-2相关X蛋白（Bax）和CREB蛋白的表达情况。结果：Morris水迷宫结果：与对照组比较，丙泊酚组大鼠的穿台次数、目标象限游泳时长及路径占比明显减少，差异具有统计学意义（P0.05）；电针组大鼠的穿台次数、目标象限游泳时长及路径占比均明显高于丙泊酚组，差异具有统计学意义（P0.05）。H E结果：丙泊酚组海马DG区细胞层数减少，细胞密集度降低；电针组海马DG区神经元细胞层数显著恢复，细胞密集度明显升高。免疫荧光结果：与对照组比较，丙泊酚组海马区pCREB蛋白累积荧光强度显著降低，差异具有统计学意义（P0.05）；与丙泊酚组比较，电针组海马区pCREB蛋白累积荧光强度显著升高，差异具有统计学意义(P0.05）。W e s t e r n b l o t 结果：与对照组比较,Bax、Ca s p a s e-3在丙泊酚组显著表达，差异具有统计学意义（P0.05），而Bcl-2、CREB表达明显减少，差异具有统计学意义（P0.05）；与丙泊酚组比较,Bax、C a s p a s e-3在电针组表达明显减少,差异具有统计学意义（P0.05）,相反,Bcl-2、CREB在电针组显著表达，差异具有统计学意义（P0.05）。结论：“百会”“大椎”穴电针预处理可以有效减轻反复丙泊酚麻醉诱发的大鼠学习记忆障碍,其机制可能与上调pCREB、CREB蛋白以及调控凋亡相关因子的表达，进而抑制神经元凋亡，改善学习记忆，发挥神经保护作用。关键词电针预处理；丙泊酚；凋亡；学习记忆障碍中图分类号：R246.6D0I:10.19917/ki.1005-0779.023161Electro-Acupuncture Preconditioning at DU20 and DU14 Attenuating Learningand Memory Impairment Induced by Repeated Propofol Anesthesia in RatsFAN Shunqin*2,WANG Xijun,WEI Songl,LU Sishil,CUO Yongrong(1.Guangxi International Zhuang Medical Hospital Afiliated to Guangxi University of Chinese Medicine,Nanning 530201,China;2.Guangxi University of Chinese Medicine,Nanning 530200,China)Abstract Objective:To observe the effect of electro-acupuncture(EA)preconditioning at Baihui(DU20)and Dazhui(DU14)on reducing learning memory impairment induced by repeated propofol anesthesiain rats.Methods:The model of learning and memory impairment was induced by 5 consecutive days of propofolanesthesia,and EA pretreatment was given for 5 consecutive days before propofol administration.The learningand memory ability was evaluated by Morris water maze.The amount and morphological change of hippocampalneurons were observed by HE staining.The protein expression of pCREB in the Dentate Gyrus region of基金项目：广西中医药管理局项目，编号：ZGJ202173；广西国际壮医医院高层次人才引进基金，编号：GZ2021RC009；广西中医药大学研究生教育创新计划，编号：YCSY2023059。作者简介：范舜钦（1997），男，2 0 2 1级麻醉学专业硕士研究生，研究方向：围术期器官功能保护。通讯作者：王喜军（197 3-），男，教授，硕士研究生导师，研究方向：围术期重要器官功能保护。