外源基因表达产物的分离纯化.ppt

A A 重组蛋白分离纯化方法选择的基因原则重组蛋白分离纯化方法选择的基因原则外源基因表达产物的分离纯化外源基因表达产物的分离纯化针对不同的产物表达形式采取不同的策略针对不同的产物表达形式采取不同的策略针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型多种分离纯化技术的联合运用多种分离纯化技术的联合运用合适分离纯化介质的选择合适分离纯化介质的选择分离纯化过程的规模化分离纯化过程的规模化针对不同的产物表达形式采取不同的策略针对不同的产物表达形式采取不同的策略 采用采用分泌型战略分泌型战略表达重组蛋白，通常体积大、浓度低，因此应在表达重组蛋白，通常体积大、浓度低，因此应在纯化之前采用沉淀或超滤等方法先进行浓缩处理；纯化之前采用沉淀或超滤等方法先进行浓缩处理；采用采用包涵体型战略包涵体型战略表达重组蛋白，应先离心回收包涵体；表达重组蛋白，应先离心回收包涵体；采用采用融合型战略融合型战略表达重组蛋白，一般是胞内可溶性的，拟首先选表达重组蛋白，一般是胞内可溶性的，拟首先选用亲和层析进行纯化用亲和层析进行纯化 表达在细胞膜和细胞壁之间的间隙中表达在细胞膜和细胞壁之间的间隙中的蛋白质，应用低浓度的溶的蛋白质，应用低浓度的溶菌酶处理，然后再用渗透压休克法释放重组蛋白。菌酶处理，然后再用渗透压休克法释放重组蛋白。针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型 等电点等电点处于极端区域（处于极端区域（pIpI55 或或 pIpI88）的重组蛋白应首选离子）的重组蛋白应首选离子交换法进行分离，这样很容易除去几乎所有的杂蛋白；交换法进行分离，这样很容易除去几乎所有的杂蛋白；重组蛋白特异性的重组蛋白特异性的配体配体、底物底物、抗体抗体、糖链糖链等都是首选亲合层析等都是首选亲合层析纯化方法的重要条件，原则是它们与目标蛋白之间的解离常数应在合纯化方法的重要条件，原则是它们与目标蛋白之间的解离常数应在合适的范围内（适的范围内（1010-8-8-10-10-4-4 mol/Lmol/L）；）；疏水层析疏水层析和和反相层析反相层析是根据蛋白质的是根据蛋白质的疏水性差异疏水性差异进行分离的；进行分离的；凝胶过滤层析凝胶过滤层析是根据蛋白的是根据蛋白的分子量和体积差异分子量和体积差异进行分离的；进行分离的；径向层析径向层析是近年来发展起来的集是近年来发展起来的集层析分离层析分离和和膜分离膜分离于一体的一种于一体的一种复合技术，在流量、负荷量等参数方面显示出极大的优越性。复合技术，在流量、负荷量等参数方面显示出极大的优越性。多种分离纯化技术的联合运用多种分离纯化技术的联合运用 在进行重组蛋白的纯化时，通常需要综合使用多种技术，一般来在进行重组蛋白的纯化时，通常需要综合使用多种技术，一般来说，在选择分离纯化方法时应遵循下列原则：说，在选择分离纯化方法时应遵循下列原则：应选择不同分离纯化机理的方法联合使用应选择不同分离纯化机理的方法联合使用应首先选择能除去含量最多杂质的方法应首先选择能除去含量最多杂质的方法应尽量选择高效的分离方法应尽量选择高效的分离方法应将最费时、成本最高的分离纯化方法安排在最后阶段应将最费时、成本最高的分离纯化方法安排在最后阶段合适分离纯化介质的选择合适分离纯化介质的选择 常用的蛋白质分离纯化介质有常用的蛋白质分离纯化介质有SephadexSephadex和和SeperoseSeperose。理想的分理想的分离纯化介质应具有下列性质：离纯化介质应具有下列性质：对目标蛋白具有较高的分离效率对目标蛋白具有较高的分离效率对目标蛋白不会造成变性对目标蛋白不会造成变性化学性能和机械性能稳定，重复性好化学性能和机械性能稳定，重复性好价格低廉价格低廉分离纯化过程的规模化分离纯化过程的规模化 蛋白质分离纯化的实验室工艺、技术、方法在大规模产业化过程蛋白质分离纯化的实验室工艺、技术、方法在大规模产业化过程未必合适，如：未必合适，如：实验室方法在工程上可能难以实现（超声波破细胞壁）实验室方法在工程上可能难以实现（超声波破细胞壁）实验室方法在大规模生产中可能成本过高（超速离心）实验室方法在大规模生产中可能成本过高（超速离心）因此，在很多情况下，实验室的技术路线不等于生产工艺。因此，在很多情况下，实验室的技术路线不等于生产工艺。