DNA的生物合成复制市公开课一等奖省赛课微课金奖课件.pptx

核酸生物合成核酸生物合成DNA生物合成生物合成RNA生物合成生物合成1/75当代生物学已充分证实，当代生物学已充分证实，核酸核酸是生物遗传物质基是生物遗传物质基础。础。除少数除少数RNA病毒外，几乎全部生物均以病毒外，几乎全部生物均以DNA为遗为遗传信息载体。传信息载体。2/751958年年，Crick提提出出了了遗遗传传信信息息“中中心心法法则则”。DNA经经过过复复制制（replication）将将遗遗传传信信息息由由亲亲代代传传递递给给子子代代；经经过过转转录录（transcription）和和翻翻译译（translation），合合成成特特异异蛋蛋白白质质，以以执执行行各各种种生生命命功功效效，使使后后代代表表现现出出与与亲亲代代相相同同遗遗传传性性状状。DNA复复制制、转转录录和和翻翻译译过过程程就就组组成成了了分分子子生生物学物学中心法则中心法则（central dogma）。）。补补充充：在在一一些些情情况况下下，RNA也也能能够够是是遗遗传传信信息息基基本本携携带带者者。如如：RNA病病毒毒能能以以本本身身RNA分分子子为为模模板板进进行行复复制制；致致癌癌RNA病病毒毒还还能能经经过过逆逆转转录录方方式式将将遗遗传传信信息息传传递递给给DNA。DNA复制复制转录转录翻译翻译RNA逆转录逆转录蛋白质蛋白质复制（病毒）复制（病毒）3/75第一节第一节 DNADNA生物合成生物合成DNA自我复制自我复制逆转录作用逆转录作用DNA损伤、修复和突变损伤、修复和突变4/75一、一、DNADNA自我复制自我复制（一）（一）半保留复制半保留复制（semiconservative replication）v双螺旋双螺旋DNA每一条每一条DNA链作为链作为模板复制一条新链，可产生两模板复制一条新链，可产生两个新双螺旋个新双螺旋DNA分子，这两个分子，这两个子代子代DNA分子都含有一条新链、分子都含有一条新链、一条旧链。一条旧链。v与之相对是与之相对是全保留复制全保留复制：由复：由复制产生新合成制产生新合成DNA链组成双螺链组成双螺旋分子，而亲本双链得以保留。旋分子，而亲本双链得以保留。动画：动画：DNA replication5/751958年年Meselson 和和Stahl 用用同同位位素素示示踪踪和和密密度度梯梯度度离离心心方法证实了方法证实了DNA半保留复制半保留复制。该该试试验验首首先先将将大大肠肠杆杆菌菌在在含含15N培培养养基基中中培培养养约约15代代，使使其其DNA中中碱碱基基氮氮均均转转变变为为15N。然然后后将将大大肠肠杆杆菌菌移移至至只只含含14N培培养养基基中中同同时时培培养养一一代代、二二代代。分分别别提提取取DNA，作作密密度度梯梯度度离离心心，将将含含有有不不一一样样密度密度DNA分离开。分离开。DNA半保留复制试验证实半保留复制试验证实动画：动画：DNA半保留复制试验半保留复制试验6/75按半保留复制方式，子代按半保留复制方式，子代DNA与亲代与亲代DNA碱基碱基序列一致序列一致，即子代保留了亲代全部遗传信息，表，即子代保留了亲代全部遗传信息，表达了遗传达了遗传保守性保守性。半保留复制意义半保留复制意义7/75模板模板 底物底物 解螺旋酶解螺旋酶 单链结合蛋白单链结合蛋白拓扑异构酶拓扑异构酶 引物、引物酶引物、引物酶 DNA聚合酶聚合酶 DNA连接酶连接酶（二）（二）DNA复制条件复制条件8/75 DNA复制是模板依赖性，复制是模板依赖性，必须要以必须要以亲代亲代DNA链作链作为模板为模板。亲代。亲代DNA两股两股链解开后，可分别作为链解开后，可分别作为模板进行复制。模板进行复制。1.模板（模板（template）9/75以四种脱氧核苷三磷酸为底物，即以四种脱氧核苷三磷酸为底物，即dATP、dGTP、dCTP、dTTP。2.2.底物（底物（substratesubstrate）dNMP和和dNTP代表任意一个脱氧核苷酸和脱代表任意一个脱氧核苷酸和脱氧核苷三磷酸。氧核苷三磷酸。10/75解螺旋酶解螺旋酶（helicase），又称，又称解链酶解链酶，是用于，是用于解开解开DNA双链酶蛋白。双链酶蛋白。大肠杆菌有大肠杆菌有4中解螺旋酶，即解螺旋酶中解螺旋酶，即解螺旋酶I、II、III和和Rep蛋白，其中蛋白，其中Rep蛋白是最主要解螺旋蛋白是最主要解螺旋酶。酶。每解开一对碱基，需消耗每解开一对碱基，需消耗2分子分子ATP，依靠水解，依靠水解ATP提供解链所需要能量。