文献标识码：A针灸临床杂志2 0 2 3年第39卷第8 期hippocampus was measured by immunofluorescence staining.The protein expressions of Bcl-2,Caspase-3,Bax and CREB were determined by Western Blotting.Results:In terms of Morris water maze results,comparedwith those in the control group,the number of platform crossing,the swimming time and the percentage of pathsin the target quadrant were significantly reduced in the propofol group(P0.05);compared with those in thepropofol group,the number of platform crossing,the swimming time and the percentage of paths in the targetquadrant were significantly increased in the EA group(P0.05).In terms of the HE results,compared withthose in the control group,the number of cell layers in the hippocampal DG area decreased and the cell densitydecreased in the propofol group;compared with those in the propofol group,the number of neuronal cell layersin the hippocampal DG area significantly recovered and the cell density significantly increased in the EA group.In terms of the immunofluorescence results,compared with that in the control group,the intergratedfluorescence intensity of pCREB protein in the hippocampal region was significantly reduced in the propofolgroup(P0.05);compared with that in the propofol group,the intergrated fluorescence intensity of pCREBprotein in the hippocampal region was significantly increased in the EA group(P0.05).In terms of theWestern Blotting results,compared with those in the control group,the expressions of Bax and Caspase-3 weresignificantly increased(P0.05),whereas the expressions of Bcl-2 and CREB were significantly decreasedin the propofol group(P 0.05);compared with those in the propofol group,the expressions of Bax andCaspase-3 were significantly decreased(P 0.05),and the expressions of Bcl-2 and CREB weresignificantly increased in the EA group(P0.05).Conclusion:Electro-needling DU20 and DU14 caneffectively reduce learning and memory impairment induced by repeated propofol anesthesia in rats,and themechanism may be related to up-regulating the proteins of pCREB and CREB and the expression ofapoptosis-related factors,which in turn inhibits neuronal apoptosis,improves learning and memory ability,and exerts neuroprotective effects.Key words Electro-acupuncture preconditioning;Propofol;Apoptosis;Learning and memory;impairment79.丙泊酚作为临床使用面广、安全系数较高的静脉麻醉药,因其诱导快、半衰期短和苏醒快等特点而广泛应用于婴幼儿麻醉诱导及维持。研究发现,反复丙泊酚麻醉会产生发育神经毒性，可引起发育期大鼠大脑神经元调亡，激活大脑炎症反应、氧化应激反应等，最终导致大鼠学习记忆能力的损害。因此,麻醉前采取必要的干预措施对预防或减轻学习记忆损伤具有积极意义。电针是传统针灸与现代电刺激的完美结合产物,具有简便、安全与稳定等优点，研究表明2 ，电针“百会”“大椎”穴可减轻神经元调亡，发挥脑保护效应。