B B 离子交换层析离子交换层析1010 外源基因表达产物的分离纯化外源基因表达产物的分离纯化离子交换层析的基本原理离子交换层析的基本原理离子交换介质的基本性质离子交换介质的基本性质离子交换层析的基本操作离子交换层析的基本操作离子交换介质的选择原则离子交换介质的选择原则离子交换层析的基本原理离子交换层析的基本原理 离子交换层析是以离子交换层析是以离子交换剂离子交换剂为为固定相固定相，以特定的，以特定的含离子溶液含离子溶液为为流动相流动相，利用离子交换剂对待分离的各种离子结合力的差异，而将混，利用离子交换剂对待分离的各种离子结合力的差异，而将混合物中不同离子进行分离的层析技术。合物中不同离子进行分离的层析技术。离子交换介质的基本性质离子交换介质的基本性质 离子交换剂离子交换剂亦称亦称离子交换介质，离子交换介质，通常是一种不溶性高分子化合物通常是一种不溶性高分子化合物如如树脂树脂，纤维素纤维素，葡聚糖葡聚糖，醇脂糖醇脂糖等；等；离子交换剂离子交换剂中所含的可解离基团在水溶液中能与溶液中的其它阳中所含的可解离基团在水溶液中能与溶液中的其它阳离子交换剂的基本性能离子或阴离子起交换作用离子或阴离子起交换作用 如果有两种以上的成分被吸附在离子交换剂上，则在用洗脱液洗如果有两种以上的成分被吸附在离子交换剂上，则在用洗脱液洗脱时，各成分被洗脱的可能性取决于各自反应的平衡常数脱时，各成分被洗脱的可能性取决于各自反应的平衡常数 吸附在离子交换剂上的蛋白质可通过改变吸附在离子交换剂上的蛋白质可通过改变pHpH使吸附的蛋白质失去使吸附的蛋白质失去电荷而解离下来电荷而解离下来 不同蛋白质与离子交换剂之间形成离子键数目不同，即亲和力大不同蛋白质与离子交换剂之间形成离子键数目不同，即亲和力大小有差异，因此只要选择适当的洗脱条件便可将混合物中的成分逐个小有差异，因此只要选择适当的洗脱条件便可将混合物中的成分逐个洗脱下来，达到分离纯化的目的洗脱下来，达到分离纯化的目的离子交换介质的基本性质离子交换介质的基本性质 阴离子交换剂：强碱型和弱碱型阴离子交换剂：强碱型和弱碱型可电离的基团可电离的基团磺酸基（磺酸基（-SOSO33HH）离子交换剂的分类磷酸基（磷酸基（-POPO33HH22）羧酸基（羧酸基（-COOHCOOH）酚羟基（酚羟基（-OHOH）阳离子交换剂：强酸型和弱酸型阳离子交换剂：强酸型和弱酸型可电离的基团可电离的基团伯胺基（伯胺基（-NHNH22）仲胺基（仲胺基（-NHCHNHCH33 ）叔胺基（叔胺基（-N(CHN(CH33)22）季胺基（季胺基（-NN+(CH(CH33)33 ）离子交换介质的基本性质离子交换介质的基本性质离子交换剂的分类强离子交换剂强离子交换剂的电离率基本不受的电离率基本不受pHpH值影响，离子交换作用的值影响，离子交换作用的pHpH范围宽范围宽弱离子交换剂弱离子交换剂的电离率受的电离率受pHpH影响很大，离子交换作用的影响很大，离子交换作用的pHpH范围小范围小弱酸性阳离子交换剂在弱酸性阳离子交换剂在pHpH值降低时，其电离率逐渐降低，离子值降低时，其电离率逐渐降低，离子交换能力逐渐减弱交换能力逐渐减弱弱碱性阴离子交换剂在弱碱性阴离子交换剂在pHpH值升高时，其电离率逐渐降低，离子值升高时，其电离率逐渐降低，离子交换能力逐渐减弱交换能力逐渐减弱离子交换介质的基本性质离子交换介质的基本性质常用的离子交换剂离子交换树脂：离子交换树脂：最常见的最常见的离子交换树脂离子交换树脂是含有酸性或碱性基团的人工合成的是含有酸性或碱性基团的人工合成的聚苯聚苯乙烯乙烯-二乙烯苯二乙烯苯不溶性高分子化合物不溶性高分子化合物 离子交换树脂的优点离子交换树脂的优点是：是：流速快，对小分子物质的交换容量大，流速快，对小分子物质的交换容量大，因而适合用于因而适合用于氨基酸、核苷酸等小分子生化物质的分离纯化氨基酸、核苷酸等小分子生化物质的分离纯化离子交换介质的基本性质离子交换介质的基本性质常用的离子交换剂离子交换纤维素：离子交换纤维素：离子交换纤维素离子交换纤维素是携带功能基团是携带功能基团纤维素衍生物，具有松散的亲水纤维素衍生物，具有松散的亲水性网状结构以及较大的表面积，大分子可以自由通过，因而对生物大性网状结构以及较大的表面积，大分子可以自由通过，因而对生物大分子（如蛋白质）的交换容量比离子交换树脂大分子（如蛋白质）的交换容量比离子交换树脂大 