提供解链所需要能量。3.解螺旋酶解螺旋酶11/75单链单链DNA结合蛋白（结合蛋白（single strand binding protein,SSB），），是一些能够与单链是一些能够与单链DNA结合蛋结合蛋白质因子。白质因子。4.单链单链DNA结合蛋白结合蛋白使解开双螺旋后使解开双螺旋后DNA单链能够稳定存在，即单链能够稳定存在，即稳定稳定单链单链DNA，便于其作为模板复制子代，便于其作为模板复制子代DNA；保护单链保护单链DNA，防止核酸酶降解。，防止核酸酶降解。12/7513/755.DNA拓扑异构酶拓扑异构酶引引发发拓拓扑扑异异构构反反应应酶酶称称为为拓拓扑扑异异构构酶酶（topoisomerase）。DNA复复制制时时模模板板DNA超超螺螺旋旋松松弛弛和和复复制制后后超超螺螺旋旋再再恢恢复复都需要拓扑异构酶参加。都需要拓扑异构酶参加。解链过程中正超螺旋形成解链过程中正超螺旋形成拓扑一词含义是指物体或图象做弹性移位而又保持物体不变性质。拓扑一词含义是指物体或图象做弹性移位而又保持物体不变性质。DNA 分子中存在打结，缠绕、连环现象。分子中存在打结，缠绕、连环现象。14/75拓扑异拓扑异构酶构酶I I切断切断DNA双链中双链中一股一股链，使链，使DNA解链解链旋转不致打结；适当初候封闭切口，旋转不致打结；适当初候封闭切口，DNA变为松弛状态变为松弛状态。反应反应不需不需ATP。拓扑异拓扑异构酶构酶II II切断切断DNA分子分子两股两股链，断端经过切口链，断端经过切口旋转使超螺旋松弛。旋转使超螺旋松弛。利用利用ATP供能，连接断端，供能，连接断端，DNA分子分子进入负超螺旋状态。进入负超螺旋状态。按照作用机制，拓扑异构酶可分为按照作用机制，拓扑异构酶可分为I、II两种类型。两种类型。动画：动画：拓扑异构酶拓扑异构酶15/75拓拓扑扑异异构构酶酶II也也叫叫旋旋转转酶酶（gyrase），在在有有ATP功功效效情情况况下下，可可引引入入负负超超螺螺旋旋，可可消消除除复复制制叉叉前前进进时时产产生生扭扭曲曲张力，它和拓扑异构酶张力，它和拓扑异构酶I一起共同控制着一起共同控制着DNA拓扑结构。拓扑结构。16/75引物酶引物酶（primase）本质上是一个依赖）本质上是一个依赖DNARNA聚合聚合酶，该酶以酶，该酶以DNA为模板，聚合一段为模板，聚合一段RNA短链短链引物引物（primer），以提供自由），以提供自由3-OH，使子代，使子代DNA链能够链能够开始聚合。开始聚合。引物酶需组装成引物酶需组装成引发体引发体才能催化才能催化RNA引物合成。引物合成。6.引物、引物酶引物、引物酶在在E.coli中中，含含有有DnaB蛋蛋白白、DnaC蛋蛋白白、引引物物酶酶（DnaG蛋蛋白白）和和DNA复复制制起起始始区区域域复复合合结结构构被被称称为为引引发体发体（primosome）。17/75许多与许多与DNA复制直接相关基因被称为复制直接相关基因被称为dna基因；基因；不过也有其它不一样名称。不过也有其它不一样名称。与复制相关基因与复制相关基因：dnaA、dnaB、dnaX对应基因产物对应基因产物：DnaA、DnaBDnaXDnaA：识别复制起始点：识别复制起始点oriC（origin C）；）；DnaB：引发体组分，含有解螺旋酶活性；：引发体组分，含有解螺旋酶活性；DnaC：引发体组分，帮助：引发体组分，帮助DnaB结合于起点；结合于起点；DnaG：引物酶，合成前体片段引物。：引物酶，合成前体片段引物。18/75引物酶催化合成短链引物酶催化合成短链RNA引物分子引物分子 RNA引物大小，在原核生物中通常为引物大小，在原核生物中通常为50 100个核苷酸，个核苷酸，而在真核生物中约为而在真核生物中约为10个核苷酸。个核苷酸。RNA引物碱基次序，引物碱基次序，与其模板与其模板DNA碱基次序相配对。碱基次序相配对。19/757.DNA7.DNA聚合酶聚合酶全称：依赖全称：依赖DNADNA聚合酶聚合酶 （DNA-dependent DNA polymerase，DDDP），简称：），简称：DNA-pol活性：活性：1.53 聚合酶活性；聚合酶活性；2.核酸外切酶活性核酸外切酶活性DNA聚合酶催化聚合酶催化DNA链延长链延长20/75 核酸酶核酸酶：作用于核酸磷酸二酯酶称为核酸酶，按其作用：作用于核酸磷酸二酯酶称为核酸酶，按其作用位置分为位置分为:1.核酸外切酶：核酸外切酶：作用于核酸链末端（作用于核酸链末端（3端或端或5端），逐端），逐一水解下核苷酸。