第二章-生物反应动力学-1-酶促反应省名师优质课赛课获奖课件市赛课百校联赛优质课一等奖课件.ppt

第二章第二章 生物反应动力学生物反应动力学生物反应动力学生物反应动力学：是硕士物反应速率和各种原因对反应速率影响科学。生物反应酶促反应细胞培养1/114第二章第二章 生物反应动力学生物反应动力学第一节第一节 酶促反应动力学酶促反应动力学第二节第二节 细胞生长过程动力学细胞生长过程动力学2/114本章要求：本章要求：掌握简单酶催化反应动力学、有抑制和复杂酶催化反应动力学，掌握影响酶催化反应速率原因，以及动力学参数求取。了解微生物反应过程计量学，掌握分批培养时细胞生长动力学、底物消耗及产物生成动力学，学会细胞反应动力学参数估算。3/114第一节第一节 酶促反应动力学酶促反应动力学1.1 酶促反应动力学概述1.2 均相酶促反应动力学均相酶促反应动力学1.3 有抑制酶催化反应动力学1.4 影响酶催化反应原因4/114 酶促反应是生物反应基础，从酶促反应可获知：（1）酶催化反应机制；（2）对酶促反应速率规律进行定性或定量描述，建立可靠反应动力学方程，从而确定适宜操作条件。1.1 酶促反应动力学概述酶促反应动力学概述5/1141.1.1 1.1.1 在生物反应器中使用催化剂在生物反应器中使用催化剂生物生物催化催化剂剂使用方法使用方法游离状态固定化状态酶游离酶固定化酶(微)生物休眠悬浮细胞死亡悬浮细胞固定化休眠细胞固定化死亡细胞6/1141.1.2 1.1.2 酶应用特点酶应用特点 酶是以活力、而不是以质量购销。酶有不一样质量等级：工业用酶、食品用酶、医药用酶。酶在实际应用中应注意，没有必要使用比工艺条件所需纯度更高酶。7/114 经典酶学研研究究中中，酶活力测定是在反应初始短时间内进行，而且酶浓度、底物浓度较低，且为水溶液，酶学研究目标是探讨酶促反应机制。工工业业上上，为确保酶促反应高效率完成，常需要使用高浓度酶制剂和底物，且反应要连续较长时间，反应体系多为非均相体系，有时反应是在有机溶剂中进行。8/1141.1.3 酶促反应特征酶促反应特征常温、常压、中性范围（个别除外）下进行反应；常温、常压、中性范围（个别除外）下进行反应；与一些化学反应相比，省能且效率较高；与一些化学反应相比，省能且效率较高；专一性好；专一性好；反应体系较简单，反应过程最适条件易于控制等。反应体系较简单，反应过程最适条件易于控制等。优点：优点：不足：不足：多限于一步或几步较简单生化反应过程；多限于一步或几步较简单生化反应过程；普通周期较长。普通周期较长。9/1141.1.4 1.1.4 研究酶促反应目标研究酶促反应目标 对工程技术人员而言，仅用于解释酶促反应机制是不够，还应对影响其反应速率原因进行定量分析，建立可靠反应速率方程式，为反应器合理设计合反应过程最正确条件选择服务。10/114 均相酶反应：均相酶反应：系指酶与反应物系处于同一相液相酶催化反应，它不存在相间物质传递。非均相酶反应：非均相酶反应：系指酶与反应物系处于不一样相酶催化反应，反应过程存在相间物质传递。1.2 1.2 均相酶促反应动力学均相酶促反应动力学11/1141.2.1 酶促反应动力学基础酶促反应动力学基础酶促反应速率影响原因浓度原因：酶浓度、底物浓度、产物浓度、效应物浓度。内部原因(结构原因)：底物或效应物结构、酶结构。外部原因(反应环境)：温度、pH、离子强度、溶剂介电常数。1 影响酶促反应速率原因12/114 依据酶促反应速率与底物浓度之间关系，利用化学反应动力学方法建立对应动力学方程：零级反应 一级反应 二级反应 连锁酶促反应1.2.1 酶促反应动力学基础酶促反应动力学基础2 反应方程建立反应方程建立13/1141.2.1 酶促反应动力学基础酶促反应动力学基础酶促反应与底物浓度无关。