微生物鉴定技术在药品检验及监管中的应用(简版)-徐-伟-东课件.ppt

微生物鉴定技术平台的建设微生物鉴定技术平台的建设二二样品微生物的鉴定及同源性分析样品微生物的鉴定及同源性分析三三微生物实验室能力建设微生物实验室能力建设微生物新技术的应用微生物新技术的应用四四微生物污染监管方式的思考微生物污染监管方式的思考五五背景介绍背景介绍一一一、背景介绍一、背景介绍v在在1993-1998年间，美国年间，美国FDA报告的由微生物污报告的由微生物污染引起的召回案件达到染引起的召回案件达到1370件，占所有产品召回案件，占所有产品召回案件的件的36%v我国药品微生物污染的调查数据较少，但微生物污染我国药品微生物污染的调查数据较少，但微生物污染仍居首位，近期披露的黑龙江完达山刺五加注射液受仍居首位，近期披露的黑龙江完达山刺五加注射液受微生物污染的问题，已经造成了十分严重后果和无法微生物污染的问题，已经造成了十分严重后果和无法挽回的损失。挽回的损失。v药品安全管理仍存在监管漏洞，造成定性难、溯源难、药品安全管理仍存在监管漏洞，造成定性难、溯源难、应变慢等问题，以及新的致病微生物或变异体的出现，应变慢等问题，以及新的致病微生物或变异体的出现，导致药品受到微生物污染导致药品受到微生物污染v我国各大城市不断承办国际大型体育赛事和国际会议我国各大城市不断承办国际大型体育赛事和国际会议尤其是尤其是2010年在我国召开的上海世界博览会，也进年在我国召开的上海世界博览会，也进一步增强了对药品的监督管理水平的要求。一步增强了对药品的监督管理水平的要求。对微生物分类水平较低，只能鉴定对微生物分类水平较低，只能鉴定到到“属属”，鉴定微生物种类有限，鉴定微生物种类有限传统微生物鉴定方法的局限传统微生物鉴定方法的局限分子方法分子方法v分子生物学技术研究的是微分子生物学技术研究的是微生物生物DNA序列信息，常用序列信息，常用于细菌分类的于细菌分类的16SrDNA也有也有1500个碱基，每个碱个碱基，每个碱基位置由基位置由ATGC四种核苷酸四种核苷酸中的一种组成，多样性可达中的一种组成，多样性可达种可能（约）种可能（约）10900。v新版的新版的伯杰氏系统细菌学伯杰氏系统细菌学手册手册微生物微生物DNA变异信变异信息为主息为主传统方法传统方法v人类已知的土壤微生物已达人类已知的土壤微生物已达到到10万种万种v现在常用的微生物鉴定用生现在常用的微生物鉴定用生化反应只有化反应只有20多种，实际多种，实际经过研究形成一致标准的、经过研究形成一致标准的、有意义的生化鉴定结果仅有意义的生化鉴定结果仅2000多种。多种。v微生物生化鉴定金标准的微生物生化鉴定金标准的API鉴定系统鉴定系统仅能鉴定仅能鉴定550种细菌种细菌v通过碳源利用进行微生物鉴通过碳源利用进行微生物鉴定的定的Biolog系统也仅能鉴系统也仅能鉴定定2000种微生物种微生物 微生物变异能力强，生化反应准确微生物变异能力强，生化反应准确度不高，错检漏检现象普遍度不高，错检漏检现象普遍传统微生物鉴定方法的局限传统微生物鉴定方法的局限v在进化过程中生物在进化过程中生物DNA分子会形成大量分子会形成大量DNA多态性多态性区域和非编码区域和非编码DNA序列。序列。不会造成生物种属归类争议不会造成生物种属归类争议也不会造成任何形态上或酶系统表达的改变也不会造成任何形态上或酶系统表达的改变通过生化鉴定方法无法对这类变化进行有效的分析通过生化鉴定方法无法对这类变化进行有效的分析DNA位点变化却包含大量重要的微生物所独有的进位点变化却包含大量重要的微生物所独有的进化信息，可以与其他来源的同种微生物相区别，也是化信息，可以与其他来源的同种微生物相区别，也是微生物种内差异的来源微生物种内差异的来源v如常用于真菌种类鉴定的如常用于真菌种类鉴定的ITS基因基因vITS片段能保持相对稳定的变异频率片段能保持相对稳定的变异频率v亲缘关系非常接近的亲缘关系非常接近的2个种都能在个种都能在ITS序列上表现出序列上表现出差异，显示最近的进化特征差异，显示最近的进化特征微生物鉴定技术平台的建设微生物鉴定技术平台的建设二二样品微生物的鉴定及同源性分析样品微生物的鉴定及同源性分析三三微生物实验室能力建设微生物实验室能力建设微生物新技术的应用微生物新技术的应用四四微生物污染监管方式的思考微生物污染监管方式的思考五五背景介绍背景介绍一一2.1 技术手段技术手段2.2 方法比较方法比较2.1 技术手段技术手段2.2 