一水解下核苷酸。脱氧核糖核酸外切酶：只作用于脱氧核糖核酸外切酶：只作用于DNA；核糖核酸外切酶：只作用于核糖核酸外切酶：只作用于RNA。2.核酸内切酶：核酸内切酶：从核酸分子内部切断从核酸分子内部切断3，5-磷酸二酯键。磷酸二酯键。l限制性内切酶：限制性内切酶：在细菌细胞内存在一类能识别并水在细菌细胞内存在一类能识别并水解外源双链解外源双链DNA核酸内切酶，可用于特异切割核酸内切酶，可用于特异切割DNA，常作为工具酶。，常作为工具酶。21/75在在原原核核生生物物中中，主主要要DNA聚聚合合酶酶有有三三种种，分分别别命命名名为为DNA聚聚合合酶酶 I（pol I），DNA聚聚合合酶酶II（pol II），DNA聚聚合合酶酶III（pol III），这这三三种种酶酶都都属属于于含含有有各各种种酶活性多功效酶。酶活性多功效酶。1999年发觉年发觉DNA聚合酶聚合酶 IV、V。参加参加DNA复制主要是复制主要是pol III和和pol I。（1）种类和生理功效）种类和生理功效22/75DNA聚聚合合酶酶I：主主要要功功效效是是参参加加DNA修修复复，切切除除RNA引物并填补其留下空隙缺口。引物并填补其留下空隙缺口。DNA聚聚合合酶酶II：主主要要功功效效可可能能是是参参加加DNA损损伤伤修修复复。（详细不祥）（详细不祥）DNA聚合酶聚合酶III：是是催化大肠杆菌催化大肠杆菌DNA复制主要酶。复制主要酶。23/75 原核生物中三种原核生物中三种DNA聚合酶聚合酶24/75真核生物真核生物DNA聚合酶聚合酶25/75为为了了确确保保遗遗传传稳稳定定，DNA复复制制必必须须含含有有高高保保真真性性。DNA复制时保真性主要与以下原因相关：复制时保真性主要与以下原因相关：1恪守严格碱基配对规律；恪守严格碱基配对规律；2DNA聚合酶在复制时对碱基正确选择；聚合酶在复制时对碱基正确选择；3对复制过程中出现错误及时进行校正。对复制过程中出现错误及时进行校正。（2）DNA复制保真性（复制保真性（fidelity）26/75DNA-pol I DNA-pol I 核酸外切酶活性和及时校读核酸外切酶活性和及时校读A：DNA-pol I 外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合酶活性掺入正确配正确底物。酶活性掺入正确配正确底物。B：碱基配对正确，：碱基配对正确，DNA-pol I不表现外切酶活性。不表现外切酶活性。27/75DNA连接酶（连接酶（DNA ligase）可催可催化两段化两段DNA片段之间磷酸二酯键片段之间磷酸二酯键形成，从而把两段相邻形成，从而把两段相邻DNA链连链连接成一条完整链。接成一条完整链。8.DNA连接酶连接酶DNA连接酶连接作用连接酶连接作用 DNA连接酶催化条件是：连接酶催化条件是：需需一一段段DNA片片段段含含有有3-OH，而而另一段另一段DNA片段含有片段含有5-Pi基；基；未未封封闭闭切切口口位位于于双双链链DNA中中，即即其中有一条链是完整；其中有一条链是完整；需需要要消消耗耗能能量量，在在原原核核生生物物中中由由NAD+供供能能，在在真真核核生生物物中中由由ATP供供能能。28/75 DNA连接酶在复制中起最终接合切口作用。连接酶在复制中起最终接合切口作用。在在DNA修复、重组及剪接中也起缝合切口作用。修复、重组及剪接中也起缝合切口作用。是基因工程主要工具酶之一。是基因工程主要工具酶之一。DNA连接酶作用连接酶作用29/75（三）（三）原核细胞原核细胞DNA复制过程复制过程复制起始复制起始 链延长链延长 链终止链终止 以大肠杆菌染色体（闭环以大肠杆菌染色体（闭环DNA分子）复制为例。分子）复制为例。30/75DNA在复制时，需在特定位点起始，这是一些含有特定核苷在复制时，需在特定位点起始，这是一些含有特定核苷酸排列次序片段，即酸排列次序片段，即复制起始点（复制起始点（origin）。在原核生物中，复制起始点通常为一个。大肠杆菌复制原点在原核生物中，复制起始点通常为一个。大肠杆菌复制原点碱基序列是高度保守。关键序列是两组短重复：碱基序列是高度保守。关键序列是两组短重复：3个个13bp重重复序列和复序列和4个个9bp重复序列。重复序列。1.复制起始点和方向复制起始点和方向大肠杆菌复制原点大肠杆菌复制原点OriC中特殊序列中特殊序列31/75DNA复制时，以复制起始点复制时，以复制起始点（origin）为中心，向两个）为中心，向两个方向进行解链，形成两个延方向进行解链，形成两个延伸方向相反复制叉，称为伸方向相反复制叉，称为双双向复制向复制（bidirectional replication）。）