阳离子型阳离子型离子交换纤维素包括离子交换纤维素包括羟甲基纤维素羟甲基纤维素（CMCM纤维素）等纤维素）等维素）维素）阴离子型阴离子型离子交换纤维素包括离子交换纤维素包括二乙基氨基乙基纤维素二乙基氨基乙基纤维素（DEAEDEAE纤纤离子交换介质的基本性质离子交换介质的基本性质常用的离子交换剂离子交换葡聚糖：离子交换葡聚糖：离子交换葡聚糖离子交换葡聚糖是葡聚糖是葡聚糖经环氧氯丙烷交联后形成的具有多孔三经环氧氯丙烷交联后形成的具有多孔三维空间网状结构和离子交换功能基团的多糖衍生物（维空间网状结构和离子交换功能基团的多糖衍生物（SephadexSephadex G G）SephadexSephadex的优点如下：的优点如下：亲水性强、不会引起生物分子的变性和失活，母链对蛋白质、核亲水性强、不会引起生物分子的变性和失活，母链对蛋白质、核酸酸及其它生物分子的非特异性吸附能力小及其它生物分子的非特异性吸附能力小 电离基团在母体上取代程度高，交换容量大，装柱方便，流速快电离基团在母体上取代程度高，交换容量大，装柱方便，流速快 既有离子交换作用，又有分子筛效应既有离子交换作用，又有分子筛效应 因而因而SephadexSephadex是一类广泛应用的色谱分离介质是一类广泛应用的色谱分离介质离子交换介质的基本性质离子交换介质的基本性质常用的离子交换剂离子交换葡聚糖：离子交换葡聚糖：常用的离子交换葡聚糖包括：常用的离子交换葡聚糖包括：阳离子交换剂阳离子交换剂CM-CM-SephadexSephadex C-25 C-25，CM-CM-SephadexSephadex C-50 C-50SephadexSephadex C-25 C-25，Sephadex C-50Sephadex C-50 阴离子交换剂阴离子交换剂DEAE-DEAE-SephadexSephadex A-25 A-25，DEAE-Sephadex A-50DEAE-Sephadex A-50QAE-QAE-SephadexSephadex A-25 A-25，QAE-Sephadex A-50QAE-Sephadex A-50 离子交换介质的基本性质离子交换介质的基本性质常用的离子交换剂离子交换琼脂糖：离子交换琼脂糖：离子交换琼脂糖离子交换琼脂糖是携带是携带DEAEDEAE或或CMCM基团的基团的SepharoseSepharose CL-6B CL-6B DEAE-DEAE-SepharoseSepharose（阴离子型阴离子型）和）和CM-CM-SepharoseSepharose（阳离子型）阳离子型）尤其是介质受尤其是介质受pHpH和离子强度的影响所引起的膨胀和收缩效应较小，因和离子强度的影响所引起的膨胀和收缩效应较小，因的离子交换介质具有硬度大、性质稳定，流速好，分离能力强等优点的离子交换介质具有硬度大、性质稳定，流速好，分离能力强等优点此具有稳定的外形体积此具有稳定的外形体积离子交换介质的选择原则离子交换介质的选择原则一般而言：一般而言：酸性酸性物质用物质用阴离子阴离子交换剂分离交换剂分离氨基酸、核苷酸、蛋白质等氨基酸、核苷酸、蛋白质等两性电解质两性电解质，可根据其，可根据其pIpI值值及及离子化离子化碱性碱性物质用物质用阳离子阳离子交换剂分离交换剂分离曲线曲线来选择来选择离子交换介质的选择原则离子交换介质的选择原则1122334466778899101055pHpH+-蛋蛋白白质质净净电电荷荷等电点等电点吸附阴离子交换剂吸附阴离子交换剂吸附阳离子交换剂吸附阳离子交换剂pH pH pIpI（-）对对pIpI=5=5的某酸性蛋白质的某酸性蛋白质在在pHpH5.5-9.05.5-9.0的范围内，的范围内，当蛋白质为阴离子时，当蛋白质为阴离子时，应首选应首选DEAEDEAE纤维素纤维素；在在pHpH3.5-4.53.5-4.5的范围内，的范围内，当蛋白质为阳离子时，当蛋白质为阳离子时，应首选应首选CMCM纤维素纤维素离子交换层析的基本操作离子交换层析的基本操作层析柱平衡平衡缓冲液的用量至少为柱体积的平衡缓冲液的用量至少为柱体积的 2 2 倍倍平衡缓冲液的流速可略高于正常操作流速平衡缓冲液的流速可略高于正常操作流速平衡终点以流出液的离子浓度、导电性、平衡终点以流出液的离子浓度、导电性、pHpH值与缓冲液一致值与缓冲液一致 