方法比较方法比较革兰氏染色镜鉴革兰氏染色镜鉴按照标准进行按照标准进行传统的生化反应鉴定传统的生化反应鉴定API试剂条试剂条菌鉴定国际金标准菌鉴定国际金标准半自动细菌鉴定仪半自动细菌鉴定仪（ATBExpression）全自动细菌鉴定仪全自动细菌鉴定仪（VITEK2）微生物鉴定手段微生物鉴定手段 Mini VIDAS筛选系统筛选系统免疫凝集免疫凝集/免疫沉淀实验免疫沉淀实验微生物检测手段微生物检测手段荧光定量荧光定量PCR(BAX)色谱、光谱分析技术色谱、光谱分析技术分子生物分子生物学技术学技术 传统筛选方法传统筛选方法2.1技术手段技术手段GenBankGenBankPCR基因分型基因分型分子杂交分子杂交阳性菌分子水平上的鉴定阳性菌分子水平上的鉴定12341.形态学鉴定形态学鉴定3.核糖体水平上核糖体水平上的鉴定的鉴定APIVITEK16S rDNA序列分析序列分析分子杂交（分子杂交（Dupont RiboPrinter）2.生化鉴定生化鉴定傅里叶红外光谱傅里叶红外光谱Rep-PCR (DiversiLab)4.全基因组水平上全基因组水平上的鉴定的鉴定5.脉冲场电泳技术脉冲场电泳技术(PFGE),多位点序多位点序列分析列分析(MLST),多多位点重复串联序列位点重复串联序列分析分析(MLVA),随机扩随机扩增多态性分析技术增多态性分析技术（RAPD)API试剂条试剂条菌鉴定国际金标准菌鉴定国际金标准无需无需专用用仪器，器，标准化手工方法完成准化手工方法完成细菌的生化菌的生化鉴定，定，为低成本替代低成本替代传统手工手工细菌生化菌生化鉴定的最佳定的最佳产品。品。特点：特点：完整的完整的鉴定定谱：15种种试条，可条，可鉴定的定的细菌多于菌多于550种种简单方便：方便：标准化方法，成本低廉，判准化方法，成本低廉，判读结果果简单快速快速结果：果：4-24小小时。半自动细菌鉴定仪（半自动细菌鉴定仪（ATBExpression）检测项目：可鉴定由环境、原料及制成品分离出的菌检测项目：可鉴定由环境、原料及制成品分离出的菌种和药敏试验（包括：肠杆菌、非发酵种和药敏试验（包括：肠杆菌、非发酵G（-）杆菌、）杆菌、葡萄球菌、链球菌、酵母菌、厌氧菌）。可鉴定葡萄球菌、链球菌、酵母菌、厌氧菌）。可鉴定770种细菌和分析近种细菌和分析近80种抗生素药敏实验。种抗生素药敏实验。v原理：鉴定试条包含风干底物的反应孔，经标准浊原理：鉴定试条包含风干底物的反应孔，经标准浊度的菌液活化，于指定温度培养度的菌液活化，于指定温度培养4小时小时/24小时后小时后即可。计算机根据阅读器检测到的结果自动调用相即可。计算机根据阅读器检测到的结果自动调用相应试剂条数据库，得出生化应试剂条数据库，得出生化/同化结果和药敏试验同化结果和药敏试验结果。系统将所得编码跟数据库的典型菌株生化谱结果。系统将所得编码跟数据库的典型菌株生化谱比较，以客观的比较，以客观的2个参数（鉴定百分率及个参数（鉴定百分率及T-值）计值）计算鉴定结果算鉴定结果v特点：特点：速度快捷速度快捷ATBExpression提供自动化接种，阅提供自动化接种，阅读及分析试条结果。读及分析试条结果。准确可靠的结果准确可靠的结果ID32及快速及快速ID32试条由金牌试条由金牌标准标准API试条改良而成，配合自动化概念，结合成试条改良而成，配合自动化概念，结合成完整的细菌鉴定系统完整的细菌鉴定系统全自动细菌鉴定仪（全自动细菌鉴定仪（VITEK2）检测项目：根据需要鉴定的微生物的种类的不同，设计检测项目：根据需要鉴定的微生物的种类的不同，设计了不同的鉴定卡片，比如革兰氏阴性菌卡，革兰氏阳性了不同的鉴定卡片，比如革兰氏阴性菌卡，革兰氏阳性菌卡，酵母菌卡等。可鉴定菌卡，酵母菌卡等。可鉴定405种细菌，种细菌，70多种药物多种药物约约50多种药物组合的药敏卡。多种药物组合的药敏卡。v原理：仪器的原理其实就是我们进行细菌鉴定中使用原理：仪器的原理其实就是我们进行细菌鉴定中使用的生化反应。仪器把的生化反应。仪器把30个对细菌鉴定必需的生化反个对细菌鉴定必需的生化反应培养基固定到卡片上，然后通过培养后仪器对显色应培养基固定到卡片上，然后通过培养后仪器对显色反应进行判断，利用数值法进行判定。反应进行判断，利用数值法进行判定。v特点：特点：快速：鉴定结果平均只需快速：鉴定结果平均只需4-6小时。对与快速生长细小时。对与快速生长细菌菌(大肠埃希氏、粪肠球菌、变形杆菌、克雷伯氏菌大肠埃希氏、粪肠球菌、变形杆菌、克雷伯氏菌等等)鉴定可提前到鉴定可提前到2小时。