。但在低等生物中，也可进行但在低等生物中，也可进行单向复制。单向复制。双向复制双向复制32/75E.coli染色体染色体DNA复制：复制时有一个复制起点，双复制：复制时有一个复制起点，双向展开，形成向展开，形成状中间物，直至两个复制叉相遇，这种状中间物，直至两个复制叉相遇，这种复制称复制称复制。复制。33/75真核细胞基因线状真核细胞基因线状DNA上含有多个复制起点，是上含有多个复制起点，是多复制子。多复制子。真核细胞真核细胞DNA链较原核生物长很多，聚合速度又链较原核生物长很多，聚合速度又较慢，怎样处理？较慢，怎样处理？34/75习习惯惯上上把把两两个个相相邻邻DNA复复制制起起始始点点之之间间距距离离（或或DNA片片段段）定定为为一一个个复复制子制子（replicon）。复复制制子子是是独独立立完完成成复复制制功功效单位。效单位。DNA复复制制时时，在在复复制制起起始始点点处处，DNA双双链链部部分分解解开开为为单单链链，形形成成叉叉子子形形状状，这这种种叉叉状状结结构构称称为为复复制制叉叉（replication fork）。）。35/75复制起始点、复制子与复制叉（动画演示）复制起始点、复制子与复制叉（动画演示）36/75大约大约20个各带个各带1个个ATP DnaA蛋白结合到蛋白结合到9bp重复序列上，重复序列上，DNA缠绕在上面，形缠绕在上面，形成起始复合物（成起始复合物（initial complex）。）。HU复合物是类组蛋白，可与复合物是类组蛋白，可与DNA结合，结合，促进起始，受其影响，邻近促进起始，受其影响，邻近3个个13bp重复重复序列被变性成开放复合物，即解链而形序列被变性成开放复合物，即解链而形成一小段单链，所需能量由成一小段单链，所需能量由ATP供给。供给。DnaB在在DnaC帮助下结合于解链区，帮助下结合于解链区，DnaB借助水解借助水解ATP产生能量，沿产生能量，沿DNA链链5 3方向移动，解开方向移动，解开DNA双链。再双链。再与引物酶（与引物酶（DnaG蛋白）组装成引发体蛋白）组装成引发体（primosome），以备引物和），以备引物和DNA 合合成。成。起始过程起始过程37/75DnaB（解旋酶）、（解旋酶）、DnaA 和和DnaC参加解链，形成参加解链，形成复制叉复制叉（replication fork），），SSB结合并稳定解开单股结合并稳定解开单股DNA链；引物酶（链；引物酶（DnaG）与上述因子、酶组成）与上述因子、酶组成引发体引发体（primosome），并合成），并合成RNA引物，以引物，以DNA为模板，合成一段短为模板，合成一段短RNA片段，从而片段，从而取得取得3端自由羟基（端自由羟基（3-OH）。解链造成超螺旋，由）。解链造成超螺旋，由拓扑异构酶拓扑异构酶II实现超螺旋转型，实现超螺旋转型，即把正超螺旋转变为负超螺旋。即把正超螺旋转变为负超螺旋。38/7539/752.2.复制延长复制延长 复复制制延延长长指指在在DNA聚聚合合酶酶催催化化下下，以以35方方向向亲亲代代DNA链链为为模模板板，从从53方方向向聚聚合合子子代代DNA链链。其其化化学学本本质质是是dNTP以以dNMP方方式式逐逐一一加加入入引物或延长中子链上，磷酸二酯键不停生成。引物或延长中子链上，磷酸二酯键不停生成。在原核生物中，参加在原核生物中，参加DNA复制延长是复制延长是DNA聚合酶聚合酶III。40/75 复制起点解开后形成复制起点解开后形成2个复制叉，进行双向复制。个复制叉，进行双向复制。当复制叉沿当复制叉沿DNA模板向前移动时，新生成模板向前移动时，新生成DNA方向与复制方向与复制叉移动方向相同吗？叉移动方向相同吗？半不连续复制半不连续复制41/75DNA聚合酶只能以聚合酶只能以53方方向聚合向聚合子代子代DNA链链，即，即模模板板DNA链链方向必须是方向必须是35。因为因为DNA分子中两条链走分子中两条链走向相反，所以当分别以两向相反，所以当分别以两条亲代条亲代DNA链作为模板聚链作为模板聚合子代合子代DNA链时，子代链链时，子代链聚合方向也是不一样。聚合方向也是不一样。半不连续复制半不连续复制42/75在在DNA复复制制时时，以以35方方向向亲亲代代DNA链链作作模模板板子子代代链链在在复复制制时时是是连连续续进进行行，其其子子代代链链聚聚合合方方向向为为53，延延伸伸方方向向与与复复制制叉叉移移动动方方向向相相同同，这这一一条条链链被被称称为为前前导导链链（leading strand）。）