基于此，本研究观察“百会”“大椎”穴电针预处理对反复丙泊酚麻醉诱导的大鼠学习记忆能力损害的影响，为围术期麻醉安全提供参考。1材料与方法1.1实验动物广西医科大学实验动物中心（实验动物许可证号：SCXK桂 2 0 140 0 0 2）提供3周龄雄性健康SD大鼠6 0 只，体质量55 7 0 g。SD 大鼠分组完成后饲养于温度2 3 2 5，湿度52%56%，可自由进食水的清洁动物房。广西中医药大学实验动物福利伦理委员会已对本课题所涉及的动物实验予以批准。1.22主要试剂和仪器1.2.1，主要试剂?丙泊酚(北京费森尤斯卡比,国药准字号：HJ20150564）；p CREB（武汉塞维尔，货号：GB114322）；CREB（武汉塞维尔，货号：GB111052）；Bcl-2（武汉塞维尔，货号：GB113375）;Ba x（武汉塞维尔，货号：GB11690）；Ca s p a s e 3（武汉塞维尔，货号：GB11767C)。1.2.2主要仪器华佗牌SDZ型电子针疗仪（苏州医疗用品厂有限公司）；一次性无菌针灸针（0.2 5m m 2 5m m,苏州医疗用品厂有限公司）；Mor-ris水迷宫（Viewer，德国BiobserveGmbH）等。1.3实验方法采用随机数字表法将SD大鼠分为5组（每组12只),于正式造模前给予大鼠水迷宫试游2 d,4次/d。正式水迷宫检测于造模结束后次日立即进行。采用自制纱布手套固定装置固定大鼠四肢，大鼠头部经剪开后的中指套露出,用弹性绷带固定大鼠头部使其保持不动。各组处理如下。1.3.1对照组（Controlgroup,C）连续5d腹腔注射生理盐水 1 mL。1.3.2月脂肪乳剂组（Fat emulsion group,F）连续5 d腹腔注射脂肪乳剂 1 mL。801.3.3丙泊酚组(Propofol group,P)注射丙泊酚 10 0 mg/kg 3。1.3.4电针预处理组（Electroacupuncture pretreatmentgroup,E）连续5d给予大鼠“百会”“大椎”穴电针治疗，参考团体标准T/CAAM0002-2020实验动物常用穴位名称与定位第3部分：大鼠，于顶骨正中，两耳前缘连线中点定位大鼠“百会”穴，于第7 颈椎与第1胸椎间,背部正中定位大鼠“大椎”穴,针与皮肤成45皮下进针2 3mm，连接电极，刺激参数为：2/15Hz疏密波,30 min,强度1 mA,以刺激点周围皮肤组织微颤为穴位刺激有效。1.3.5电针预处理+丙泊酚组（Electroacupuncturepretreatment+propofolgroup,EP）先给予电针预处理（同E组）,后给予丙泊酚（同P组）。1.4观察指标及检测方法于造模结束后对各组部分大鼠进行取材，海马组织用于WB实验检测调亡相关蛋白以及认知功能相关蛋白的表达情况；脑组织切片用于HE染色观察海马神经元数量，免疫荧光检测pCREB蛋白的表达；剩余部分大鼠进行Morris水迷宫实验，对大鼠学习记忆能力进行检测。1.4.1Morris水迷宫造模开始前对各组大鼠进行Morris水迷宫训练2 d,经水迷宫训练，排除视觉缺陷及运动能力较差的大鼠3只，每组选取5只大鼠，共计25只完成水迷宫实验。造模完成后，开始进行定位航行能力和空间探索能力的测试。逃逸潜伏期定义为大鼠首次进人平台的时间。设置整个观察时间为90 s，若在规定时间内大鼠未进人平台，则逃逸潜伏期成绩为90 s,4次/d，各象限1次，共历时4d。空间探索实验于第5天进行，撤去平台后，记录大鼠在原规定时间内进入原平台位置次数、大鼠在指定象限游泳时长及路径长度占比。1.4.2HE染色各组随机选取大鼠3只在充分麻醉状态下，剖胸剪开右心房以及左心室，使用灌胃针从大鼠左心室开口插入至升主动脉，首先缓慢灌注生理盐水将全身血液置换完全，再灌注150 mL4%多聚甲醛，组别对照组丙泊酚组脂肪乳组电针预处理组电针预处理+丙泊酚组注：与对照组比较，*P0.05；与丙泊酚组比较，P0.05。JCAM.Aug.2023,Vol.39,NO.8）连续5d腹腔待固定完全后迅速于冰面上断头取脑。包埋后制作石蜡切片,石蜡切片经脱蜡、复水后使用苏木素核染,经分化反蓝后伊红质染，最后脱水封片，在显微镜下观察海马区神经元数量及形态变化。1.4.3pCREB免疫荧光将制作好的石蜡切片脱蜡后进行抗原修复,加人pCREB一抗4孵育过夜，再孵育荧光二抗，洗涤加入防淬灭试剂后封片。显微镜下观察各组海马DG区pCREB表达情况，随机选取3个同样大小视野区域进行拍照，ImageJ软件分析pCREB的累积荧光强度,最后取其平均值。1.4.4Westernblot法检测相关蛋白表达各组随机选取大鼠3只在充分麻醉状态下，于冰面上迅速取海马组织冻存于-8 0。取50 mg海马组织加人裂解液及蛋白磷酸酶抑制剂后，提取总蛋白，A280法检测蛋白含量。取40 g蛋白上样。加样后恒压12 0 v电泳至Marker跑至合适位置,共约45min。结束后恒流400mA,2035 m in 将蛋白转移至PVDF膜。孵育Caspase-3、Bc l-2、Ba x 和CREB一抗前需要经5%脱脂奶粉常温封闭1.5h,然后4摇床孵育过夜;TBST漂洗三次后再敷以荧光二抗,4孵育1h。