小时。操作简便：全部操作自动化，简单而方便操作简便：全部操作自动化，简单而方便资料处理：资料处理：bioLIAISON软件集中管理实验室资料软件集中管理实验室资料获得获得AOAC国际认证：保证提供的微生物鉴定结果国际认证：保证提供的微生物鉴定结果是公认的是公认的全自动荧光免疫分析仪全自动荧光免疫分析仪(mini-VIDAS)检测项目：食品及目：食品及环境中最常境中最常见致病性致病性细菌（李斯特菌（李斯特菌属、菌属、单核增生李斯特菌、弯曲菌属、大核增生李斯特菌、弯曲菌属、大肠杆菌杆菌O157、沙沙门氏菌属、葡萄球菌氏菌属、葡萄球菌肠毒素毒素检测）的快速）的快速筛检。v原理：原理：以免疫技术捕获目标微生物，应用酶联免疫法，以免疫技术捕获目标微生物，应用酶联免疫法，最后测蓝色荧光（最后测蓝色荧光（ELFA）。包被针上有抗体包被，所）。包被针上有抗体包被，所测得的荧光与标本中抗原的含量成正比。测得的荧光与标本中抗原的含量成正比。v特点：特点：结果准确：对每个标本做两次免疫反应，保证结果的结果准确：对每个标本做两次免疫反应，保证结果的可靠。灵敏度比可见光方法高出可靠。灵敏度比可见光方法高出1000倍。已获得美倍。已获得美国国FDA、日本厚生省、日本厚生省、AOAC、USDA、中国进出口、中国进出口商品检验局等政府及权威机构认可。商品检验局等政府及权威机构认可。可同时进行可同时进行12个相同或不同的测试。每天进行约个相同或不同的测试。每天进行约6080项测试项测试特异性强：标本不需分离出目标微生物即可上机检测。特异性强：标本不需分离出目标微生物即可上机检测。避免交叉污染：没有采样针，避免标本之间交叉污染；避免交叉污染：没有采样针，避免标本之间交叉污染；样品不与仪器接触，仪器内没有抽吸样品的管路，杜样品不与仪器接触，仪器内没有抽吸样品的管路，杜绝了标本对环境的污染绝了标本对环境的污染全自动化、操作简便全自动化、操作简便荧光定量荧光定量PCR聚合酶链式反应技术（聚合酶链式反应技术（PCR）是分子生物学技术最具有）是分子生物学技术最具有代表性的技术。它是一种能在体外将微量生物代表性的技术。它是一种能在体外将微量生物DNA分子分子进行数百万倍放大的新型检测技术。进行数百万倍放大的新型检测技术。荧光定量荧光定量PCR技术在普通技术在普通PCR技术基础上，通过荧光染技术基础上，通过荧光染料的结合，将检测信号进一步放大，其灵敏度是普通料的结合，将检测信号进一步放大，其灵敏度是普通PCR的几百倍，并且整个扩增和检测过程由仪器自动完的几百倍，并且整个扩增和检测过程由仪器自动完成，检测同量高，速度快，减少了人为误差和环境干扰因成，检测同量高，速度快，减少了人为误差和环境干扰因素，克服了普通素，克服了普通PCR易污染的问题，除去样品前增菌时易污染的问题，除去样品前增菌时间，间，5小时内可得到检测结果。小时内可得到检测结果。微生物检测限可能达微生物检测限可能达到到1 CFU/mL以下，以下，而且抗杂菌干扰能力而且抗杂菌干扰能力强强DNA测序技术测序技术uDNA测序技术可以将生物的遗传信息完整的破译测序技术可以将生物的遗传信息完整的破译出来，通过直接比较不同类群个体同源核酸的核出来，通过直接比较不同类群个体同源核酸的核苷酸排列顺序，获得生物进化、变异的详细信息苷酸排列顺序，获得生物进化、变异的详细信息u如细菌的如细菌的16S r DNA和真菌的和真菌的ITS序列，已经被广序列，已经被广泛测定应用于菌种鉴定研究之中。由于泛测定应用于菌种鉴定研究之中。由于DNA测序测序方法耗时短，准确度高，在细菌、真菌、植物、方法耗时短，准确度高，在细菌、真菌、植物、动物的种类鉴定和系统发育研究方面得到了越来动物的种类鉴定和系统发育研究方面得到了越来越广泛的应用越广泛的应用a)微生物污染溯源分析微生物污染溯源分析目前微生物分型技术常用于流行病学调查和毒力分析目前微生物分型技术常用于流行病学调查和毒力分析国际上普遍认同脉冲凝胶电泳技术作为微生物分型的国际上普遍认同脉冲凝胶电泳技术作为微生物分型的标准方法标准方法现代分子生物学技术可用来区别近缘种，并在研究微现代分子生物学技术可用来区别近缘种，并在研究微生物种内或种组间不同的污染来源及地理亲缘关系的生物种内或种组间不同的污染来源及地理亲缘关系的研究中显示出广泛的应用前景研究中显示出广泛的应用前景b)相似微生物相似微生物DNA序列比对和微生物进化分析序列比对和微生物进化分析根据生物根据生物DNA序列的特异性分析，可检测生物基因的序列的特异性分析，可检测生物基因的微小变化，监控和预测微生物污染的爆发微小变化，监控和预测微生物污染的爆发16S rDNA分型已被广泛认可分型已被广泛认可，微生物微生物16S rDNA进化进化树对目标微生物进行详细的基因分型，同时还可了解树对目标微生物进行详细的基因分型，同时还可了解不同来源微生物的进化关系和亲缘关系。