。以以53方方向向亲亲代代DNA链链为为模模板板子子代代链链在在复复制制时时则则是是不不连连续续，由由许许多多53DNA片片断断组组成成，延延伸伸方方向向与与复复制制叉叉移移动动方方向向相相反反，这这条条链链被被称称为为滞滞后后链链（lagging strand）。）。滞后链上每一段滞后链上每一段DNA短链称为称为短链称为称为冈崎片段冈崎片段（Okazaki fragment）。）。冈冈崎崎片片段段大大小小，在在原原核核生生物物中中约约为为1000个个核核苷苷酸酸，而而在在真真核核生生物物中中约约为为100个个核核苷酸。苷酸。前导链连续复制而滞后链不连续复制，就是复制前导链连续复制而滞后链不连续复制，就是复制半不连续性半不连续性。43/75前导链先由引物酶在起点处合成一段前导链先由引物酶在起点处合成一段RNARNA引物，随引物，随即即DNA pol IIIDNA pol III即在引物上加脱氧核苷酸。前导链合即在引物上加脱氧核苷酸。前导链合成与复制叉移动同时。成与复制叉移动同时。44/75滞后链合成是滞后链合成是分段进行分段进行，需要不停合成冈崎片段，需要不停合成冈崎片段RNARNA引物，然后由引物，然后由DNA pol IIIDNA pol III加入脱氧核苷酸。加入脱氧核苷酸。引发体主要在引发体主要在DNA滞后链上开始滞后链上开始，它连续地与引物酶结合并解离，从而在不，它连续地与引物酶结合并解离，从而在不一样部位引导引物酶催化合成一样部位引导引物酶催化合成RNA引物，在引物引物，在引物RNA3-OH末端接下去合成末端接下去合成DNA片段，这就是滞后链不连续合成开始。片段，这就是滞后链不连续合成开始。45/75因为因为DNA两条互补链方向相反，为使滞后链能与前导两条互补链方向相反，为使滞后链能与前导链被同一个链被同一个DNA pol III不对称二聚体合成，滞后链必不对称二聚体合成，滞后链必须绕成一个环状（须绕成一个环状（loop）。）。DNA聚合酶聚合酶III全酶是一个含有双活性位点非对称聚集体，全酶是一个含有双活性位点非对称聚集体，催化前导链和滞后链同时复制催化前导链和滞后链同时复制46/75 （1）去除引物，填补缺口（）去除引物，填补缺口（gap）：）：在复制过程中形成在复制过程中形成RNA引物，需由引物，需由DNA聚合酶聚合酶 I（5 3 外切酶活性）外切酶活性）来水解去除；来水解去除；RNA引物水解后遗留缺口，由引物水解后遗留缺口，由DNA聚合酶聚合酶 I（原核生物）或（原核生物）或DNA聚合聚合酶酶（真核生物）催化延长缺口处（真核生物）催化延长缺口处DNA，直到剩下最终一个磷酸酯键，直到剩下最终一个磷酸酯键缺口。缺口。（2）连接冈崎片段：）连接冈崎片段：在在DNA连接酶连接酶催化下，生成最终一催化下，生成最终一个磷酸酯键，将冈崎片段连接起来，个磷酸酯键，将冈崎片段连接起来，形成完整形成完整DNA长链。长链。47/75大肠杆菌环状大肠杆菌环状DNA，在，在oriC区区染色体是双向复制，形成两个背染色体是双向复制，形成两个背道而驰复制叉，当两个复制叉碰道而驰复制叉，当两个复制叉碰在一起时，复制终止。在一起时，复制终止。两个复制叉最终相遇在有多重拷两个复制叉最终相遇在有多重拷贝贝Ter序列终止区域。序列终止区域。Ter序列长序列长20bp，是终点利用蛋白（即，是终点利用蛋白（即Tus蛋白）结合位点。蛋白）结合位点。Tus蛋白结合在终止位点有利于蛋白结合在终止位点有利于阻挡移动复制叉。阻挡移动复制叉。Tus-Ter复合物，能够停顿先期复合物，能够停顿先期抵达复制叉推进，等候后期抵达抵达复制叉推进，等候后期抵达复制叉，使二者总能相遇，完成复制叉，使二者总能相遇，完成复制。复制。3.3.