式中：CA底物浓度，CB产物浓度。rmax 最大反应速率3 零级反应零级反应14/1141.2.1 酶促反应动力学基础酶促反应动力学基础4 一级反应一级反应式中：k1一级反应速率常数 CA0底物A初始浓度 CBt时刻产物B浓度反应速率与底物浓度一次方成正比。15/1141.2.1 酶促反应动力学基础酶促反应动力学基础5 二级反应二级反应式中：k2二级反应速率常数 CA0，CB0底物A和B初始浓度 CDt时产物D浓度积分16/1141.2.1 酶促反应动力学基础酶促反应动力学基础6 链锁酶促反应过程链锁酶促反应过程A初始浓度CA0，B、D初始浓度为0，且CA+CB+CD=CA0式中：k1、k2反应速率常数 CA、CB、CDA、B、D浓度17/114【例2-1】卵状假单胞菌在分批式反应中先将葡萄糖转变为葡萄糖内脂，再转化为葡萄糖酸，此反应为一级反应，反应式以下：求中间产物（葡萄糖内脂）浓度到达最大时所需时间tmax及其最大浓度值CLmax，已知反应常数k1和k2分别为0.87/h和0.7/h。CG0(初始G浓度)38mg/ml葡萄糖内脂葡萄糖葡萄糖酸18/114解：当L物到达最大值时t=0：CG0 0 0 t=t：CG CL CP 19/11420/1141.2.2 简单酶催化反应动力学简单酶催化反应动力学 指由一个反应物（底物）参加不可逆反应，指由一个反应物（底物）参加不可逆反应，比如酶催化水解反应和异构化反应。能够写为：能够写为：其反应机理能够认为是：首先是底物其反应机理能够认为是：首先是底物S和酶和酶E相结相结合形成中间复合物合形成中间复合物ES，然后该复合物分解成产，然后该复合物分解成产物物P，并释放出酶，并释放出酶E。即有：。即有：S+EES P+E 21/114上述反应速率可表示为：式中：rs底物S消耗速率，mol/(LS)rp产物P生成速率，mol/(LS)v反应体系体积，L ns，np分别为底物S和产物P物质量，mol Cs，Cp分别为底物S和产物P浓度，mol/L t时间，s22/114 因为中间复合物ES浓度CES为一难测定未知量，所以不能用它来表示最终速率方程。为此，需用反应体系中可测量来代替该未知量。这么得到反应速率方程能够用来描述反应进程，知道伴随反应进行各组分浓度改变情况，据此能够设计相关反应器。依据质量作用定律，P生成速率可表示为：23/114 对于上述反应，我们假设：（1）反应过程中，酶浓度保持恒定，即（2）与底物浓度Cs相比，酶浓度是很小，因而可忽 略因为生成中间复合物ES而消耗底物。（3）产物抑制作用能够忽略。有两种推导反应速率方程方法：平衡假设法平衡假设法和拟稳态假设法拟稳态假设法。24/114平衡假设：19，Michaelis-Menten认为酶催化反应历程中，生成产物一步反应速率要慢于底物S和酶形成中间复合物可逆反应速率，所以生成产物一步反应速率决定整个酶催化反应速率，生成复合物可逆反应则到达平衡状态。1.2.2.1 平衡假设法平衡假设法Michaelis-Menten方程方程25/114依据假设有：r=rp=k+2CES依据生成复合物可逆反应有：k+1CECS=k-1CESCE0=CE+CES26/114该方程中引入了两个参数：KS=k-1/k+1 解离常数rP,max=k+2CE0rP,max P最大生成速率,mol/L.s 最终一式即为M-M方程。M-M方程是一个两参数方程。当从中间复合物生成产物P速率与其分解成酶和底物速率相当初，M-M方程不适用。27/1141.2.2.2 Briggs-Haldane 方程 当从中间复合物生成产物速率与其分解成酶与底物速率相差不大时，米氏方程平衡假设不适用。