实验三-植物组织RNA的提取与分析.ppt

1（1）通过本实验，了解）通过本实验，了解RNA的结构和特点。的结构和特点。（2）学会使用）学会使用Trizol法提取植物总法提取植物总RNA。（3）学习和掌握总）学习和掌握总RNA的检测实验技术和实验的检测实验技术和实验原理。原理。一、实验目的一、实验目的二、实验原理二、实验原理 RNARNA的的提提取取是是进进行行分分子子克克隆隆和和基基因因表表达达分分析析等等研研究究的的基基础础。但但RNARNA很很容容易易被被内内源源及及外外源源的的RNaseRNase降降解解，所所以以要要得得到到未未被被降降解解的的、不不含含DNADNA与与其其它它杂杂质质的的RNARNA是是进进行行分分子子生生物物学学研究的前提。研究的前提。目目前前较较为为成成熟熟的的分分离离RNARNA的的方方法法有有许许多多，用用于于植植物物细细胞胞总总RNARNA的的提提取取主主要要有有苯苯酚酚法法、异异硫硫氰氰酸酸胍胍法法、氯氯化化锂锂沉沉淀淀法法、SDS/SDS/酚酚抽抽提提法法，或或应应用用商商品品化化的的TrizolTrizol试试剂剂和和QiagenQiagen等等各各类类试试剂剂盒盒进进行行提提取取。但但由由于于植植物物细细胞胞具具有有坚坚硬硬的的细细胞胞壁壁，内内含含较较多多的的多多糖糖、脂脂质质、多多酚酚等等次次生生代代谢谢物物，同同种种植植物物的的不不同同组组织织和和不不同同植植物物的的同同种种组组织织材材料料，其其RNARNA的的提提取取方方法法也也会会有有很很大大差异。适宜的差异。适宜的RNARNA提取材料处理方法也不尽相同。提取材料处理方法也不尽相同。二、实验原理二、实验原理 TrizolTrizol试试剂剂是是由由苯苯酚酚和和硫硫氰氰酸酸胍胍配配制制而而成成的的单单相相的的快快速速抽抽提提总总RNARNA的的试试剂剂，在在匀匀浆浆和和裂裂解解过过程程中中，能能在在破破碎碎细细胞胞、降降解解细细胞胞其其它它成成分分的的同同时时保保持持RNARNA的的完完整整性性。在在氯氯仿仿抽抽提提、离离心心分分离离后后，RNARNA处处于于水水相相中中，将将水水相相转转管管后后用用异异丙丙醇醇沉沉淀淀RNARNA。用用这这种种方方法法得得到到的的总总RNARNA中中蛋蛋白白质质和和DNADNA污污染染很很少少，可可以以用用来来做做NorthernNorthern，RT-PCRRT-PCR，分分离离mRNAmRNA，体体外外翻翻译译和和分分子克隆等。子克隆等。6四、实验步骤四、实验步骤1、RNA的提取的提取（5 5）44，12000r/min12000r/min离心离心10min10min。（6 6）吸吸取取上上清清液液置置于于一一个个新新的的1.5mL1.5mL的的无无RNARNA酶酶的的离离心心管管中中，加入加入600uL600uL异丙醇异丙醇，-20-20放置放置30min30min。（7 7）44，12000r/min12000r/min离心离心10min10min。弃去上清液。弃去上清液。（8 8）向向离离心心管管中中加加入入1mL1mL70%70%乙乙醇醇，漂漂洗洗沉沉淀淀物物。44，5000r/min5000r/min离心离心3min3min。弃去上清液。（。弃去上清液。（此步可省略此步可省略）（9 9）待待沉沉淀淀物物自自然然干干燥燥后后，加加入入20uL20uLDEPCDEPC处处理理的的蒸蒸馏馏水水，充分溶解后，即为充分溶解后，即为RNARNA溶液。溶液。7四、实验步骤四、实验步骤2、RNA电泳检测电泳检测（1 1）1%1%琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶：称称取取0.0.2 2g g琼琼脂脂糖糖，加加入入2 20mL 0mL 1TAE1TAE缓缓冲冲液液，加加入入20uL20uL甲甲醛醛溶溶液液（可可省省略略），在在微微波波炉炉中中加加热热，反反复复加加热热、振振荡荡2-32-3次次，使使琼琼脂脂糖糖充充分分融融化化。待待凝凝胶胶冷冷却却至至6060左左右右，倒倒入入插插入入梳梳子子的的凝凝胶胶板板中中（避避免免产产生生气气泡泡），让凝胶自然凝固。让凝胶自然凝固。（2 2）待待凝凝胶胶凝凝固固后后，小小心心拔拔出出梳梳子子，避避免免前前后后左左右右摇摇晃晃，以以免免破破坏坏胶胶面面及及加加样样孔孔，小小心心将将凝凝胶胶和和胶胶床床放放入入电电泳泳槽槽中中，加样孔靠近阴极的一端。加样孔靠近阴极的一端。8四、实验步骤四、实验步骤2、RNA电泳检测电泳检测（3 3）上上样样电电泳泳：将将5 5LLR RNANA样样品品溶溶液液和和5L5L上上样样缓缓冲冲液液混混匀匀后后，上上样样，100V100V稳稳压压电电泳泳检检查查，根根据据指指示示剂剂迁迁移移的的位位置置，判判断是否中止电泳。切断电源后，再取出凝胶。断是否中止电泳。切断电源后，再取出凝胶。（4 4）照照胶胶、拍拍照照：将将凝凝胶胶泡泡在在EBEB溶溶液液（注注意意：EBEB溶溶液液为为剧剧毒毒物物，需需带带上上一一次次性性手手套套拿拿取取凝凝胶胶）中中5 5minmin左左右右，进进入入暗暗室室，使用凝胶成像系统照胶并拍照。使用凝胶成像系统照胶并拍照。9五、实验结果与分析五、实验结果与分析 1 2 3 4 5 6 18S28S5S