复制终止复制终止 48/75DNA复制过程复制过程动画：动画：DNA复制复制49/75复制起始复制起始（1）复制原点：复制原点：OriC序列，富含序列，富含AT（2）DNA解链酶解链酶解开双链解开双链DNA（3）SSB结合于结合于DNA单链单链（4）DNA旋转酶旋转酶引入负超螺旋，消除复制叉前进时带来扭引入负超螺旋，消除复制叉前进时带来扭曲张力曲张力（5）DNA引物酶引物酶(在引发体中在引发体中)合成合成RNA引物引物复制延伸：复制延伸：（6）DNA 聚合酶聚合酶在两条新生链上同时合成在两条新生链上同时合成 DNA（7）DNA 聚合酶聚合酶切除切除RNA引物，并补上引物，并补上 DNA（8）DNA ligase连接一个冈崎片段连接一个冈崎片段复制终止：复制终止：（9）形成）形成Tus-Ter复合物复合物DNA复制过程小结复制过程小结50/75（四）真核细胞（四）真核细胞DNADNA复制复制（自学）（自学）51/751970年有些人从致癌年有些人从致癌RNA病毒中发觉了依赖于病毒中发觉了依赖于RNADNA聚合酶（聚合酶（RNA-dependent DNA polymerase）或称）或称RNA指指导导DNA聚合酶（聚合酶（RNA-directed DNA polymerase），即逆），即逆转录酶（转录酶（reverse transcriptase，RT），能以），能以RNA为模板为模板合成合成DNA。这与通常转录过程中遗传信息从这与通常转录过程中遗传信息从DNA到到RNA过程相反，故过程相反，故称为逆转录称为逆转录（Reverse Transcription）。反转录酶发觉使）。反转录酶发觉使中心法则更完善。中心法则更完善。二、逆转录作用二、逆转录作用DNA转录转录RNA逆转录逆转录复制（病毒）复制（病毒）52/75（一）逆转录酶以病毒（一）逆转录酶以病毒RNARNA为模板合成为模板合成cDNAcDNA逆转录病毒细胞内逆转录现象：逆转录病毒细胞内逆转录现象：逆转录酶含有逆转录酶含有:依赖于依赖于RNADNA聚合酶聚合酶活性活性核糖核酸酶核糖核酸酶 H 活性（降解活性（降解RNA活活性）性）依赖于依赖于DNADNA聚合酶聚合酶活性活性逆转录酶作用是以逆转录酶作用是以dNTP为底为底物，以物，以RNA为模板，合成一为模板，合成一条与条与RNA模板互补模板互补DNA单链，单链，这条这条DNA单链叫做单链叫做互补互补DNA（complementary DNA，cDNA），它与），它与RNA模板形成模板形成RNA-DNA杂交体；杂交体；随即又在逆转录酶作用下，随即又在逆转录酶作用下，水解掉水解掉RNA链；链；再以再以cDNA为模板合成第二条为模板合成第二条DNA链。至此，完成由链。至此，完成由RNA指导指导DNA合成过程。合成过程。53/75携带逆转录酶病毒称为逆转录病毒或还原性病毒，它侵入宿主细胞后先以病毒携带逆转录酶病毒称为逆转录病毒或还原性病毒，它侵入宿主细胞后先以病毒RNA为模板靠逆转录酶催化合成为模板靠逆转录酶催化合成DNA，随即这种，随即这种DNA环化并整合（环化并整合（integration）到宿主）到宿主细胞染色体细胞染色体DNA中去，以前（原）病毒（中去，以前（原）病毒（provirus）形式在宿主细胞中一代代传递）形式在宿主细胞中一代代传递下去。下去。54/75逆转录病毒生活周期逆转录病毒生活周期动画：动画：逆转录逆转录55/75（二）逆转录病毒引发癌症或艾滋病（二）逆转录病毒引发癌症或艾滋病许多逆转录病毒进入细胞后，经过逆转录整合到宿主染色体许多逆转录病毒进入细胞后，经过逆转录整合到宿主染色体上并随之同时复制。一些逆转录病毒上带有致癌基因上并随之同时复制。一些逆转录病毒上带有致癌基因（oncogene），可引发宿主细胞分裂失控和生长异常，形），可引发宿主细胞分裂失控和生长异常，形成肿瘤或癌症。成肿瘤或癌症。56/75取得性免疫缺点综合症（取得性免疫缺点综合症（acquired immunodeficiency syndrome，AIDS），是），是由人类免疫缺点病毒（由人类免疫缺点病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染而引发以感染而引发以T淋巴细胞免疫功效缺点为主一个免疫缺点病。淋巴细胞免疫功效缺点为主一个免疫缺点病。HIV病毒是一个逆转录病毒，不使宿主细胞发生癌变，而是破坏人体免疫细胞，使病毒是一个逆转录病毒，不使宿主细胞发生癌变，而是破坏人体免疫细胞，使人体产生免疫缺点。人体产生免疫缺点。治疗：抑制逆转录酶活性是艾滋病治疗研究治疗：抑制逆转录酶活性是艾滋病治疗研究主要靶酶。主要靶酶。核苷类似物：竞争性抑制核苷类似物：竞争性抑制HIV-1逆转录酶活逆转录酶活性，并在逆转录中终止性，并在逆转录中终止cDNA链延伸，如链延伸，如3-叠氮脱氧胸苷（叠氮脱氧胸苷（AZT），在逆转录酶合成病），在逆转录酶合成病毒毒DNA时，时，ATZ掺入到病毒掺入到病毒DNA中，因为中，因为AZT无无3-OH，所以使病毒，所以使病毒DNA合成终止。合成终止。57/75逆转录研究意义逆转录研究意义 逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中重大发觉。