1925年，Briggs-Haldane提出了拟稳态假设：即中间复合物浓度不再随时间而改中间复合物浓度不再随时间而改变变，即：这就是“拟稳态”假设。这是从反应机理推导动力学方程又一主要假设。28/114依据反应机理和拟稳态假设，有下述方程式：CE0=CE+CES 29/114该方程中引入了两个参数：rP,max=k+2CE0rP,max P最大生成速率,mol/L.s最终一式即为B-H方程。30/114项目项目 M-M方程方程 B-H方程方程 假设假设1.酶和底物生成不稳定复合物ES，酶催化反应是经该中间复合物完成：即 2.ES在反应开始后与E及S迅速抵达动态平衡：2.ES生成速率与解离速率相等，浓度不随时间而改变 3.底物浓度远高于酶浓度。酶量守恒酶量守恒 产物生成速率产物生成速率 动力学方程动力学方程 Ks与与Km M-M方程与方程与B-H方程比较方程比较31/114在详细应用时，人们亦将B-H方程称为M-M方程。一律表示为:上述B-H方程好M-M方程推导中，都假设CE0CS0，因而CES值也很小，假如酶浓度较高时，CES值在反应过程中有可能很高，假如按上述简化处理会带来误差，此时，物料平衡和速率方程可表示为：CE0=CE+CESCS0=CS+CES+CP对此方程组普通得不到解析解，对此方程组普通得不到解析解，只能得到数值解。只能得到数值解。32/1141.2.3 米氏方程米氏方程动力学特征动力学特征当CS,Km靠近时，呈混合级反应，则符合M-M关系。当CSKm时，一级反应。当CSKm时，rrp,max 零级反应。33/114Km和和rmax意义意义 当r=rmax/2时，Km=CS。所以，Km等于酶促反应速度达最大值二分之一时底物浓度。当k-1k+2时，Km=k-1/k+1=Ks。所以，Km能够反应酶与底物亲和力大小，即Km值越小，则酶与底物亲和力越大；反之，则越小。Km可用于判断反应级数：当CS 100Km时，r=rmax，反应为零级反应，即反应速度与底物浓度无关；当0.01Km CS 100Km时，反应处于零级反应和一级反应之间，为混合级反应。34/114Km和和rmax意义意义 Km可用来判断酶最适底物：当酶有几个不一样底物存在时，Km值最小者，为该酶最适底物。Km是酶特征性常数：在一定条件下，某种酶Km值是恒定，因而能够经过测定不一样酶（尤其是一组同工酶）Km值，来判断是否为不一样酶。Km可用来确定酶活性测定时所需底物浓度：当CS=10Km时，r=91%rmax，为最适当测定酶活性所需底物浓度。rmax可用于酶转换数计算：当酶总浓度和最大速度已知时，可计算出酶转换数，即单位时间内每个酶分子催化底物转变为产物分子数。35/114例例2-2 有一均相酶催化反应，Km值为210-3mol/L，当底物初始浓度CS0为110-5mol/L时，若反应进行1min，则有2底物转化为产物。试求出：(1)当反应进行3min，底物转化为产物百分数是多少?此时底物和产物浓度分别是多少?(2)当CS0为110-6mol/L时，也反应了3min，底物和产物浓度又是多少?(3)最大反应速率rmax值为多少?36/114解：(1)依据题意，CS00.01Km，此时普通认为可按一级反应处理。其动力学方程可表示为：因为 已知t=1min时,Xs=0.02所以 CS=CS0(1-XS)=110-5(1-0.02)=0.9810-5mol/L 将已知数据带入上式中，求得 K=0.0202min-1 当t=3min时，能够求得 CS=0.9410-5mol/L，XS=6%，CP=610-7mol/L(2)CS0=110-6mol/L时，仍可视为一级反应，所以当t=3min时，一样能够求得Xs=6%，CS=0.9410-6mol/L，CP=610-8mol/L(3)依据K=rmax/Km=0.0202 min-1得rmax=KKm=4.0410-5mol/(Lmin)37/114【例【例2-3】某酶催化反应，其Km=0.01mol/l。