基因工程原理与技术培训课件.ppt

基因工程原理与技术基因工程原理与技术二、用于构建基因组文库的载体二、用于构建基因组文库的载体 1、噬菌体载体噬菌体载体 2基因工程原理与技术2、黏粒载体、黏粒载体 3基因工程原理与技术3、酵母人工染色体载体、酵母人工染色体载体 转化酵母4基因工程原理与技术3、基因组、基因组DNA片段与载体的连接片段与载体的连接(重组重组DNA分子的构建分子的构建)连接效率主要受连接效率主要受插入片段与载体的摩尔数比插入片段与载体的摩尔数比以及以及DNA片片段总浓度段总浓度的影响。因此，应通过连接预试验确定连接反应中的影响。因此，应通过连接预试验确定连接反应中载体臂和插入片段的用量。载体臂和插入片段的用量。1.0g噬菌体噬菌体载载体臂需要插入片段的用量体臂需要插入片段的用量 连接效率低的解决措施：连接效率低的解决措施：调整载体与插入片段的用量；调整载体与插入片段的用量；使用新鲜购置的连接酶；使用新鲜购置的连接酶；重新纯化基因组重新纯化基因组DNA片段；片段；重新提取和制备基因组重新提取和制备基因组DNA片段。片段。6基因工程原理与技术4、重组、重组DNA分子导入受体细胞分子导入受体细胞 对于对于噬菌体载体、黏粒载体，重组噬菌体载体、黏粒载体，重组DNA分子在体外包装分子在体外包装成噬菌体颗粒，以噬菌体感染的方式将重组的成噬菌体颗粒，以噬菌体感染的方式将重组的DNA分子导入到分子导入到大肠杆菌中。效率高，达大肠杆菌中。效率高，达1.8108pfu/g DNA。对对于于YAC载载体，采用体，采用电电激法激法导导入重入重组组DNA分子。分子。5、转转化体的化体的筛选筛选培养及基因培养及基因组组文文库库的的获获得得6、基因组文库的扩增、分装及保存基因组文库的扩增、分装及保存 基因组文库扩增的方法基因组文库扩增的方法：液体培养增殖法、影印滤膜培养：液体培养增殖法、影印滤膜培养法。法。基因组文库扩增的问题基因组文库扩增的问题：由于克隆的不均衡生长，从而导：由于克隆的不均衡生长，从而导致相应克隆的丢失，导致基因组文库的代表性变差。致相应克隆的丢失，导致基因组文库的代表性变差。小包装保存，小包装保存，4保存半年、保存半年、-80保存几年而滴度保持稳保存几年而滴度保持稳定。定。7基因工程原理与技术第二节第二节 cDNA 文库的构建文库的构建 cDNA文库是指某生物、组织或细胞所有文库是指某生物、组织或细胞所有cDNA的的克隆的的克隆群体。包括群体。包括组织特异性组织特异性cDNA文库、区域特异性文库、区域特异性cDNA文库。文库。一、用于构建一、用于构建cDNA文库的载体及载体片段制备文库的载体及载体片段制备 质粒载体、质粒载体、噬菌体噬菌体载载体，能体，能满满足足0.510kb cDNA克隆。克隆。二、二、mRNA的提取及其完整性的确定的提取及其完整性的确定1、mRNA的来源的来源(取材取材)目标目标mRNA为高丰度的材料为高丰度的材料2、mRNA的提取的提取 olig(dT)n-纤维素柱层析法纤维素柱层析法 olig(dT)n-磁珠分离法磁珠分离法8基因工程原理与技术3、mRNA完整性的确定完整性的确定 无细胞翻译系统检测法无细胞翻译系统检测法(麦胚抽提物麦胚抽提物、免网状细胞裂解物免网状细胞裂解物)蛙卵检测法蛙卵检测法 凝胶电泳检测法凝胶电泳检测法(根据根据28s rRNA与与18s rRNA的条带亮度判定的条带亮度判定)4、mRNA的富集的富集 特别是低丰度特别是低丰度mRNA。琼脂糖凝胶电泳法：回收率较低琼脂糖凝胶电泳法：回收率较低 变性蔗糖密度梯度离心法：回收率高变性蔗糖密度梯度离心法：回收率高 现在，一般是进行现在，一般是进行cDNA富集。富集。操作烦琐、时间长操作烦琐、时间长9基因工程原理与技术三、三、cDNA克隆片段的制备克隆片段的制备1、cDNA第一链的合成第一链的合成 AAAAAAAAAGppp引物引物(OligdT17)退火退火AAAAAAAAAGpppTTTTTTTTTT逆转录酶、逆转录酶、dNTPAAAAAAAAAGpppTTTTTTTTTT鸟类骨髓细胞白血病病毒鸟类骨髓细胞白血病病毒(AMV)逆转录酶逆转录酶：RNaseH活性强活性强 莫洛尼鼠白血病病毒莫洛尼鼠白血病病毒(M-MLV)逆转录酶逆转录酶：RNaseH活性较弱，活性较弱，有利于全长有利于全长cDNA合成。合成。