该技术应用不同来源微生物的进化关系和亲缘关系。该技术应用范围宽，发展前景广，发展潜力巨大范围宽，发展前景广，发展潜力巨大指纹图谱技术指纹图谱技术分子杂交技术首先用限制性内切酶对细菌分子杂交技术首先用限制性内切酶对细菌基因组基因组DNA进行酶消化，通过特异性探针进行酶消化，通过特异性探针与目标与目标DNA序列的杂交结合，经过转膜技序列的杂交结合，经过转膜技术和显色技术形成该细菌特有的杂交图谱。术和显色技术形成该细菌特有的杂交图谱。现有成熟的基于现有成熟的基于16S r DNA的分子杂技图的分子杂技图谱库涵盖了谱库涵盖了200个属的个属的1200多种多种6950株微株微生物，为各研究和实验机构提供了一个统生物，为各研究和实验机构提供了一个统一的微生物分型标准。为环境分离物、致一的微生物分型标准。为环境分离物、致病菌、有害生物体、质控菌株、有益生物病菌、有害生物体、质控菌株、有益生物体和任何细菌建立了一个全自动的基因指体和任何细菌建立了一个全自动的基因指纹图库。这一精确到菌株水平的鉴定系统纹图库。这一精确到菌株水平的鉴定系统能够追溯细菌污染源，并且具有对所有微能够追溯细菌污染源，并且具有对所有微生物环境进行控制及流行病学调查等强大生物环境进行控制及流行病学调查等强大功能。功能。a)a)近红外傅立叶光谱分析近红外傅立叶光谱分析b)b)色谱分析色谱分析物质成分分析物质成分分析红外傅立叶光谱分析红外傅立叶光谱分析FT-IR技术以未损伤细胞的技术以未损伤细胞的FT-IR光谱的特殊指纹区为基光谱的特殊指纹区为基础，光谱反映的是整个细胞组成分子的振动特征，也就础，光谱反映的是整个细胞组成分子的振动特征，也就是蛋白质、核酸等物质的特征是蛋白质、核酸等物质的特征由于这些细胞组分与基因表达有关，反应了全细胞组分由于这些细胞组分与基因表达有关，反应了全细胞组分的综合信息所得图谱有效地反映了细胞表型和基因型信的综合信息所得图谱有效地反映了细胞表型和基因型信息，从而区分生化信息上的差别息，从而区分生化信息上的差别德国德国Bruker公司微生物公司微生物FT-IR分析分析用户手册主要采用用户手册主要采用1200-900-1，3000-2800-1，1500-1400-1谱段组合进行微生物判别分谱段组合进行微生物判别分析，这析，这3个谱段分别主要代表了微个谱段分别主要代表了微生物细胞壁多聚糖、细胞膜脂肪生物细胞壁多聚糖、细胞膜脂肪酸以及细胞质膜蛋白质和类脂成酸以及细胞质膜蛋白质和类脂成分的信息。分的信息。色谱分析色谱分析微生物中含有的一些称为生物标志物的化学物质微生物中含有的一些称为生物标志物的化学物质，其含量或结构具其含量或结构具有种属特征或与其分类位置密切相关有种属特征或与其分类位置密切相关通过分析微生物的化学组成鉴定微生物，开辟了一个微生物检测和通过分析微生物的化学组成鉴定微生物，开辟了一个微生物检测和鉴定的新途径鉴定的新途径高效液相色谱高效液相色谱(High-performance liquid chromatography，HPLC)气相色谱气相色谱(Gas chromatography，GC)气相色谱质谱联用气相色谱质谱联用(Gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)液相色谱液相色谱-质谱联用质谱联用(LC-MS/MS)建立各种生物标志物在微生物中分布情况建立各种生物标志物在微生物中分布情况的数据库及相应的标准分析程序，仍然是的数据库及相应的标准分析程序，仍然是色谱分析微生物的主要方向色谱分析微生物的主要方向2.1 技术手段技术手段2.2 方法比较方法比较各种鉴定方法的比较各种鉴定方法的比较我所抗生素室通过比较分析近百我所抗生素室通过比较分析近百种微生物的生化鉴定方法（种微生物的生化鉴定方法（API和和VITEK2鉴定）和分子生物学鉴定）和分子生物学方法鉴定方法，客观准确的多方方法鉴定方法，客观准确的多方面评价各种方法的优劣面评价各种方法的优劣微生物鉴定技术平台的建设微生物鉴定技术平台的建设二二样品微生物的鉴定及同源性分析样品微生物的鉴定及同源性分析三三微生物实验室能力建设微生物实验室能力建设微生物新技术的应用微生物新技术的应用四四微生物污染监管方式的思考微生物污染监管方式的思考五五背景介绍背景介绍一一3.1 