为准，其中为准，其中pHpH值最重要值最重要离子交换层析的基本操作离子交换层析的基本操作样品进柱为了达到满意的分离效果，进样量一般为介质为了达到满意的分离效果，进样量一般为介质交换容量交换容量的的10-20%10-20%为了避免进样溶液中的离子强度过高，样品浓度不宜太高为了避免进样溶液中的离子强度过高，样品浓度不宜太高交换容量交换容量：离子交换剂中全部可交换的离子或功能基团的总数：离子交换剂中全部可交换的离子或功能基团的总数离子交换层析的基本操作离子交换层析的基本操作样品洗脱恒定洗脱恒定洗脱阶段洗脱阶段洗脱梯度洗脱梯度洗脱101020203030404050506060707080809090分子浓度分子浓度离子强度离子强度pHpH值值C C 凝胶层析凝胶层析1010 外源基因表达产物的分离纯化外源基因表达产物的分离纯化凝胶层析的基本原理凝胶层析的基本原理凝胶介质的基本性质凝胶介质的基本性质凝胶层析的基本操作凝胶层析的基本操作凝胶介质的选用原则凝胶介质的选用原则凝胶层析的基本原理凝胶层析的基本原理 凝胶层析是凝胶层析是利用有一定孔径范围的利用有一定孔径范围的多孔凝胶多孔凝胶作为固定相，对混合作为固定相，对混合物物中各组份按分子大小进行分离的层析技术，又称为中各组份按分子大小进行分离的层析技术，又称为分子筛分子筛 分子直径比凝胶最大孔隙直径大的，会被全部排阻在凝胶颗粒之分子直径比凝胶最大孔隙直径大的，会被全部排阻在凝胶颗粒之外，即外，即全排阻全排阻；两种全排阻的分子即使大小不同，也不能分开；它们两种全排阻的分子即使大小不同，也不能分开；它们下行速度快下行速度快 分子直径比凝胶最小孔隙直径小的，能进入凝胶颗粒的全部孔隙分子直径比凝胶最小孔隙直径小的，能进入凝胶颗粒的全部孔隙即使大小不同也不能分开；它们的下行速度慢即使大小不同也不能分开；它们的下行速度慢 鉴于上述原理，鉴于上述原理，凝胶层析可用于重组蛋白溶液凝胶层析可用于重组蛋白溶液脱盐脱盐、分子量测定分子量测定以及以及分离纯化分离纯化。凝胶介质的基本性质凝胶介质的基本性质 葡聚糖凝胶的种类有葡聚糖凝胶的种类有G10G10、G15G15、G25G25、G50G50、G75G75、G100G100、GG150150、G200G200，GG5050即表示每克即表示每克干凝胶的吸水量为干凝胶的吸水量为5.05.0毫升毫升 葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶对碱比较稳定对碱比较稳定，在酸性环境中其糖苷键易水解，在酸性环境中其糖苷键易水解 湿态的葡聚糖可加热到湿态的葡聚糖可加热到110110，干的则能耐受，干的则能耐受120120高温高温葡聚糖凝胶（Sephadex）SephadexSephadex LH LH是羟丙基化的是羟丙基化的SephadexSephadex，这类层析介质的流动相既这类层析介质的流动相既可使用缓冲水溶液，也可使用极性有机溶剂，因此可使用缓冲水溶液，也可使用极性有机溶剂，因此适用于非水溶性溶适用于非水溶性溶 质的凝胶过滤质的凝胶过滤 凝胶介质的基本性质凝胶介质的基本性质 琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶是由琼脂中分离出来的天然凝胶，常见的有是由琼脂中分离出来的天然凝胶，常见的有SepharoseSepharose（SepharoseSepharose 2B 2B、4B4B、6B6B，数字代表干胶的百分比数字代表干胶的百分比 ）和）和Bio-Gel-ABio-Gel-A等等（Bio-Gel-A Bio-Gel-A 0.5M0.5M、1.5M1.5M、5M5M、15M15M、50M50M、150150MM，数字数字X10X1066代表排代表排阻限度。阻限度。琼脂糖凝胶 当温度高于当温度高于5050时琼脂糖凝胶便融化，只能在较低的温度下使用。时琼脂糖凝胶便融化，只能在较低的温度下使用。琼脂糖凝胶是一种大孔凝胶，因而适合于分离分子量较大的生物大琼脂糖凝胶是一种大孔凝胶，因而适合于分离分子量较大的生物大分子物质（如蛋白质和分子物质（如蛋白质和DNADNA）。）。SepharoseSepharose CL CL是二溴丙醇交联的琼脂糖，其孔径大小和分离范围是二溴丙醇交联的琼脂糖，其孔径大小和分离范围与普通与普通琼脂糖琼脂糖一样，但热和化学稳定性增加，能高温消毒。一样，但热和化学稳定性增加，能高温消毒。