HLA配型与脐血移植.-2000.10.20.ppt

HLAHLA配型与脐血移植配型与脐血移植移植供受体移植供受体HLA配型的研究进展配型的研究进展 军事医学科学院附属医院 孔繁华 MHC（主要组织相容性复合体）TCR（T细胞受体）Ig（免疫球蛋白）背背 景景免疫遗传学包括三大部分免疫遗传学包括三大部分 其中其中MHC是国际免疫学研究中最活跃是国际免疫学研究中最活跃 的部分的部分 1958年法国医生J.Dausset 第一个发现了人类白细胞抗原（HLA）。40年来关于MHC（主要组织相容性复合体）的研究非常活跃，多次召开国际会议，每次都有新的进展。2001年又有一次国际盛会将在美国西雅图召开第十三届国际组织相容性专题讨论会。MHC与移植是每次会议讨论的重点。与移植是每次会议讨论的重点。这位开创这位开创HLA理论的理论的J.DaussetJ.Dausset医医生，于生，于1980年获得了诺贝尔奖。年获得了诺贝尔奖。通过大样本的临床病例分析，通过大样本的临床病例分析，最终证明，最终证明，HLAHLA配型是移植存活，配型是移植存活，尤其是长期活存的关键因素。尤其是长期活存的关键因素。一、脐血移植中一、脐血移植中GVHD发发生与生与HLA相关性的研究相关性的研究 以以上上资资料料表表明明，尽尽管管脐脐血血造造血血干干细细胞胞可可能能因因为为细细胞胞发发育育阶阶段段较较早早，移移植植后后GVHD的的发发生生程程度度比比较较轻轻，但但HLA配配型型仍仍是是脐脐血血移移植植成成败的关键因素。败的关键因素。GVHD的高危因素：的高危因素：供受体供受体HLA匹配程度匹配程度 脐血供体来源（亲属或非亲属）脐血供体来源（亲属或非亲属）HLA完全匹配的亲缘关系移植，急性完全匹配的亲缘关系移植，急性GVHD的发生率为的发生率为9%，HLA不匹配的亲属脐血移植，不匹配的亲属脐血移植，急性急性GVHD发生率为发生率为50%。二、二、HLA 配型技术配型技术 血清血清-细胞学配型细胞学配型 60年代年代 基因配型基因配型 80年代年代 氨基酸残基配型氨基酸残基配型 90年代年代 三维结构配型三维结构配型 近几年近几年 （一）血清学分型技术（一）血清学分型技术 补体依赖性微量淋巴细胞毒试验补体依赖性微量淋巴细胞毒试验 1964年第一届国际年第一届国际MHC研讨会，研讨会，Terasaki创建创建（二）基因分型技术（二）基因分型技术早期的方法：限制性片段长度多态性（早期的方法：限制性片段长度多态性（RFLP），），1980年年Botstein等研究，现已被等研究，现已被PCR/RFLP方法取代。方法取代。2序列特异引物（序列特异引物（SSP：sequence specific primers），），1990年年Fugger等用于等用于HLA-DP分型分型3单链构象多态性（单链构象多态性（SSCP：single strand conformation polymorphism）4序列特异性寡核苷酸探针（序列特异性寡核苷酸探针（SSOP：sequence specific oligonucleotide probes）5PCR直接序列测定（直接序列测定（PCR/sequencing）（三）（三）HLA三维结构差异与三维结构差异与 GVHD相关性研究相关性研究 供受体供受体HLA-A、B、DR和和DQ配型一致时，移植后配型一致时，移植后仍有仍有50%的病人发生不同程度的的病人发生不同程度的GVHD。基因型别不同时，并不发生重症基因型别不同时，并不发生重症GVHD。我们根据我们根据“结构与功能相统一结构与功能相统一”的原则，设想供的原则，设想供受受体体HLA分子三维构象的差异可能是引发分子三维构象的差异可能是引发GVHD的更直的更直接原因。接原因。研究研究对象对象 HLA-I类分型类分型HLA-II类分型类分型 测序测序 HLA三维结构三维结构 GVHDA B DRB1 DQB1患者患者 0401 差差2个个aa供体供体 0404 三维结构三维结构差别不大差别不大II度度病例一病例一HLA-DRB1*0401HLA-DRB1*0401与与*0404104041抗原结合抗原结合区空间结构的比较区空间结构的比较HLA-DRB1*0401 a1 HLA-DRB1*0404 a1图图1病例二病例二研究研究对象对象 HLA-I类分型类分型HLA-II类分型类分型 测序测序 HLA三维结构三维结构GVHDA B DRB1 DQB1患者患者 0401 供体供体 0408三维结构三维结构差别大差别大IV度度差差1个个氨基酸氨基酸HLA-DRB1*0401HLA-DRB1*0401与与*0408104081抗原结合抗原结合区区空间结构比较空间结构比较HLA-DRB1*0401 a1 HLA-DRB1*0408 a1图图2病例三病例三研究研究对象对象 HLA-I类分型类分型测序测序 HLA三维结构三维结构GVHDA B患者患者 2，_ 52，38 .供体供体.，68 .，.A*02011A*6801IV度度DR DQ三维结构三维结构差别大差别大HLA-A*02011测序图HLA-A*6801的测序图的测序图 抗原结合区的结构存在明显不同抗原结合区的结构存在明显不同 抗 原 结 合 区HLA A*02011结构HLA A*6801结构图图3病例四病例四研究研究对象对象 HLA-I类分型类分型测测 序序 HLA三维结构三维结构GVHDA B患者患者 1，2 13，37 .