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【实验】DNA的粗提取与鉴定
一、实验原理
1.DNA在NaCl溶液中的溶解度随NaCl浓度的不同而不同。当NaCl的浓度为0．14mol/L时，DNA的溶解度最低。利用这一原理，可使溶解在NaCl溶液中的DNA析出。
2.DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的其他许多物质溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一步提取含杂质较少的DNA。
3.DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色；DNA还有遇甲基绿溶液被染成蓝绿色的特性。上述两种方法均可用于鉴定DNA的存在。
二、材料用具
鸡血细胞液；铁架台，铁环，镊子，三脚架，酒精灯，石棉网，载玻片，玻璃棒，滤纸，滴管，量筒（100mL，1个），烧杯（100mL，1个，50mL、500mL各2个），试管（20mL，2个），漏斗，试管夹，纱布；体积分数为95%的酒精溶液（实验前置于冰箱内24h），蒸馏水，质量浓度为0.1g/mL的柠檬酸钠溶液，物质的量浓度分别为2mol/L和0.015mol/L的氯化钠溶液，二苯胺试剂
三、方法步骤
步骤
操作方法
原理
制备鸡血细胞液
↓

取0.1g/mL的柠檬酸钠溶液100mL，与新鲜的鸡血混合并搅拌，然后静置一天或离心机离心约2～3min，除去上清液
防止血液凝固，使血细胞与血浆分离
提取细胞核物质
↓

取20mL蒸馏水与约5～10mL的鸡血细胞液混合并充分搅拌，然后用单层纱布过滤，取滤液于烧杯中
使细胞过度吸水而破裂
溶解DNA
↓

取2mol/L的NaCl溶液40mL与上述滤液混合后，用玻璃棒沿一个方向搅拌1min
DNA在高浓度氯化钠溶液中溶解度最大
析出DNA并滤取
↓

沿烧杯内壁慢慢加入蒸馏水并轻轻搅拌，至白色丝状粘稠物不再增加时停止加水，然后用多层纱布过滤，取纱布上的粘稠物
DNA的溶解度随氯化钠溶液浓度的降低而降低
DNA的再溶解
↓

用镊子夹取纱布上的粘稠物放入20mL浓度为2mol/L氯化钠溶液中，搅拌至完全溶解，然后用两层纱布过滤，取其滤液放入小烧杯中
DNA在高浓度氯化钠溶液中溶解度最大
提取较纯净的DNA
↓