凝胶介质的基本性质凝胶介质的基本性质 聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶凝胶是一种以丙烯酰胺为单位由甲叉双丙烯酰胺交联是一种以丙烯酰胺为单位由甲叉双丙烯酰胺交联而成的人工合成凝胶，控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶，交而成的人工合成凝胶，控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶，交联剂越多，孔隙越小。联剂越多，孔隙越小。聚丙烯酰胺凝胶的商品名为聚丙烯酰胺凝胶的商品名为Bio-GelBio-Gel，型号从型号从P-2P-2至至P-300P-300共共1010种种聚丙烯酰胺凝胶（数字数字X1000X1000就相当于该凝胶的排阻限度）就相当于该凝胶的排阻限度）凝胶介质的选用原则凝胶介质的选用原则 将样品中的大分子物质与小分子物质分开，称为将样品中的大分子物质与小分子物质分开，称为组别分离组别分离，其分，其分离策略是离策略是使高分子物质完全使高分子物质完全被排阻被排阻，小分子物质完全渗入凝胶内。小分子物质完全渗入凝胶内。组别分离一般选用组别分离一般选用SephadexSephadex G-25 G-25或或G-50G-50，对于小肽和低分子量对于小肽和低分子量的物质（分子量范围的物质（分子量范围1000-50001000-5000）的脱盐可选用）的脱盐可选用SephadexSephadex G-10 G-10、G-G-组别分离1515、Bio-Gel P-2Bio-Gel P-2或或P-P-4 4凝胶介质的选用原则凝胶介质的选用原则 将样品中一些分子量比较接近的物质分开，这种分离叫将样品中一些分子量比较接近的物质分开，这种分离叫分级分离分级分离该策略是该策略是使高分子物质完全使高分子物质完全被排阻被排阻，小分子物质完全渗入凝胶内。小分子物质完全渗入凝胶内。分级分离一般选用分级分离一般选用排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶在层析过程中，样品中各组份均能不同程度地深入到凝胶内部，但由在层析过程中，样品中各组份均能不同程度地深入到凝胶内部，但由分级分离于深入凝胶空隙程度上的差异，最后得到分离。于深入凝胶空隙程度上的差异，最后得到分离。凝胶层析的基本操作凝胶层析的基本操作平衡溶液的流速应低于层析时需要的流速平衡溶液的流速应低于层析时需要的流速注意凝胶的断层和气泡注意凝胶的断层和气泡层析柱平衡操作压控制平衡和洗脱时应维持流速恒定平衡和洗脱时应维持流速恒定恒定的操作压是恒流的先决条件恒定的操作压是恒流的先决条件凝胶层析的基本操作凝胶层析的基本操作上柱样品溶液的体积根据分离要求来确定：上柱样品溶液的体积根据分离要求来确定：进样体积进行组别分离时，样品溶液最大可为柱体积的进行组别分离时，样品溶液最大可为柱体积的10%10%进行分级分离时，样品溶液的体积要小，使样品层尽可能进行分级分离时，样品溶液的体积要小，使样品层尽可能窄，这样洗脱出的峰形好窄，这样洗脱出的峰形好D D 亲和层析亲和层析1010 外源基因表达产物的分离纯化外源基因表达产物的分离纯化亲和层析的基本概念亲和层析的基本概念亲和层析载体的性质与选择亲和层析载体的性质与选择亲和层析配基的性质与选择亲和层析配基的性质与选择亲和层析的基本操作亲和层析的基本操作亲和层析的基本概念亲和层析的基本概念 亲和层析亲和层析是利用待分离物质与其特异性配体之间特异性的亲和力是利用待分离物质与其特异性配体之间特异性的亲和力进行分离的一类进行分离的一类特殊的层析技术，它有如下特点：特殊的层析技术，它有如下特点：纯化过程简单、迅速，且分离效率高纯化过程简单、迅速，且分离效率高特别适用于分离纯化一些含量低、稳定性差的生物大分子特别适用于分离纯化一些含量低、稳定性差的生物大分子亲和层析的基本特点纯化倍数大，产物纯度高纯化倍数大，产物纯度高必须针对某一分离对象制备专一的配基及寻求稳定的层析条件必须针对某一分离对象制备专一的配基及寻求稳定的层析条件因此应用范围受到一定的限制因此应用范围受到一定的限制亲和层析的基本概念亲和层析的基本概念抗原与抗体抗原与抗体DNADNA与互补与互补DNADNA或或RNARNA（cDNAcDNA、mRNAmRNA)酶与其底物、竞争性抑制剂、酶与其底物、竞争性抑制剂、辅酶因子辅酶因子激素或药物与其受体激素或药物与其受体具有特异性亲和作用的生物分子维生素于其特异性结合蛋白维生素于其特异性结合蛋白糖蛋白与其相应的植物凝集素糖蛋白与其相应的植物凝集素亲和层析的基本概念亲和层析的基本概念亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连作为固定相吸附剂作为固定相吸附剂当含有混合组份的样品（流动相）通过此固定相时，只有当含有混合组份的样品（流动相）通过此固定相时，只有和固定相分子有特异亲和力的物质，才能被固定相吸附结和固定相分子有特异亲和力的物质，才能被固定相吸附结亲和层析的基本原理合，其它没有亲和力的无关组份就随流动相流出合，其它没有亲和力的无关组份就随流动相流出然后改变流动组成份，将结合的亲和物洗脱下来然后改变流动组成份，将结合的亲和物洗脱下来亲和层析载体的性质与选择亲和层析载体的性质与选择具有多孔的立体网状结构，能使被亲和吸附的大分子自由通过具有多孔的立体网状结构，能使被亲和吸附的大分子自由通过具有良好机械性能的均匀珠状颗粒，具有良好的流速具有良好机械性能的均匀珠状颗粒，具有良好的流速亲和层析载体的选择具有惰性，尽量减少非专一性吸附具有惰性，尽量减少非专一性吸附具有相当量的易活化的基团，在温和的条件下能与配基共价合具有相当量的易活化的基团，在温和的条件下能与配基共价合偶联偶联在偶联、吸附和洗脱时，有较好的物理化学稳定性在偶联、吸附和洗脱时，有较好的物理化学稳定性亲和层析载体的性质与选择亲和层析载体的性质与选择纤维素纤维素葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶 常用的亲和层析载体琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶其它新型载体其它新型载体 亲和层析配基的性质与选择亲和层析配基的性质与选择纯化对象和配基之间必须有较强的亲和力纯化对象和配基之间必须有较强的亲和力但亲和力太高也是有害的，因为在解离配基复合物时所需的但亲和力太高也是有害的，因为在解离配基复合物时所需的亲和层析配基的选择条件就要强烈，条件就要强烈，这样可能使生物分子变性这样可能使生物分子变性配基必须具有适当的化学基团，配基必须具有适当的化学基团，这种基团不参与配基与生物这种基团不参与配基与生物分子之间特异结合，但可用于分子之间特异结合，但可用于和载体相连，同时又不影响配和载体相连，同时又不影响配基与生物分子之间的亲和力基与生物分子之间的亲和力亲和层析配基的性质与选择亲和层析配基的性质与选择酸酐法酸酐法N-N-取代羟基琥珀酰亚胺法取代羟基琥珀酰亚胺法配基的偶联叠氮化作用叠氮化作用还原性烷基化合物（西夫碱）的形成还原性烷基化合物（西夫碱）的形成亲和层析的基本操作亲和层析的基本操作通常采用改变通常采用改变pHpH、离子强度、离子种类或者温度等使与固定配离子强度、离子种类或者温度等使与固定配泛的是改变溶液的离子强度。泛的是改变溶液的离子强度。非专一性洗脱化的配基对相应的生物大分子的亲和力降低化的配基对相应的生物大分子的亲和力降低基结合的生物大分子的构象发生变化，降低其亲和力，但使用较广基结合的生物大分子的构象发生变化，降低其亲和力，但使用较广非专一性洗脱剂的作用并不是使被吸附的生物大分子的构象发非专一性洗脱剂的作用并不是使被吸附的生物大分子的构象发生变化，生变化，而是洗脱剂中的某一组分与固定配基形成复合物，使固定而是洗脱剂中的某一组分与固定配基形成复合物，使固定亲和层析的基本操作亲和层析的基本操作使用使用特异的配基作为洗脱剂特异的配基作为洗脱剂 溶液为洗脱剂，通过与亲和配基或目标产物的竞争性结合来洗溶液为洗脱剂，通过与亲和配基或目标产物的竞争性结合来洗专一性洗脱使用含有与亲和配基或目标产物具有亲和作用的小分子化合物使用含有与亲和配基或目标产物具有亲和作用的小分子化合物 脱目标产物脱目标产物亲和层析的基本操作亲和层析的基本操作 亲和双方吸附能力很强，可以用专一的化学方法裂解配基与载亲和双方吸附能力很强，可以用专一的化学方法裂解配基与载性洗脱法也是一种非特异性洗脱方法性洗脱法也是一种非特异性洗脱方法特殊性洗脱体的连接键，获得的配基体的连接键，获得的配基-蛋白络合物后，再除去配基。