供体供体 .，33 .，.A*02011A*3301II度度DR DQ移植后患者的移植后患者的A2 A33三维结构三维结构差别不大差别不大HLA-A*02011/33011HLA-A*02011/33011非抗原结合区非抗原结合区 三维结构比较三维结构比较HLA-A*02011 a1 HLA-A*3301 a1图图4病例五病例五研究研究对象对象 HLA-I类分型类分型测序测序 HLA三维结构三维结构GVHDA B患者患者 11,33 58,60 .供体供体 .,.,13 .B*40011B*1301IV度度DR DQ移植后患者的B60 B13三维结构三维结构差别大差别大HLA-B*1301/400111HLA-B*1301/400111抗原结合区抗原结合区三维结构比较三维结构比较HLA-B*1301 a1 HLA-B*40011 a1图图5病例六病例六研究研究对象对象 HLA-I类分型类分型测序测序 HLA三维结构三维结构 GVHDA B患者患者 2,11 7,62 1,15 7 供体供体 .,.,.,.6 0301106011IV度度DR DQ三维结构三维结构差别大差别大HLA-DQB1*03011的的1功能功能 HLA-DQB1*06011的的1功能区功能区HLA-DQB1*03011/060111HLA-DQB1*03011/060111非抗原结合区非抗原结合区三维结构比较三维结构比较图图6（四）氨基酸残基配型（四）氨基酸残基配型 策略的提出与应用策略的提出与应用 免疫反应的核心是免疫反应的核心是“T细胞受体细胞受体（TCR）+主要组织相容性复合体主要组织相容性复合体（MHC）+8 11个个氨基酸肽片段氨基酸肽片段”组成的组成的三原复合体三原复合体。1992年年Takimoto等提出了等提出了HLA残基配型。免疫学基础研究证明，残基配型。免疫学基础研究证明，受者细胞真正识别的抗原决定簇是受者细胞真正识别的抗原决定簇是811个氨基酸的肽片段。将个氨基酸的肽片段。将I类抗类抗原中关键残基归为原中关键残基归为10个组。个组。10 Residue modelQ114 A10 A19 A25 A26 A31 A32 A33 A36 A43 A66 A74R114 A1 A3 A11 A29 A36K127 A2 A9 A23 A24 A28 A68 A69T69-S77 B8 B14 B16 B39 B64 B65 B78T41 B12 B13 B21 B40 B41 B44 B45 B47 B49 B50 B60 B61F67 B5 B8 B35 B51 B53 B57 B78S70 B17 B57 B58 B63N80 A11B7B8B14B15B16B18B22B35B39B40B41B42B45B46B48 B50B54B55B56B60B61B64B65B67B70B71B72B75B76B78B79R83 A9 A23 A24 A25 A32 B5 B12 B13 B17 B21 B27 B37 B38 B44 B47 B49 B51 B52 B53 B57 B58 B59A71-D74 B5 B7 B22 B27 B42 B46 B54血清型与氨基酸残基配型的对应关系血清型与氨基酸残基配型的对应关系 1996年年Takimoto等研究了等研究了HLA分子结构分子结构中朝向中朝向T细胞受体方向的残基，发现细胞受体方向的残基，发现62，65，163位三个残基朝向位三个残基朝向TCR。回顾性研究。回顾性研究8795年年44891份病例，发现：份病例，发现：三残基模型与血清型的对应关系三残基模型与血清型的对应关系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三残基匹配存活率三残基匹配存活率 A、B、DR不匹配者不匹配者三残基不匹配存活率三残基不匹配存活率 A、B、DR位点匹配者位点匹配者 1996年年Terasaki等提出了等提出了HLA氨基酸残基配型标准氨基酸残基配型标准（HLA-amino acid residue matehing 简称简称Res M 标准）。将标准）。将HLA-I类分成类分成10个组、个组、类分成类分成7个组。实践证明采用此标个组。实践证明采用此标准可大幅度提高移植者相配机率，准可大幅度提高移植者相配机率，显著降低移植后的致敏性和免疫反显著降低移植后的致敏性和免疫反应性。应性。