乙肝病毒DNA的实验室检测ppt课件.ppt

LOREM IPSUM DOLOR乙肝病毒乙肝病毒DNADNA的实验室检测的实验室检测袁立云袁立云1、荧光定量PCR技术2、乙肝病毒的感染3、HBV-DNA与临床荧光定量PCR技术荧荧光定量光定量PCR技技术术Polymerase chain reaction(PCR)，聚合酶链式反应，是一种DNA的快速扩增技术。PCR技术通过两个短的称为引物的DNA小片段和一种耐热酶（TaqDNA聚合酶）的作用，经过高温高温变变性、低温退火、适温延伸性、低温退火、适温延伸三个步骤在3个小时内反复循环25-30次，把特定的DNA片段扩增1000万倍。每个PCR体系含4种主要成分：含有待含有待扩扩增增序列的序列的DNADNA模板、引物、模板、引物、TaqDNATaqDNA聚合聚合酶酶、脱氧核糖核酸三磷酸（脱氧核糖核酸三磷酸（dNTPdNTP）实时荧光定量PCR技术，是指在反应体系中加入荧荧光光标记标记，利用荧光信号积累实时检测整个PCR过程，通过标标准曲准曲线线对PCR终产物的分析，最终实现对未知的起始模版进行定量分析的一种技术，是迄今对已知基因序列的核酸测定中最灵敏的方法。荧荧光定量光定量PCR技技术术PCR 反应过程5533d.NTPsTaq 酶Primers5353535353535353反应组分反应组分变变 性性535353535353延延 伸伸53535353353TaqTaq55重重 复复退退 火火5353535355335353循环循环24个拷贝个拷贝循环循环38个拷个拷贝贝53535353535353535353533553535353荧光定量PCR原理插入染料法插入染料法 SYBR Green I杂交探针法杂交探针法(最常最常用用)TaqManTaqMan探针5533d.NTPsTaq酶Primers5353535353535353反应体系变 性535353535353Taql53RQProbe53RQ535353RQ退 火531.链取代Taq3QR5533QTaqR52.水 解3.聚 合53QTaqR354.检测荧光533QTaqR5l乙肝病毒的感染乙肝病毒的感染 （一）（一）乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒结结构及构及特点特点HBsAg：是HBV感染的主要标志HBsAb：保护性抗体HBcAgHBcAg：仅仅存于感染的肝存于感染的肝细细胞胞核内，核内，一般不存在于血循一般不存在于血循环环中中HBcAb:非保护性抗体，HBcAb-IgM提示HBV处于复制状态HBeAg：HBV复制及强感染性的指标HBeAb：有一定的保护作用，预后良好乙肝病毒的感染（二）（二）HBV-DNAHBV-DNA与与“两对半两对半”1.“两对半”：机体的免疫反应状态；2.“携带者”、“大三阳”、“小三阳”等免疫学指标不能不能 反反应应体内病毒复制水体内病毒复制水平与感染程度平与感染程度。FQ-PCRFQ-PCR：检测的是：检测的是HBVHBV本身的遗传物质本身的遗传物质DNADNA，是，是 病毒存在和复制的最可靠、最直病毒存在和复制的最可靠、最直接的指标。接的指标。HBsAg()HBV-DNA()HBeAg()HBV-DNA()3.血清学指血清学指标标()不能排除不能排除HBVHBV感染感染。乙肝病毒的感染5.HBeAg阳性标本HBV DNA检出率90左右 HBeAgHBeAg与与HBV DNAHBV DNA有着良好的相有着良好的相关性关性4.也可能出现HBsAg()，HBV-DNA()。乙肝病毒的感染HBV DNAHBV DNA贯穿感染者的穿感染者的终生，是生，是评价病毒复制的金价病毒复制的金标准准ALT正常正常增高或者波增高或者波动正常正常增高或者波增高或者波动免疫耐受期免疫耐受期免疫清除期免疫清除期非活动或非活动或低（非）低（非）复制期复制期再活动期再活动期肝组织学肝组织学无明显异常无明显异常,或轻度炎症或轻度炎症纤维化纤维化中度或严重炎症、中度或严重炎症、纤维化快速进展纤维化快速进展无炎症或仅无炎症或仅有轻度炎症有轻度炎症中度或严重中度或严重炎症、肝纤炎症、肝纤维化维化临床诊断临床诊断慢性慢性HBV携携带者带者HBeAg阳性慢性乙阳性慢性乙型肝炎型肝炎乙型肝炎肝硬化乙型肝炎肝硬化非活动性非活动性HBsAg携带携带者者HBeAg阴性阴性慢性乙型肝慢性乙型肝炎炎乙型肝炎肝乙型肝炎肝硬化硬化乙肝病毒的感染慢性慢性HBV感染分期及相关实验室感染分期及相关实验室检测指标检测指标 鲁凤民，庄辉，乙型肝炎实验室诊断研究进展 2009 HBV-DNA与临床HBV DNA检测的临床意义HBV DNAHBV DNA是是HBVHBV存在最直接的依据存在最直接的依据HBV DNAHBV DNA是是HBVHBV复制的复制的标标志志HBV DNAHBV DNA是患者具有是患者具有传传染性的染性的标标志志HBV DNAHBV DNA对对乙肝两乙肝两对对半起半起补补充作用充作用HBV DNAHBV DNA是目前判断乙肝抗病毒是目前判断乙肝抗病毒药药物物疗疗效效最敏感的指最敏感的指标标HBV DNAHBV DNA可可检测检测出出隐隐匿性慢性乙型肝炎匿性慢性乙型肝炎PCRPCR检测检测“窗口期窗口期”核酸核酸检测缩检测缩短的短的“窗口期窗口期”的天数的天数HBVHBV56566-156-15HCVHCV707041-6041-60HIVHIV222210-1510-15有利于献血员窗口期病毒核酸的筛查和早期诊断有利于献血员窗口期病毒核酸的筛查和早期诊断提供直接证据缩短提供直接证据缩短“窗口期窗口期”HBV DNA检测的临床意义 调查表明并不是所有“大三阳”的病人都处于HBV复制期，具有传染性；也不是所有“小三阳”的病人HBV都无复制。因此，要准确知道HBV是否处于复制状态，最准确的方法还是通过检测HBV DNA来决定。HBV DNA检测的临床意义HBV DNA检测的临床意义HBsAgHBsAg和和HBeAgHBeAg均阳性而均阳性而HBV DNAHBV DNA阴性？阴性？干扰素或拉米夫定等治疗后病毒复制受抑制。PCR所用引物相应的DNA序列发生突变，此引物与突变DNA不能配对结合。病毒DNA整合于宿主肝细胞染色体而血中游离HBV DNA很少或缺乏。目前尚无一种能迅速、直接杀死清除乙肝病毒的药物，最好的抗病毒药物疗效也仅能达到50左右。目前国际医学界公认的治疗慢性乙肝有确切疗效的抗病毒药物主要有两大类：干干扰扰素素：重组人-1b干扰素、-2a、-2b干扰素等。核苷核苷类类似物似物：拉米夫定、阿德福韦。乙肝的治疗主主要要包包括括主主要要包包括括 抗抗病病毒毒乙肝的治疗