实际上特殊蛋白络合物后，再除去配基。实际上特殊E E 膜分离膜分离1010 外源基因表达产物的分离纯化外源基因表达产物的分离纯化膜分离的基本原理膜分离的基本原理分离膜的主要性能分离膜的主要性能影响膜分离的因素影响膜分离的因素膜分离的基本原理膜分离的基本原理 膜分离是利用膜的选择性，以膜的两侧存在一定量的能量差作为膜分离是利用膜的选择性，以膜的两侧存在一定量的能量差作为化，它是一种物质被透过或被截留的过程，近似于筛分过程，依据滤化，它是一种物质被透过或被截留的过程，近似于筛分过程，依据滤膜分离的基本定义推动力，由于溶液中各组分透过膜的迁移速率不同而实现的分离。推动力，由于溶液中各组分透过膜的迁移速率不同而实现的分离。膜分离是膜分离是利用具有一定选择性透过特性的介质进行物质的分离纯利用具有一定选择性透过特性的介质进行物质的分离纯膜孔径和物质粒子的大小而达到物质分离的目的膜孔径和物质粒子的大小而达到物质分离的目的膜分离的基本原理膜分离的基本原理分子级别的分离过程，分离效率高分子级别的分离过程，分离效率高膜分离的特点不涉及相变，能耗低，运行成本低不涉及相变，能耗低，运行成本低膜分离为单纯物理变化，无二次污染膜分离为单纯物理变化，无二次污染膜分离的基本原理膜分离的基本原理分离膜的选择通透性：是物质分离的分离膜的选择通透性：是物质分离的第一机制第一机制膜分离过程的重要参数膜分离过程的推动力：膜分离过程的推动力：静压力差静压力差、浓度差浓度差、电位差电位差物质通过分离膜的速度：是物质分离的物质通过分离膜的速度：是物质分离的第二机制第二机制膜分离的基本原理膜分离的基本原理 根据分离膜根据分离膜膜内平均孔径、推动力和传递机制不同，膜分离可膜内平均孔径、推动力和传递机制不同，膜分离可膜分离的主要类型反渗透反渗透（Reverse osmosis ROReverse osmosis RO）透析（透析（Dialysis DSDialysis DS）分成分成下列几类：下列几类：超滤（超滤（UitrfiltrationUitrfiltration UF UF）微滤（微滤（MicrofitrationMicrofitration MF MF）电渗析电渗析（ElectrodialysisElectrodialysis EI EI）膜分离的基本原理膜分离的基本原理透析（透析（Dialysis DSDialysis DS）膜分离的主要类型 透析过程透析过程使用使用一种只透过溶剂而不透过溶质的膜，一般称为理一种只透过溶剂而不透过溶质的膜，一般称为理 当把溶剂和溶液（或把两种不同浓度的溶液）分别置于此两侧当把溶剂和溶液（或把两种不同浓度的溶液）分别置于此两侧想的半透膜想的半透膜时，纯溶剂将自然穿过半透膜而自发地向溶液（或从低浓度向高浓时，纯溶剂将自然穿过半透膜而自发地向溶液（或从低浓度向高浓度）一侧流动，这种现象叫度）一侧流动，这种现象叫渗透渗透膜分离的基本原理膜分离的基本原理反渗透反渗透（Reverse osmosis ROReverse osmosis RO）膜分离的主要类型 反渗透反渗透其主要原理是在高于溶液渗透压的作用下，使其它物质其主要原理是在高于溶液渗透压的作用下，使其它物质溶解盐类、胶体、微生物、热源、有机物等，因而主要用于海水、溶解盐类、胶体、微生物、热源、有机物等，因而主要用于海水、不能透过半透膜，而将这些物质与水分离开来，有效地去除水中的不能透过半透膜，而将这些物质与水分离开来，有效地去除水中的苦咸水淡化和产纯水制备等方面苦咸水淡化和产纯水制备等方面膜分离的基本原理膜分离的基本原理超滤（超滤（UitrfiltrationUitrfiltration UF UF）膜分离的主要类型 超滤超滤是一种是一种根据高分子溶质之间或高分子与小分子溶质之间相根据高分子溶质之间或高分子与小分子溶质之间相相应的截留分子量范围从相应的截留分子量范围从500500到到100100万左右。万左右。对分子质量的差别进行分离的方法。筛分孔径范围对分子质量的差别进行分离的方法。筛分孔径范围1 1 nm-0.1 nm-0.1 m mmm，分离膜的基本性能分离膜的基本性能 分离膜是膜分离技术的核心，分离膜的性能主要包括分离膜是膜分离技术的核心，分离膜的性能主要包括分离透过分离透过性、耐酸碱性、抗氧化性、抗微生物降解性、亲水性、疏水性、电性、耐酸碱性、抗氧化性、抗微生物降解性、亲水性、疏水性、电性能和性能和化学物理化学物理性能两部分。