HLA-I类抗原氨基酸残基配型标准类抗原氨基酸残基配型标准Res M分组分组 抗原特异性抗原特异性A1(R114)A1,A3,A29,A36A2(K127)A2,A23,A24,A68,A69A10/A19(Q114)A25,A26,A34,A66,A19(A31,A32,A33,A74),A43B5/B8(F67)B5(B51),B35,B53,B78,B8,B57B7(A71-D74)B7,B22(B54,B55,B56),B27,B42,B46,B67B8(T69-S77)B8,B14(B64,B65),B16(B39),B78B12(T41)B12(B44,B45),B13,B21(B49,B50),B40(B60,B61),B41,B47B17/63(S70)B17(B57,B58),B63,B59Bw4(R83)A9(A23,A24),A25,A32,B5(B51,B52),B12,B13,B17(B57,B58),B21(B49),B27,B37,B38,B47,B53,B59,B63,B77Bw6(N80)A11,B7,B8,B18,B14(B64,B65),B15(B62,B75,B76,B78),B16(B39),B22(B54,B55,B56),B35,B40(B60,B61,B48,B4005),B41,B42,B45,B46,B50,B67,B70,B71,B72HLA-II类类DR抗原氨基酸残基配型标准抗原氨基酸残基配型标准 Res M分组分组 抗原特异性抗原特异性DQ1 DR1(DR10),DR2(DR15,DR16),DR6(DR13,DR14)DQ2 DR3(DR17,DR18),DR7DQ3 DR4,DR5(DR11,DR12),DR9,DR14DQ4 DR8,DR18DRB3 DR3(DR17,DR18),DR5(DR11,DR12),DR6(DR13,DR14)DRB4 DR4,DR7,DR9DRB5 DR1(DR10),DR2(DR15,DR16)三、三、HLA准确配型应注意的几个技术环节准确配型应注意的几个技术环节 造造血血干干细细胞胞移移植植中中，不不断断遇遇到到的的麻麻烦烦是是不不同同实实验验室室对对同同一一个个或或几几个个被被检检测测样样品品HLA分分型型结结果果不不一一致致的的问问题题，困困绕绕着着临临床床移移植植工工作作的的顺顺利利进进行行，引引起起医医生生和和病病人人家家属属极极大大关关注注，这这说说明明HLA配配型型并并非非易易事事。要想得到准确结果，应注意以下几个技术问题：要想得到准确结果，应注意以下几个技术问题：1、抗血清和基因分型试剂盒的质量抗血清和基因分型试剂盒的质量 2、兔补体和引物的质量兔补体和引物的质量 3、基因重组和纯合子基因重组和纯合子 4、抗原交叉反应和阶梯分型抗原交叉反应和阶梯分型 5、基因图的构建基因图的构建一、血清型分型一、血清型分型疑难抗原分析（疑难抗原分析（1）Tray position 7A 7D 10F 11B 11C 11DReaction 8 8 8 8 8 4 SpecificityB B B B B B 13131557132737474040270861781011.血清学抗原指定：血清学抗原指定：B13，B40或纯合子或纯合子B13。2.HLA：B7/40增补板，分析有困难。增补板，分析有困难。3.本室合成的本室合成的B40引物：未见阳性带（经过两引物：未见阳性带（经过两次证实），确定次证实），确定B13纯合子。纯合子。M +-疑难抗原分析（疑难抗原分析（2）Tray position 5F 6A 7A 7D 10F 10E 11B 11C 11DReaction 8 1 8 8 8 1 8 8 8 Specificity B B B B B B B B B727088101+/-614438-/+27131315571327374727?4040270861781011.血清学抗原指定：血清学抗原指定：B13，B61（40）。）。2.HLA-B27抗原（抗原（）。）。3.HLA B7/40 Supplement Tray：B27有反应。有反应。4.本室合成的本室合成的B40引物：未见阳性带。引物：未见阳性带。5.HLA-I类基因分型：类基因分型：B13，B27。M -疑难抗原分析（疑难抗原分析（3）Tray position 7C 7D 7F 9A 10C 10B 11A 12E 12D 12CReaction 8 8 8 6 8 8 4 8 8 8 SpecificityB B B B B B B B B B15571315576276+/-72215670751508354448-/+721851355362467515081501151151023553751508151146150815114670356275763877535715081511判断判断：B62，B75，B1508，B1511，B70，B46（B62，B75），），血清抗原指定困难。血清抗原指定困难。基因分型基因分型：B15011，B1508。母母a bc dA2B13A24B62（15）A31B35A11B60（40）a d dA2B13A11B60（40）A31B51（5）A11B60（40）b dA24B62(15)A11B60（40）患者患者 供供1 供供2 患者家系图患者家系图 父父父父 母母a bc da cb c c cA11A11B60B60A31A31B51B51(5)A24B35A2B1508B35A24B51A24B35A24B35A32B44A24B35A2B1508A24B61(40)A24 患者患者 供供1 供供2 供供3 供供4DRB1*11 09DQB1*07 09 DRB1*12 09DQB1*07 09 DRB1*08 09DQB1*06 09 DRB1*11 09DQB1*9 09 患者家系图患者家系图二、二、HLA基因分型基因分型带有非特异性条带的电泳图结果带有非特异性条带的电泳图结果