中重大发觉。逆转录现象说明：最少在一些生物，逆转录现象说明：最少在一些生物，RNA一一样兼有遗传信息传代与表示功效。样兼有遗传信息传代与表示功效。对逆转录病毒研究，拓宽了对逆转录病毒研究，拓宽了20世纪初已注意世纪初已注意到病毒致癌理论。到病毒致癌理论。58/75三、三、DNA损伤、修复和突变损伤、修复和突变 DNA受受到到自自然然原原因因或或诱诱变变原原因因作作用用，结结构构会会出出现现不一样程度损伤或产生突变；不一样程度损伤或产生突变；生生物物体体中中存存在在有有特特殊殊修修复复系系统统，能能够够对对一一些些损损伤伤进行适当修复。进行适当修复。59/75 （1）自发原因：）自发原因：自自发发脱脱碱碱基基：因因为为N-糖糖苷苷键键自自发发断断裂裂，引引发发嘌嘌呤呤或或嘧嘧啶碱基脱落。每日可达近万个核苷酸残基。啶碱基脱落。每日可达近万个核苷酸残基。自自发发脱脱氨氨基基：胞胞嘧嘧啶啶自自发发脱脱氨氨基基可可生生成成尿尿嘧嘧啶啶，腺腺嘌嘌呤呤自自发发脱脱氨氨基基可可生生成成次次黄黄嘌嘌呤呤。每每日日可可达达几几十十到到几几百百个核苷酸残基。个核苷酸残基。复制错配复制错配：因为复制时碱基配对错误引发损伤，发生：因为复制时碱基配对错误引发损伤，发生频率较低。频率较低。引发引发DNA损伤原因损伤原因（一）（一）DNA损伤损伤60/75（2）物理原因：）物理原因：由由紫紫外外线线、电电离离辐辐射射、X射射线线等等引引发发DNA损损伤伤。其其中中，X射射线线和和电电离离辐辐射射经经常常引引发发DNA链链断断裂裂，而而紫紫外外线线经经常常引引发发嘧嘧啶啶二二聚聚体体形形成成，如如TT，TC，CC等等二二聚聚体体。这这些些嘧嘧啶啶二二聚聚体体因因为为形形成成了了共共价价键连接环丁烷结构，因而会引发复制障碍。键连接环丁烷结构，因而会引发复制障碍。UV胸腺嘧啶二聚体形成胸腺嘧啶二聚体形成61/75（3）化学原因：）化学原因：脱脱氨氨剂剂：如如亚亚硝硝酸酸与与亚亚硝硝酸酸盐盐，可可加加速速C脱氨基生成脱氨基生成U，A脱氨基生成脱氨基生成H。62/75烷烷基基化化剂剂：这这是是一一类类带带有有活活性性烷烷基基化化合合物物，可可提提供供甲甲基基或或其其它它烷烷基基，引引发发碱碱基基或或磷磷酸酸基基烷烷基基化，甚至可引发邻近碱基交联。化，甚至可引发邻近碱基交联。DNA加加合合剂剂：如如苯苯并并芘芘，在在体体内内代代谢谢后后生生成成四四羟苯并芘，与嘌呤共价结合引发损伤。羟苯并芘，与嘌呤共价结合引发损伤。碱碱基基类类似似物物：如如5-FU等等可可掺掺入入到到DNA分分子子中中引发损伤或突变。引发损伤或突变。断链剂：断链剂：如过氧化物，含巯基化合物等，可引如过氧化物，含巯基化合物等，可引发发DNA链断裂。链断裂。63/75（二）（二）DNA修复系统修复系统 是对已发生分子改变赔偿办法，使其尽可能回复是对已发生分子改变赔偿办法，使其尽可能回复为原有天然状态。为原有天然状态。光复活（光复活（photoreactivation）切除修复（切除修复（excision repair）重组修复（重组修复（recombination repair）SOS修复（修复（SOS repair）修复主要类型：修复主要类型：64/75能够修复因为能够修复因为UV照射而形成嘧啶二聚体。照射而形成嘧啶二聚体。修复过程由修复过程由光裂合酶（光裂合酶（photolyase）催化完成。催化完成。（1）光复活（）光复活（photoreactivation）其修复过程为：其修复过程为：1.光光裂裂合合酶酶识识别别嘧嘧啶啶二二聚聚体体并并与之结合形成复合物。与之结合形成复合物。2.在在400500nm可可见见光光照照射射下下，酶酶取取得得能能量量，将将嘧嘧啶啶二二聚体丁酰环打开。聚体丁酰环打开。3.光裂合酶从光裂合酶从DNA上解离。上解离。65/75这这是是一一个个广广泛泛存存在在修修复复机机制制，可可适适合合用用于于各各种种DNA损伤修复。损伤修复。切切除除修修复复机机制制基基本本过过程程是是将将受受损损DNA片片段段切切除除，然然后后再再以以对对侧侧链链为为模模板板，重重新新合合成成新新链链进进行修复。行修复。（2）切除修复（）切除修复（excision repair）66/75在原核生物中，与在原核生物中，与DNA切除修复相关蛋白质包含切除修复相关蛋白质包含UvrA、UvrB、UvrC，以及，以及DNA pol 和和DNA连接酶。连接酶。