细菌鉴定细菌鉴定3.2 溯源分析溯源分析3.1 细菌鉴定细菌鉴定3.2 溯源分析溯源分析3.1 细菌鉴定细菌鉴定3.2 溯源分析溯源分析微生物鉴定技术平台的建设微生物鉴定技术平台的建设二二样品微生物的鉴定及同源性分析样品微生物的鉴定及同源性分析三三微生物实验室能力建设微生物实验室能力建设微生物新技术的应用微生物新技术的应用四四微生物污染监管方式的思考微生物污染监管方式的思考五五背景介绍背景介绍一一四、四、微生物鉴定技术平台建设的意义及运用微生物鉴定技术平台建设的意义及运用 增强药品中微生物检验能力，做到数据可信，增强药品中微生物检验能力，做到数据可信，国际认可，为执法、仲裁提供依据国际认可，为执法、仲裁提供依据政府检测实验室、药厂微生物检测实验室洁政府检测实验室、药厂微生物检测实验室洁净环境监控，构建环境微生物分布图，提高净环境监控，构建环境微生物分布图，提高检测结果公信力检测结果公信力与国际标准接轨，监控药品生产环境，构与国际标准接轨，监控药品生产环境，构建药品生产微生物风险评估体系建药品生产微生物风险评估体系应用范围广，扩展能力强，医疗器械、食应用范围广，扩展能力强，医疗器械、食品、医院等领域广泛运用品、医院等领域广泛运用4.14.24.34.4四、四、微生物鉴定技术平台建设的意义及运用微生物鉴定技术平台建设的意义及运用 增强药品中微生物检验能力，做到数据可信，增强药品中微生物检验能力，做到数据可信，国际认可，为执法、仲裁提供依据国际认可，为执法、仲裁提供依据政府检测实验室、药厂微生物检测实验室洁政府检测实验室、药厂微生物检测实验室洁净环境监控，构建环境微生物分布图，提高净环境监控，构建环境微生物分布图，提高检测结果公信力检测结果公信力与国际标准接轨，监控药品生产环境，构与国际标准接轨，监控药品生产环境，构建药品生产微生物风险评估体系建药品生产微生物风险评估体系应用范围广，扩展能力强，医疗器械、食应用范围广，扩展能力强，医疗器械、食品、医院等领域广泛运用品、医院等领域广泛运用4.14.24.34.4v微生物检测实验室应首先确保实验室的设施和微生物检测实验室应首先确保实验室的设施和环境不会对检验过程带来微生物污染环境不会对检验过程带来微生物污染v只有排除检测过程中的微生物污染，才能保证只有排除检测过程中的微生物污染，才能保证检验结果的准确性，才能有足够的理由相信，检验结果的准确性，才能有足够的理由相信，样品污染来自药品本身，而不在检验过程中被样品污染来自药品本身，而不在检验过程中被污染的污染的v对检测机构而言，自身检测环境的控制要比样对检测机构而言，自身检测环境的控制要比样品检测更加重要品检测更加重要四、四、微生物鉴定技术平台建设的意义及运用微生物鉴定技术平台建设的意义及运用公正公正准确准确科学科学高效高效v加强检测的加强检测的“过程控制过程控制”v建立实验室环境微生物信息库、动态监控环境建立实验室环境微生物信息库、动态监控环境微生物的变化、建立环境微生物污染趋势分析微生物的变化、建立环境微生物污染趋势分析图，预测微生物污染方向，从被动的排查污染图，预测微生物污染方向，从被动的排查污染措施上升到主动的预防、预警。措施上升到主动的预防、预警。v如果样品检验过程中不合格，分离鉴定样品中如果样品检验过程中不合格，分离鉴定样品中的微生物，与环境微生物数据库比较、分析微的微生物，与环境微生物数据库比较、分析微生物污染来源，出具客观的检测报告，杜绝实生物污染来源，出具客观的检测报告，杜绝实验结果假阳性和假阴性的发生验结果假阳性和假阴性的发生样样品品接接收收样样品品摆摆放放样样品品分分发发环境环境设施设施仪器仪器实实验验过过程程结结果果报报告告登记样品名称，检查是否具有唯一性登记样品名称，检查是否具有唯一性标识，并检查是否与运转表内容一致标识，并检查是否与运转表内容一致看样品外包装是否完整、密封看样品外包装是否完整、密封,是否能是否能保持无菌状态符合检验要求保持无菌状态符合检验要求样品数量是否符合检验要求样品数量是否符合检验要求样样品品接接收收原原始始记记录录原原始始记记录录审审核核检测过程控制检测过程控制样样品品分分发发环境环境设施设施仪器仪器实实验验过过程程结结果果报报告告根据样品的贮存条件进行冷藏、冷冻根据样