其中，化学物理性能主要涉及到耐热性能两部分。其中，化学物理性能主要涉及到耐热性能、毒性、机械强度等。性能、毒性、机械强度等。膜的化学物理性能分离膜的基本性能分离膜的基本性能微滤膜微滤膜0.025-14 0.025-14 m mmm反渗透膜反渗透膜0.0001-0.001 0.0001-0.001 m mmm超滤膜超滤膜0.001-0.02 0.001-0.02 m mmm纳米过滤膜纳米过滤膜平均孔径平均孔径 2 2 nmnm膜的分类按膜的孔径大小分类：按膜的孔径大小分类：分离膜的基本性能分离膜的基本性能对称性膜对称性膜膜截面上的孔道结构均匀膜截面上的孔道结构均匀不对称性膜不对称性膜由表面活性层（超薄层）和惰性层（支撑层）构成由表面活性层（超薄层）和惰性层（支撑层）构成膜的分类按膜的结构分类：按膜的结构分类：传质阻力大，透过通量低，易污染、难清洗传质阻力大，透过通量低，易污染、难清洗传质阻力小，透过通量高，被广泛使用传质阻力小，透过通量高，被广泛使用分离膜的基本性能分离膜的基本性能天然高分子膜天然高分子膜 醋酸纤维素、硝酸纤维素、再生纤维素醋酸纤维素、硝酸纤维素、再生纤维素合成聚合物膜合成聚合物膜 聚砜、聚酰胺、聚烯、含氟聚合物聚砜、聚酰胺、聚烯、含氟聚合物膜的分类按膜的材料分类：按膜的材料分类：无机材料膜无机材料膜 陶瓷、微孔玻璃、不锈钢、碳素陶瓷、微孔玻璃、不锈钢、碳素 将膜固定在合适的支撑物上即构成膜组件，商品化的膜组件有：将膜固定在合适的支撑物上即构成膜组件，商品化的膜组件有：管式管式、板式板式、螺旋圈式螺旋圈式、中空纤维中空纤维（毛细管）（毛细管）影响膜分离的因素影响膜分离的因素影响膜分离效率的主要因素是膜的污染，其表现形式是：影响膜分离效率的主要因素是膜的污染，其表现形式是：溶质在膜孔内吸附溶质在膜孔内吸附造成膜污染的主要原因是：造成膜污染的主要原因是：蛋白质在不同蛋白质在不同pHpH条件下所带电荷对膜电荷的相互作用条件下所带电荷对膜电荷的相互作用无机盐通过形成复合物、改变溶液离子强度等机制污染膜无机盐通过形成复合物、改变溶液离子强度等机制污染膜溶质在膜表面沉淀或结晶溶质在膜表面沉淀或结晶膜分离过程中体系的粘度增大会污染膜膜分离过程中体系的粘度增大会污染膜F F 原核生物表达的重组蛋白质量检测原核生物表达的重组蛋白质量检测1010 外源基因表达产物的分离纯化外源基因表达产物的分离纯化 工业化生产的重组蛋白必须经过严格的质量控制才能成为产品。工业化生产的重组蛋白必须经过严格的质量控制才能成为产品。重组蛋白的质量控制指标包括：重组蛋白的质量控制指标包括：重组蛋白的鉴别（序列）重组蛋白的鉴别（序列）重组蛋白的纯度（杂质的类型）重组蛋白的纯度（杂质的类型）重组蛋白的活性（检测方法）重组蛋白的活性（检测方法）重组蛋白的安全性重组蛋白的安全性重组蛋白的稳定性重组蛋白的稳定性重组蛋白的一致性（构象与构型）重组蛋白的一致性（构象与构型）原核细菌表达的重组蛋白产物的质量检测项目与方法原核细菌表达的重组蛋白产物的质量检测项目与方法检测项目检测项目检测方法检测方法产品是否含内毒素产品是否含内毒素家兔热原法家兔热原法蛋白质是否变异蛋白质是否变异肽谱、肽谱、HPLCHPLC、等电聚焦、毛细管电泳等电聚焦、毛细管电泳甲硫氨酸是否被甲酰化甲硫氨酸是否被甲酰化肽谱、质谱、肽谱、质谱、HPLCHPLC、EdmanEdman分析分析蛋白质是否变性、聚合、脱氨基蛋白质是否变性、聚合、脱氨基SDS-PAGESDS-PAGE、凝胶层析、等电聚焦、质凝胶层析、等电聚焦、质配体是否脱落配体是否脱落SDS-PAGESDS-PAGE、免疫分析免疫分析氨基酸是否发生取代氨基酸是否发生取代氨基酸分析、肽谱、质谱、毛细管电泳氨基酸分析、肽谱、质谱、毛细管电泳产品是否被细菌、病毒、支原体等污染产品是否被细菌、病毒、支原体等污染微生物学检测微生物学检测谱、谱、HPLCHPLC、毛细管电泳、毛细管电泳、EdmanEdman分析分析D D 亲和层析亲和层析1010 外源基因表达产物的分离纯化外源基因表达产物的分离纯化C C 凝胶层析凝胶层析B B 离子交换层析离子交换层析A A 重组蛋白分离纯化方法选择的基本原则重组蛋白分离纯化方法选择的基本原则F F 原核生物表达的重组蛋白质量检测原核生物表达的重组蛋白质量检测E E 膜分离膜分离