UvrA和和UvrB主要起识别和结合受损部位作用；而主要起识别和结合受损部位作用；而UvrC则主要则主要与受损片段切除相关。与受损片段切除相关。原核生物原核生物DNADNA切除修复机制切除修复机制67/75又称为复制后修复。又称为复制后修复。修复时，利用重组蛋白修复时，利用重组蛋白RecA核酸酶活性，将另核酸酶活性，将另一股完整亲链与损伤缺一股完整亲链与损伤缺口相互交换。口相互交换。在在E.coli中参加重组修复中参加重组修复酶：酶：RecA、RecB、RecC、DNA pol I 和连和连接酶。接酶。（3）重组修复（）重组修复（recombination repair）68/75 （4）SOS修复（修复（SOS Repair）SOS修复是指修复是指DNA受到严重损伤、细胞处于危急状态时所诱导受到严重损伤、细胞处于危急状态时所诱导一个一个DNA修复方式，修复结果只是能维持基因组完整性，提升修复方式，修复结果只是能维持基因组完整性，提升细胞生成率，但留下错误较多，故又称为细胞生成率，但留下错误较多，故又称为错误倾向修复错误倾向修复（error prone repair），使细胞有较高突变率。），使细胞有较高突变率。属于紧急修属于紧急修复。复。当当DNA两条链损伤邻近时，损伤不能被切除修复或重组修复，两条链损伤邻近时，损伤不能被切除修复或重组修复，这时在核酸内切酶、外切酶作用下造成损伤处这时在核酸内切酶、外切酶作用下造成损伤处DNA链空缺，再链空缺，再由损伤诱导产生一整套特殊由损伤诱导产生一整套特殊DNA聚合酶聚合酶SOS修复酶类，催化空修复酶类，催化空缺部位缺部位DNA合成，这时补上去核苷酸几乎是随机，但依然保持合成，这时补上去核苷酸几乎是随机，但依然保持了了DNA双链完整性，使细胞得以生存。但这种修复带给细胞很双链完整性，使细胞得以生存。但这种修复带给细胞很高突变率。高突变率。69/75DNA碱基序列发生可遗传永久性改变称为碱基序列发生可遗传永久性改变称为突变突变（mutation）。）。（三）（三）DNA突变突变 突变意义：突变意义：突变是进化、分化分子基础；突变是进化、分化分子基础；突变造成基因型改变；突变造成基因型改变；突变造成死亡；突变造成死亡；突变是一些疾病发病基础。突变是一些疾病发病基础。70/75DNA分子上单一碱基改变称分子上单一碱基改变称点突变点突变（point mutation）1.置换（置换（replacement）：）：（1）转换转换（transition）：发生在同型碱基之间，即嘌）：发生在同型碱基之间，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。（2）颠换颠换（transversion）：发生在异型碱基之间，即）：发生在异型碱基之间，即嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤。嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤。突变分子改变类型突变分子改变类型71/75镰刀形红细胞贫血病人镰刀形红细胞贫血病人Hb（HbS）亚基亚基N-val his leu thr pro val glu C 肽链肽链CAC GTG基因基因正常成人正常成人Hb（HbA）亚基亚基N-val his leu thr pro glu glu C 肽链肽链CTC GAG基因基因血红蛋白血红蛋白-亚基点突变亚基点突变72/752.插入（插入（insertion）：）：原来没有一个碱基或一段核苷酸链原来没有一个碱基或一段核苷酸链插入到插入到DNA大分子中间。大分子中间。3.缺失：缺失：一个碱基或一段核苷酸链从一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分子上消失。大分子上消失。移码突变移码突变是指三联体密码阅读方式改变，造成蛋白质氨是指三联体密码阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列次序发生改变。基酸排列次序发生改变。缺失或插入都可造成缺失或插入都可造成移码突变移码突变（frameshift mutation）。）。73/75谷谷 酪酪 蛋蛋 丝丝5 G C A G U A C A U G U C 丙丙 缬缬 组组 缬缬正常正常5 G A G U A C A U G U C 缺失缺失C缺失引发移码突变缺失引发移码突变74/75（）生