品的贮存条件进行冷藏、冷冻或常温放置或常温放置将样品分区域（在检、待检、检毕）将样品分区域（在检、待检、检毕）摆置摆置冰箱和冰柜的温度记录冰箱和冰柜的温度记录样品摆放样样品品摆摆放放样样品品接接收收原原始始记记录录原原始始记记录录审审核核检测过程控制检测过程控制环境环境设施设施仪器仪器实实验验过过程程结结果果报报告告环境和设施等的质量管理环境和设施等的质量管理仪器状态是否正常（是否在计量标志仪器状态是否正常（是否在计量标志的有效期内）的有效期内）做好仪器使用记录做好仪器使用记录仪器设施环境样样品品接接收收样样品品摆摆放放样样品品分分发发原原始始记记录录原原始始记记录录审审核核检测过程控制检测过程控制样样品品分分发发环境环境设施设施仪器仪器实实验验过过程程结结果果报报告告核对质量标准是否现行有效核对质量标准是否现行有效培养基的质量评估工作的审查培养基的质量评估工作的审查关键步骤用试剂的质量控制关键步骤用试剂的质量控制阳性对照菌的管理阳性对照菌的管理留样管理留样管理废弃物管理废弃物管理对灭菌效果评价的审查对灭菌效果评价的审查实验过程质量控制管理（人员技术能力，方法比对实验过程质量控制管理（人员技术能力，方法比对实验，人员比对实验，制备质控样品加菌随行检查）实验，人员比对实验，制备质控样品加菌随行检查）应急事件处理程序应急事件处理程序实验过程样样品品接接收收样样品品摆摆放放原原始始记记录录原原始始记记录录审审核核检测过程控制检测过程控制样样品品分分发发环境环境设施设施仪器仪器实实验验过过程程结结果果报报告告完全按完全按SOP书写，所写即所做的内容书写，所写即所做的内容统一原始记录的格式和内容统一原始记录的格式和内容按既定期限完成原始记录的书写按既定期限完成原始记录的书写按不同来源分别输入结果按不同来源分别输入结果原始记录样样品品接接收收样样品品摆摆放放原原始始记记录录原原始始记记录录审审核核检测过程控制检测过程控制样样品品分分发发环境环境设施设施仪器仪器实实验验过过程程结结果果报报告告原始记录的完整性原始记录的完整性检验数据的正确性检验数据的正确性结果判断的合理性结果判断的合理性原始记录审核样样品品接接收收样样品品摆摆放放原原始始记记录录审审核核原原始始记记录录检测过程控制检测过程控制样样品品分分发发环境环境设施设施仪器仪器实实验验过过程程结结果果报报告告阴性结果直接报告阴性结果直接报告阳性结果阳性结果鉴定鉴定结结果果报报告告样样品品接接收收样样品品摆摆放放原原始始记记录录原原始始记记录录审审核核检测过程控制检测过程控制建立环境微生物菌株信息库建立环境微生物菌株信息库实验室洁净环境微生物监控实验室洁净环境微生物监控头状葡萄球菌头状葡萄球菌（Staphylococcuscapitis）溶血葡萄球菌溶血葡萄球菌（Staphylococcushaemolyticus）缓症链球菌缓症链球菌（Streptococcusmitis）科氏葡萄球菌科氏葡萄球菌（Staphylococcuscohnii）藤黄微球菌藤黄微球菌（Micrococcusluteus）常见洁净环境微生物污染常见洁净环境微生物污染实验室洁净环境微生物监控实验室洁净环境微生物监控v建立实验室洁净区采样方案建立实验室洁净区采样方案医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法（GB/T16292162941996）药品生产质量管理规范药品生产质量管理规范（1998）v以一个月为周期，连续监测实验室环境以一个月为周期，连续监测实验室环境v不定期对无菌室洁净环境进行抽样调查，积累洁净环境微生物种群不定期对无菌室洁净环境进行抽样调查，积累洁净环境微生物种群和分布数据和分布数据检查内容包括沉降菌检测、浮游菌检测、检查内容包括沉降菌检测、浮游菌检测、表面微生物检测和操作人员卫生检测等表面微生物检测和操作人员卫生检测等v在实验环境中以葡萄球菌属（在实验环境中以葡萄球菌属（Staphylococcus）分离数目最多）分离数目最多为为34%v微球菌属（微球菌属（Micrococcus）和芽孢杆菌属（）和芽孢杆菌属（Bacillus）次之，）次之，分别为分别为19.15%和和17.04%v假单胞菌属（假单胞菌属（Micrococcus）、莫拉菌群（）、莫拉菌群（Moraxella）、短）、短波单胞菌属（波单胞菌属（Brevundimonas）占）占4.26%v短杆菌属（短杆菌属（Brevibacterium）