取95%的、冷却的酒精50mL与滤液混合搅拌，待出现丝状物时用玻璃棒将其卷起
DNA不溶于酒精，出现沉淀
DNA的
鉴定

取两支20 mL的试管，各加入物质的量浓度为0．015mol／L的NaCl溶液5mL，将丝状物溶解。然后放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4 mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min，等试管冷却后，观察并且比较两支试管中溶液颜色的变化。
DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色
四、常见问题分析 
1.从鸡血细胞核中提取的物质是DNA吗？
在鸡血细胞中加入蒸馏水，并且搅拌，利用渗透作用原理使鸡血细胞破裂，搅拌进一步促进了鸡血细胞的破裂，于是释放出其中的DNA，当然也有少量的RNA，还的蛋白质。因此，释放出的物质是DNA、RNA和蛋白质的混合物，不仅仅只有DNA。
2.怎样提高血细胞因低渗而破裂的效率？
血细胞的细胞膜对低渗溶液有一定的抵抗能力，这称为渗透脆性。一般而言，血细胞与蒸馏水相混合而使血细胞处于极度的低渗环境之中，细胞因大量失水而致最终破裂并释放出胞内物（包括细胞核）。为促进细胞在低渗条件下破裂，可以辅以快速而有力的搅拌，使之受机械震荡而更易破裂。
3.怎样才能把血细胞释放的DNA滤入收集的滤液中？
这一步较难处理，在过滤过程中常常发生因粘稠的果胨样物质堵塞过滤纱布的网眼而使后续的过滤难以完成，很多DNA没能滤入滤液中，这是造成失败的主要原因之一。
解决的方法有：过滤时待过滤溶液倒入漏斗的速度应缓慢，以免沉积于溶液中层的胶状物一下就把纱布堵住，使过滤不能完成；
一旦出现大量胶状物使过滤不能进行下去，切忌用力挤压而使胶状物也滤入滤液之中，可以把胶状物重新用适量的2mol NaCl溶液进行搅拌，使其中的DNA得到溶解，然后再进行过滤。
4.实验中看到的丝状物的粗细是不是DNA分子的直径呢？
不是。因为DNA分子直径只有2nm。丝状物是多个DNA分子聚在一起形成的。
5.盛放鸡血细胞液的容器,最好是塑料容器。鸡血细胞破碎以后释放出的DNA,容易被玻璃容器吸附,由于细胞内DNA的含量本来就比较少,再被玻璃容器吸附去一部分,提取到的DNA就会更少。因此,实验过程中最好使用塑料的烧杯和试管,这样可以减少提取过程中DNA的损失。同理，玻璃棒有吸附DNA的作用，可通过缓缓旋转玻璃棒的方法卷起浓缩后的DNA丝状物。
6.利用DNA在浓度较低的氯化钠溶液中溶解度小的原理,向含有DNA的浓度较高的氯化钠溶液中加入大量(300 mL )蒸馏水,稀释氯化钠溶液,使DNA的溶解度下降,而蛋白质的溶解度增高(这就是蛋白质的盐溶现象),从而使二者分离。
7.鉴定时溶液蓝色的深浅,与溶液中DNA含量的多少有关。

演练高考

1、破译生物基因组DNA的遗传信息或进行基因操作，首先要提取细胞核DNA。下列不适宜作为DNA提取的实验材料是 （ ）
A、鸡血细胞 B、蛙的红细胞 C、人的成熟红细胞 D、菜花
2、做DNA粗提取和鉴定实验时，实验材料用鸡血而不用猪血的原因是
A．鸡血的价格比猪血的价格低 B．猪的红细胞没有细胞核，不易提取到DNA
C. 鸡血不凝固，猪血会凝固 D．用鸡血提取DNA比用猪血提取操作简便
3．下列实验中所用试剂错误的是 （ ）
A、在观察植物细胞有丝分裂实验中，使用醋酸洋红溶液使染色体着色
B、在提取叶绿体色素实验中，使用丙酮提取色素
C、在DNA的粗提取与鉴定实验中，使用氯化钠溶液析出DNA
D、在蛋白质的鉴定实验中，使用苏丹Ⅲ染液鉴定蛋白质
4．下表是关于DNA粗提取与鉴定实验中所使用的材料、操作及其作用的表述。正确的是（　　）

试剂
操作
作用
A
柠檬酸钠溶液
与鸡血混合
防止血液凝固
B
蒸馏水
与鸡血细胞混合
保持细胞形状
C
蒸馏水
加入到溶解有DNA的NaCl中
加速DNA的溶解
D
冷却的酒精
加入到过滤后DNA的NaCl中
产生特定的颜色反应
5．在采用鸡血为材料对DNA进行粗提取的实验中，若需进一步提取杂质较少的DNA，可以依据的原理是
A．在物质的量浓度为0.14 mol／L的氯化钠溶液中DNA的溶解度最小
B．DNA遇二苯胺在沸水浴的条件下会染成蓝色
C．DNA不溶于酒精而细胞中的一些物质易溶于酒精
D．质量浓度为0.1g／mL的柠檬酸钠溶液具有抗凝血作用
6．萝卜贮藏根组织细胞中是否存在蛋白质和DNA？某生物小组对此进行研究，他们从网上查阅资料得知：①蛋白质在10%NaCl溶液中可沉淀析出；②在蛋白质溶液中，加入双缩脲试剂，溶液呈现特有的颜色；③DNA溶于10%NaCl溶液但在95%酒精中呈白色絮状沉淀，析出。
实验材料：白萝卜。
实验用具：粉碎机、烧杯、漏斗、试管、滤纸、玻棒、镊子、载玻片、天平、纱布。
药品及试剂：蒸馏水、NaCl、95%酒精、甲基绿染液、双缩脲试剂、蛋白质标准样品。
请你根据所提供的条件参与实验设计并完成实验。
一、材料处理：___________________________________________________________ ____________________