T BST 漂洗三次后使用荧光扫膜仪扫膜，ImageJ软件用于条带灰度值分析。1.5统计学处理数据分析采用SPSS27.0统计学软件进行，符合正态分布的资料以均数标准差（xs)表示，单因素方差分析用于多组间比较,LSDt 检验用于组间两两比较,以P0.05时为差异有统计学意义。2结果2.1Morris水迷宫结果2.1.1隐匿平台期大鼠逃逸潜伏期结果经统计,第14天,各组大鼠的逃逸潜伏期均逐渐缩短。与C组相比,P组用时均有显著的延长,差异具有统计学意义（P0.05)；与P组相比,EP组用时显著缩短,差异具有统计学意义(P0.05）。见表1。表1各组大鼠逃逸潜伏期比较交(元s)逃逸潜伏期（s）n第1d553.10 4.77570.54 4.95*555.68 7.87#558.76 7.77#556.54 6.12#第2 d38.21 6.0751.44 4.82*41.83 5.65#37.35 4.14#41.81 7.82#第3d35.65 5.8248.03 7.22*37.11 2.90#34.91 7.80#32.19 5.96#第4 d28.49 1.9744.21 6.11*28.41 3.94#30.95 5.60#29.51 8.71#针灸临床杂志2 0 2 3年第39卷第8 期2.1.2空间探索期大鼠穿台次数、目标象限时长和路径百分比比较经统计,与C组相比,P组穿台次数减少，目标象限时长及路径百分比缩短，差异具有统计学意义（P0.05)；组别对照组丙泊酚组脂肪乳组电针预处理组电针预处理+丙泊酚组注：与对照组比较，*P0.05；与丙泊酚组比较，P0.05。2.2HE染色结果P组海马DG区细胞层数减少,细胞密集度降低，可见部分神经元胞体皱缩变小。而电针预处理可显著81与P组相比,EP组穿台次数增加,在目标象限时长及路径百分比明显升高，差异具有统计学意义（P0.05），提示反复丙泊酚麻醉对发育期大鼠学习记忆能力产生明显损伤，而电针预处理可以有效减轻该效应。见表2。表2 各组大鼠穿台次数、目标象限时长和路径百分比比较穿台次数52.70 1.0551.20 1.08*53.00 1.79#53.10 1.81#52.80 1.66#对照组丙泊酚组交(xs)目标象限时长（%）31.12 5.8916.12 5.79*33.26 8.69#31.98 5.47#28.07 5.39#恢复海马DG区神经元细胞层数、升高细胞密集度。见图1。目标象限路径（%）30.29 4.8321.94 7.80*32.95 7.68#33.27 4.56#29.15 5.47#电针+丙泊酚组图13组海马神经元细胞数量及神经元形态变化(2 0 0，10 0 m）2.3PpCREB荧光染色结果与C组比较,P组pCREB蛋白表达显著减少,累积荧光强度明显减弱,差异有统计学意义（P0.05);与P组比较,EP组pCREB蛋白表达显著升高，累积荧光强度明显增强,差异有统计学意义(P0.05）。见图2、表3。CFpCREBEPEPDAPIMerge图2 免疫荧光下各组海马pCREB表达情况（10 0 m）82表3各组大鼠海马pCREB表达水平比较（xs）组别pCREB/DAPI对照组3丙泊酚组3脂肪乳组3电针预处理组3电针预处理+丙泊酚组3注：与对照组比较，*P0.05；与丙泊酚组比较，#P0.05。2.4Westernblot法蛋白表达结果P组 CREB、Bc l-2 蛋白表达相较于C组明显降低,Caspase-3、Ba x 蛋白表达明显升高,差异具有统计学意义（P0.05）;与P组比较,EP组 CREB、Bc l-2表达明显升高,Caspase-3、Ba x 蛋白表达显著下降,差异有统计学意义(P0.05）。见图3、表4。表4Western blot检测5组大鼠海马CREB、Ca s p a s e-3、Bc l-2 和Bax蛋白表达水平比较组别对照组丙泊酚组脂肪乳组电针预处理组电针预处理+丙泊酚组注：与对照组比较，*P0.05；与丙泊酚组比较，P0.05。3讨论电针预处理相较于传统干预措施，非局限于某单一靶点或病理生理进程，具有整体性4。传统电针是在疾病状态下的干预措施,尽管其具有治疗作用,但病理创伤依旧存在。电针预处理是在病理状态发生之前的干预措施，提高机体缺血、缺氧耐受力和激活相关通路等,进而有效预防疾病状态的发生。研究发现,电针预处理可通过抑制氧化应激5 和炎症反应6 、抑制细胞凋亡7 和调控自噬8 等多种途径发挥其脑保护效应。电针在治疗脑卒中并发症的表现同样亮眼，提示电针或成为脑损伤的一种新的极具潜力的治疗手段。丙泊酚对发育期大脑具有一定的神经毒性，研究表明9 反复接受丙泊酚麻醉的大鼠会发生严重的神经元细胞调亡,对其认知功能产生明显损害。因此，必要的干预措施对减轻反复丙泊酚麻醉诱导的大脑功能损害十分重要。研究表明，在脑缺血再灌注损伤模型大鼠中，电针百会、大椎穴可以显著改善大鼠学习记忆能力及认知功能10 。因此，本研究采用电针百会穴及大椎穴治疗改善反复丙泊酚麻醉诱导的大鼠学习记忆障碍。