、不动杆菌属）、不动杆菌属（Acinetobacter）、鞘氨醇单胞菌属（）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、）、泛菌属（泛菌属（Pantoea）等所占比例归于其他项中）等所占比例归于其他项中v收集的环境微生物中酵母菌占收集的环境微生物中酵母菌占8.51%，主要为近平滑假丝酵母，主要为近平滑假丝酵母（Candidaparapsilosis）和粘红酵母（）和粘红酵母（Rhodotorulamucilaginosa）v霉菌等丝状真菌占霉菌等丝状真菌占4.26%，主要为青霉菌属，主要为青霉菌属 我所实验室洁净环境微生物监控我所实验室洁净环境微生物监控 我所环境微生物菌株信息库的建立我所环境微生物菌株信息库的建立我们连续三个月对实验室洁净环境中我们连续三个月对实验室洁净环境中部分环境微生物进行追踪，并进行同部分环境微生物进行追踪，并进行同源性分析源性分析v以葡萄球菌属为例，本实验室共收集到以葡萄球菌属为例，本实验室共收集到16株葡萄球球株葡萄球球菌属细菌。菌属细菌。v7、8月分别收集到的细菌月分别收集到的细菌239与与250和和232与与246之之间同源性较高，归在一个子类中，属于同源污染。间同源性较高，归在一个子类中，属于同源污染。v说明说明7月和月和8月之间的消毒灭菌过程不彻底，存在消毒月之间的消毒灭菌过程不彻底，存在消毒漏洞。漏洞。v经过消毒，在经过消毒，在9月份监测过程中收集到的葡萄球菌中未月份监测过程中收集到的葡萄球菌中未发现有和前两月同源的菌株，说明前期的污染已经消除，发现有和前两月同源的菌株，说明前期的污染已经消除，9月份收集到的部分葡萄球菌为新进入环境的微生物。月份收集到的部分葡萄球菌为新进入环境的微生物。v同一株菌反复污染洁净环境要引起检验人员高度同一株菌反复污染洁净环境要引起检验人员高度重视重视v仅靠洁净室内部消毒措施很可能起不到排除污染仅靠洁净室内部消毒措施很可能起不到排除污染的作用的作用v要对洁净室送风系统和检验人员携带污染进行全要对洁净室送风系统和检验人员携带污染进行全面调查面调查v建立环境微生物污染趋势分析图，预测微生物污建立环境微生物污染趋势分析图，预测微生物污染方向，从被动的排查污染措施上升到主动的预染方向，从被动的排查污染措施上升到主动的预防、预警。将污染信息并与历史污染物比对，回防、预警。将污染信息并与历史污染物比对，回顾调查，帮助质量体系的改进。顾调查，帮助质量体系的改进。微生物进行鉴定菌株来源微生物进行鉴定菌株来源共241株四、四、微生物鉴定技术平台建设的意义及运用微生物鉴定技术平台建设的意义及运用 增强药品中微生物检验能力，做到数据可信，增强药品中微生物检验能力，做到数据可信，国际认可，为执法、仲裁提供依据国际认可，为执法、仲裁提供依据政府检测实验室、药厂微生物检测实验室洁政府检测实验室、药厂微生物检测实验室洁净环境监控，构建环境微生物分布图，提高净环境监控，构建环境微生物分布图，提高检测结果公信力检测结果公信力与国际标准接轨，监控药品生产环境，构与国际标准接轨，监控药品生产环境，构建药品生产微生物风险评估体系建药品生产微生物风险评估体系应用范围广，扩展能力强，医疗器械、食应用范围广，扩展能力强，医疗器械、食品、医院等领域广泛运用品、医院等领域广泛运用4.14.24.34.4在药品微生物检验中的应用在药品微生物检验中的应用v在严格依据法定方法进行检验的同时，结合微生物在严格依据法定方法进行检验的同时，结合微生物鉴定技术平台，对鉴定技术平台，对检验过程检验过程和和检验结果检验结果进行双重复进行双重复合和监控。通过合和监控。通过对比环境监测的微生物对比环境监测的微生物种群类别和种群类别和样品微生物种群情况，客观准确的评价检验质量，样品微生物种群情况，客观准确的评价检验质量，增菌检验报告的含金量。增菌检验报告的含金量。在细菌污染检查中的应用在细菌污染检查中的应用分离纯化得到单菌落菌落形态检验DNA提取构建系统发育树分子生物学鉴定通用引物扩增细菌16S rDNA 序列16S rDNA序列分析鉴定结论样品接收革兰氏染色API鉴定形态鉴定生化鉴定VITEK鉴定细菌的鉴定流程图细菌的鉴定流程图在真菌污染检查中的应用在真菌污染检查中的应用在真菌污染检查中的应用在真菌污染检查中的应用v现行国标仅能够对曲霉属，青霉属，镰刀菌属等少数几现行国标仅能够对曲霉属，青霉属，镰刀菌属等少数几个种属的霉菌进行鉴定。个种属的霉菌进行鉴定。