______________________________________________________________________________________________

二、提取：__________________________________________________________ ___ ___

________________________________________________________________________________________________

三、鉴定及结果：__________________________________________________ _________________________

四、讨论：
1、蛋白质在萝卜贮藏根组织细胞中所起的作用是____________________________________________________。

2、DNA主要来自萝卜贮藏根组织细胞的_____________________________________________________________。

参考答案
1.C 本题考查的是DNA的粗提取实验材料的选取。DNA主要分布于真核细胞的细胞核中，而人的成熟红细胞中无细胞核，故无DNA，因而不能用人的成熟红细胞用为DNA提取的实验材料。
2. B 哺乳动物成熟的红细胞没有细胞核和其他膜结构，因此常用作植被细胞膜的实验材料，而DNA的粗提取和鉴定实验必须获取较多DNA，因此常用鸡血而不能用猪血，鸟类的红细胞中含有细胞核。
3.D 本题考查的知识点是四个实验中有关试剂的正确使用。在观察植物细胞有丝分裂实验中，常用龙胆紫溶液染色，但也使用醋酸洋红溶液使染色体着色；BC选项均正确；在蛋白质的鉴定实验中，使用双缩尿试剂鉴定蛋白质。
4.A本题考查的是DNA粗提取与鉴定实验中柠檬酸钠溶液、蒸馏水、冷却的酒精的作用。柠檬酸钠溶液是抗凝剂，与鸡血混合后可防止血液凝固；第一次使用蒸馏水是让蒸馏水与鸡血细胞混合，作用是让血细胞吸水膨胀，加速血细胞破裂；第二次使用蒸馏水是将蒸馏水加入到溶解有DNA的2mol/L的NaCl中，作用是使NaCl溶液的浓度降低至0.142mol/L，此时DNA在NaCl中的溶解度最小，从而使DNA析出；冷却的酒精对DNA的凝集效果最佳，加入到过滤后DNA的NaCl中的作用是让DNA分子凝集。
5.C 该题考查了实验的基本原理，属于记忆层次的考点，由于DNA不溶于酒精，而混杂在DNA中的某些细胞中的物质易溶于酒精，因此向含有杂质的DNA中加入95%的冷却酒精能进一步提纯DNA。
6. [解析]本题为验证性实验设计题，鉴定萝卜贮藏根细胞组织中是否存在蛋白质和DNA。其关键是分别从萝卜贮藏根细胞组织中提取出蛋白质和DNA，实际上在题干上已非常明确地给出了提取的方法，只要稍加整理即可。然后分别用双缩脲试剂和甲基绿染液进行鉴别，同时在进行实验的过程中要注意对照实验的设置。
[答案]
一、材料处理：称取50g萝卜冼净切块，加水30ml，粉碎机粉碎，将匀浆经纱布过滤。
（萝卜和加水的量可以不作要求）
二、提取：
1．提取蛋白质：向经纱布过滤得到的滤液中加入10%NaCl，直至沉淀析出。经滤纸过滤，将滤纸上的沉淀物放入试管中，加入1ml蒸馏水，振荡，用于蛋白质鉴定。
2．提取DNA：向除去蛋白质的滤液中，加入95%酒精，用玻棒轻轻搅拌，见有白色絮状沉淀产生，经滤纸过滤，用镊子将滤纸上的絮状沉淀置于载玻片，用于DNA鉴定。
三、鉴定及结果：
1．在用于蛋白质鉴定的实验试管中，加入双缩脲试剂，产生紫色反应；同时将蛋白质标准样品和1ml蒸馏水放入另一试管，也加相同的试剂作为对照实验。观察到两试管中颜色基本一致，说明实验试管中有蛋白质存在。
2．在用于DNA鉴定的载玻片上，滴加甲基绿染液呈现蓝绿色，说明该白色絮状沉淀为DNA。
3．通过对白萝卜贮藏根匀浆液的检测，说明有蛋白质和DNA的存在。
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