文献指出 ,麻醉药物经腹腔注射的剂量是静脉注射的2 倍，而人体与大鼠用药剂量比约为1:2 5JCAM.Aug.2023,Vol.39,NO.8CFnCREB0.57 0.08-actin0.07 0.02*0.58 0.14#0.54 0.12#0.54 0.03#CREB30.87 0.0630.36 0.15*30.92 0.06#30.87 0.10#30.81 0.12#ECaspase-3-actinBcl-2-actinBax-actinCaspase-30.78 0.101.03 0.02*0.77 0.09#0.74 0.09#0.77 0.04#50。临床儿童丙泊酚ED95诱导剂量为2 3mg/kg，据此,本实验选用10 0 mg/kg作为大鼠腹腔注射剂量。实验中发现腹腔注射10 0 mg/kg丙泊酚后,大鼠由轻度兴奋状态逐步进人麻醉状态。临床丙泊酚用药存在呼吸抑制的副作用，为排除由呼吸抑制导致的缺氧对该实验产生影响,在麻醉过程中,将大鼠放置于恒温，高流量给氧（5L/min）的笼箱中，并且持续观察大鼠口唇、四肢皮肤颜色以及呼吸频率,防止缺氧的发生。Morris水迷宫结果显示,丙泊酚组在14 d的学习记忆能力测试中表现不佳，穿台次数以及目标象限时长、路径百分比均明显低于对照组，有较高的学习记忆能力损害表现，而电针加丙泊酚组的穿台次数以及目标象限时长、路径百分比成绩明显优于丙泊酚组，提示电针预处理显著改善了大鼠的学习记忆能力，发挥其脑保护效应。CREB蛋白在调节突触可塑性和长期记忆形成的过程中发挥重要作用，参与了学习记忆和工作调节等重要生物学功能12 。在大脑中,通过Ser133磷酸化激活CREB是记忆形成的关键步骤13。pCREB通过调控多种基因发挥脑保护作用,pCREB在认知及记忆损伤大鼠海马中表达明显降低14。本研究显示,反复丙泊酚麻醉大鼠,其海马组织中pCREB、C REB蛋白表P图3各组蛋白表达情况交(xs)Bcl-2Bax0.82 0.060.71 0.070.30 0.07*1.06 0.07*0.94 0.08#0.73 0.02#0.82 0.01#0.76 0.10#0.72 0.05#0.78 0.15#EP42kDa35kDa42kDa26kDa42kDa43kDa43kDa43kDa针灸临床杂志2 0 2 3年第39卷第8 期达显著下调,而电针预处理后再给予丙泊酚,pCREB、CREB蛋白明显上调，提示电针预处理可通过上调pCREB、CREB蛋白的表达进而有效改善反复丙泊酚麻醉诱导的学习记忆能力损害。Bcl-2抑调亡蛋白和Bax促调亡蛋白水平是检测海马神经元凋亡的有效指标15。Caspase-3 同样也参与到神经元凋亡的过程中16 。本研究显示,在给予丙泊酚反复麻醉后,大鼠海马组织中 Bcl-2 蛋白表达显著下调,而Bax和Caspase-3蛋白表达显著上调;电针预处理后,大鼠海马组织中Bcl2 蛋白表达明显上调，而Bax和Caspase-3蛋白表达明显下调,提示电针预处理通过影响凋亡相关蛋白的表达进而改善反复丙泊酚麻醉对大鼠学习记忆能力的损害。综上所述，反复丙泊酚麻醉通过调控pCREB、CREB蛋白表达损害大鼠学习记忆能力；通过降低Bcl-2/Bax比值、上调Caspase-3的表达诱导发育期大鼠大脑神经元调亡。而电针预处理通过上调pCREB、CREB蛋白表达改善大鼠学习记忆功能；升高Bcl-2/Bax比值及下调Caspase-3的表达减少大脑神经元调亡，进而改善反复丙泊酚麻醉诱导大鼠学习记忆能力的损害。基于此，电针预处理可能成为将来临床治疗和预防丙泊酚神经毒性的新途径。参考文献：1姜静,张小宝,沈杨.反复丙泊酚麻醉对成年鼠海马突触可塑性和学习记忆行为的影响J.临床和实验医学杂志，2 0 2 1,2 0（7）：695 698.2 黎娜，洪素云，李俊，等.电针预处理对术后认知功能障碍老龄小鼠海马氧化应激的影响J.中国针灸，2 0 2 1,41（6）：6 45-6 50.3LIU P F,GAO T,LI T Z,et al.Repeated propofol exposure-inducedneuronal damage and cognitive impairment in aged rats by activation ofNF-B pathway and NLRP3 inflammasomeJ.Neurosci Lett,2021,740:135461.4宁文华,李礼,郭扬,等.电针预处理脑保护作用机制研究进展J.中国康复理论与实践，2 0 19,2 5（11）：1315-1319.835 SUN L S,LI G,MILLER T L,et al.Association between a single ge-neral anesthesia exposure before age 36 months and neurocognitiveoutcomes in later childhoodJ.JAMA,2016,315(21):2312-2320.6 JIN R,LIU L,ZHANG S,et al.Role of 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