v我国的食品卫生微生物学检验国家标准中，对于青霉菌我国的食品卫生微生物学检验国家标准中，对于青霉菌的鉴定需要在分离纯化后培养的鉴定需要在分离纯化后培养12-14天，再对其孢子天，再对其孢子及菌丝进行形态学观察。及菌丝进行形态学观察。v真菌孢子易于在空气中飘散，难以杀灭，对实验室环境真菌孢子易于在空气中飘散，难以杀灭，对实验室环境和检验人员安全具有潜在污染风险。和检验人员安全具有潜在污染风险。分子生物学鉴定技术有效的解决了区分污染来源的分子生物学鉴定技术有效的解决了区分污染来源的问题。该方法不需要使用选择性培养基，纯化后即问题。该方法不需要使用选择性培养基，纯化后即可进行菌种鉴定。对真菌的菌丝体和孢子均能够进可进行菌种鉴定。对真菌的菌丝体和孢子均能够进行行DNA的提取，避免霉菌产生的大量孢子对实验的提取，避免霉菌产生的大量孢子对实验室工作环境带来的潜在污染危害室工作环境带来的潜在污染危害真菌的鉴定流程图真菌的鉴定流程图分离纯化得到真菌样品的单菌落真菌菌落形态观察真菌DNA的提取构建系统发育树分子生物学评价通用引物扩增真菌ITS 序列ITS序列在GenBank中进行Blast分析鉴定结论四、四、微生物鉴定技术平台建设的意义及运用微生物鉴定技术平台建设的意义及运用 增强药品中微生物检验能力，做到数据可信，增强药品中微生物检验能力，做到数据可信，国际认可，为执法、仲裁提供依据国际认可，为执法、仲裁提供依据政府检测实验室、药厂微生物检测实验室洁政府检测实验室、药厂微生物检测实验室洁净环境监控，构建环境微生物分布图，提高净环境监控，构建环境微生物分布图，提高检测结果公信力检测结果公信力与国际标准接轨，监控药品生产环境，构与国际标准接轨，监控药品生产环境，构建药品生产微生物风险评估体系建药品生产微生物风险评估体系应用范围广，扩展能力强，医疗器械、食应用范围广，扩展能力强，医疗器械、食品、医院等领域广泛运用品、医院等领域广泛运用4.14.24.34.4美国美国FDA在要求药厂将微生物鉴定到在要求药厂将微生物鉴定到“种种”一级，并一级，并建议在微生物形态和生化反应鉴定之外采用基因分型建议在微生物形态和生化反应鉴定之外采用基因分型技术进行分析，以便对生产环境的微生物污染进行监技术进行分析，以便对生产环境的微生物污染进行监控控对药厂生产环境监管和风险评估上应用对药厂生产环境监管和风险评估上应用上海某药业产品受微生物潜在污染风险上海某药业产品受微生物潜在污染风险上海某药业有限公司无菌产品微生物污染上海某药业有限公司无菌产品微生物污染溯源溯源某医疗器材有限公司灭菌方法研究某医疗器材有限公司灭菌方法研究对药厂生产环境监管和风险评估上应用对药厂生产环境监管和风险评估上应用某制某制药厂沉降菌同源性分析厂沉降菌同源性分析检测实验室检测实验室微生物信息库微生物信息库制药企业制药企业微生物信息库微生物信息库同同源源性性分分析析比比对对污染源污染源是是否否微生物鉴定技术平台建设的意义及运用微生物鉴定技术平台建设的意义及运用 鉴鉴 定定四、四、微生物鉴定技术平台建设的意义及运用微生物鉴定技术平台建设的意义及运用 增强药品中微生物检验能力，做到数据可信，增强药品中微生物检验能力，做到数据可信，国际认可，为执法、仲裁提供依据国际认可，为执法、仲裁提供依据政府检测实验室、药厂微生物检测实验室洁政府检测实验室、药厂微生物检测实验室洁净环境监控，构建环境微生物分布图，提高净环境监控，构建环境微生物分布图，提高检测结果公信力检测结果公信力与国际标准接轨，监控药品生产环境，构与国际标准接轨，监控药品生产环境，构建药品生产微生物风险评估体系建药品生产微生物风险评估体系应用范围广，扩展能力强，医疗器械、食应用范围广，扩展能力强，医疗器械、食品、医院等领域广泛运用品、医院等领域广泛运用4.14.24.34.44.4应用范围广，扩展能力强，可进行产品应用范围广，扩展能力强，可进行产品真伪鉴别和致敏原检测真伪鉴别和致敏原检测v国际上普遍加强了有关食品标签的法律法规，对相关标准不断国际上普遍加强了有关食品标签的法律法规，对相关标准不断细化。越来越多国家和地区开始全面实施对食品致敏原成分加细化。越来越多国家和地区开始全面实施对食品致敏原成分加以标识的规定以标识的规定酶联免疫技术酶联免疫技术PCR技术等技术等v动植物产品的真伪鉴定动植物产品的真伪鉴定追踪产品产地追踪产品产地鉴别产品主要组成成分鉴别产品主要组成成分PCRPCR技术在致敏原检测中具有较高的技术在致敏