Supscript逆转录酶逆转录酶：缺失：缺失RNaseH活性活性，反应温度较高，反应温度较高(45)10基因工程原理与技术2、cDNA第二链的合成第二链的合成 自身引导合成法自身引导合成法 AAAAAAAAAGpppTTTTTTTTTT煮沸煮沸NaOHTTTTTTTTTTTTTTTTTT形成发夹环形成发夹环DNA聚合酶聚合酶TTTTTTTTTAAAAAAATTTTTTTTTAAAAAAAAS1核酸酶核酸酶造成造成5端缺失端缺失11基因工程原理与技术置换合成法置换合成法 AAAAAAAAAGpppTTTTTTTTTTRNaseHAAAAAAAAAGpppTTTTTTTTTTPol IAAAAAAAAAGpppTTTTTTTTTTAAAAAAAAAGpppTTTTTTTTTTDNA连接酶连接酶优点优点：a、效率高；、效率高；b、不需纯化、不需纯化cDNA第一链；第一链；c、仅缺失、仅缺失5端几个核苷酸端几个核苷酸。12基因工程原理与技术PCR合成法合成法 优点优点：a、灵敏度高，、灵敏度高，对起始材料少、对起始材料少、低丰度低丰度mRNA特特别具有优势；别具有优势；b、不需纯化、不需纯化mRNA，避免了，避免了纯化过程中信息纯化过程中信息的丢失；的丢失；c、不会丢失、不会丢失5端信息端信息 13基因工程原理与技术3、双链、双链cDNA的末端处理及甲基化修饰的末端处理及甲基化修饰 加同聚物尾加同聚物尾 14基因工程原理与技术接上人工接头接上人工接头 首先补平首先补平cDNA末端及甲基化修饰，然后再接上人工接末端及甲基化修饰，然后再接上人工接头。头。连接子连接子(linker)15基因工程原理与技术衔接头衔接头(adaptor)16基因工程原理与技术四、四、cDNA克隆片段与载体片段的连接及检测克隆片段与载体片段的连接及检测1、平头末端连接法，无法回收插入片段、平头末端连接法，无法回收插入片段2、同聚物接尾法，接、同聚物接尾法，接dA/dT，通过局部变性和，通过局部变性和S1处理来回收处理来回收3、人工接头法、人工接头法五、重组五、重组cDNA分子导入受体细胞分子导入受体细胞 如构建质粒文库，要有高质量的大肠杆菌感受态细胞如构建质粒文库，要有高质量的大肠杆菌感受态细胞(109pfu/g DNA)六、转化体筛选培养及六、转化体筛选培养及cDNA文库生成文库生成七、七、cDNA文库的扩增、分装及保存文库的扩增、分装及保存 值得注意的是：在构建值得注意的是：在构建cDNA文库时，如果用人工接头法，文库时，如果用人工接头法，在酶切之前要用甲基化酶保护在酶切之前要用甲基化酶保护cDNA中的相应酶切位点。中的相应酶切位点。一般情况下无需构建原核细菌的一般情况下无需构建原核细菌的cDNA文库文库。17基因工程原理与技术第三节第三节 目的基因的获得目的基因的获得 获得目的基因的主要途径获得目的基因的主要途径：筛选基因组文库；筛选基因组文库；筛选筛选cDNA文库；文库；PCR扩增目的基因；扩增目的基因；人工合成法；人工合成法；差异克隆法；差异克隆法；图位克隆法；图位克隆法；转座子标签法；转座子标签法；T-DNA标签标签法法序列已知的基因序列已知的基因未知序列的基因未知序列的基因基因组计划基因组计划18基因工程原理与技术一、从文库中分离已知序列的基因一、从文库中分离已知序列的基因1、核酸杂交法、核酸杂交法(菌落菌落/噬菌斑原位杂交噬菌斑原位杂交)利用利用部分同源探部分同源探针针可以分离可以分离不同种不同种属的相同基因属的相同基因或或同同一基因家族的不同一基因家族的不同成员成员。如果只知基因编如果只知基因编码蛋白质的氨基酸码蛋白质的氨基酸序列，可以设计序列，可以设计简简并探针并探针予以筛选。予以筛选。19基因工程原理与技术2、PCR筛选法筛选法 特点特点：快速、简便。：快速、简便。程序程序：文库：文库 多孔培多孔培养板养板 一列或一行培养一列或一行培养物于一物于一PCR管中扩增管中扩增 凝凝胶电泳检测胶电泳检测 阳性列或阳性列或行分装培养行分装培养 第二轮第二轮PCR 阳性克隆阳性克隆3、免疫学筛选免疫学筛选 特点特点：筛选表达文库：筛选表达文库 程序程序：与核酸杂交筛选：与核酸杂交筛选相似。相似。见右图见右图 20基因工程原理与技术二、从文库中分离未知序列的基因二、从文库中分离未知序列的基因1、染色体步移法、染色体步移法(图位克隆法图位克隆法)markerTarget geneChromosomeFirst cloneTarget clone2、减法杂交克隆法（扣除杂交文库法）减法杂交克隆法（扣除杂交文库法）将一种组织的将一种组织的cDNA与生物素标记的另一种组织的与生物素标记的另一种组织的mRNA进行杂交进行杂交(过量过量)，然后通过链霉抗生物素亲和层析柱除去杂，然后通过链霉抗生物素亲和层析柱除去杂交体和多余的生物素标记交体和多余的生物素标记mRNA，获得一种组织特异的，获得一种组织特异的cDNA克隆。克隆。21基因工程原理与技术三、基因的人工合成三、基因的人工合成 化学合成法化学合成法与与酶促合成法酶促合成法相结合相结合 技术路线一技术路线一技术路线二技术路线二费时、费力、费用昂贵费时、费力、费用昂贵 22基因工程原理与技术