为了求其最大反应速率rmax值，现经过试验测得该反应进行到5min时，底物已转化了10%，已知CS0=3.410-4mol/l,并假定该反应可用M-M方程表示。试求：（1）最大反应速率rmax为多少？（2）反应15min后，底物浓度为多少？可得：rmax=2.7210-4代入t=15min，可知 CS=2.3410-4解：将数据代入积分得 38/1141.2.4 1.2.4 动力学常数计算动力学常数计算要建立一个完善动力学方程，必须用动力学试验确定其动力学参数。对M-M方程，就要确定rmax=k+2CE0和Km 值，因为M-M方程为一非线性方程，无法直接经过作图法求取。为此要对方程进行线性化处理。不一样线性化处理方法，就是不一样参数求取方法。使用时依据所得数据选择适宜方法。下面介绍几个惯用方法。39/114将将M-M方程取其倒方程取其倒 数得到下式：数得到下式：以1/rs对1/Cs作图得一直线见图，该直线斜率为Km/rmax，直线与纵轴交于1/rmax，与横轴交于-1/Km，此法又称双倒 数图解法。1.2.4.1 Lineweaver-Burk法（简称法（简称L-B法），法），40/114以Cs/rs对Cs作图，得一斜率为1/rmax直线，直线与纵轴交点 为Km/rmax,与横轴交点为-Km。1.2.4.2 Hanes-Woolf法（简称法（简称H-W法法)将式两边均乘以将式两边均乘以Cs得得:41/114以rs对rs/Cs作图，得一斜率为-Km直线，与纵轴交 点为rmax，与横轴交点rmax/Km。1.2.4.3 Eadie-Hofstee法法(简称简称E-H法法)。将M-M方程重排为：42/1141.2.4.4 积分法：43/114【例【例2-4】在常温下利用蔗糖酶水解蔗糖，蔗糖初始浓度CS01.0mmol/L，酶初始浓度CE0=0.01mmol/L，在试验室反应器内进行分批式操作，测定以下表中前两行数据。试确定可否用米氏方程来描述该反应速率，若能够，求km和k+2t/h1234567891011CSmmol/L0.840.680.530.380.270.160.090.040.0180.0060.0051.0901.2051.3511.5611.7942.1822.6463.3534.0915.1476.0066.2506.2506.3836.4526.8497.1437.6928.3339.16510.0611.02844/114解：首先将米氏方程转换为：其中：积分得：45/114由已知数据计算和结果画图，若方程与数据符合，应为直线。其斜率k1=k+2/Km，k2=-1/Km。由图能够看出，已知数据能够用米氏方程来描述该反应。直线斜率等于1，截距等于-5.08，即Km=0.197mmol/L，k+2=19.7/h46/114实际酶促反应中，往往关心反应时间与底物转化率关系。当t=0时，CS=CS047/11448/11449/11450/114【例2-5】将底物和酶加入到分批式反应器中，经反应，底物转化率为90%，空时为多少？已知反应速率方程式为：酶浓度为0.001mol/L，底物浓度为2mol/L。空时：底物在反应器中停留时间。空时：底物在反应器中停留时间。空速：空时倒数，又称稀释率。空速：空时倒数，又称稀释率。51/114解：52/114当底物转化率为90%时，53/1141.3 有抑制酶催化反应动力学有抑制酶催化反应动力学 实际情况：底物浓度过高反使反应速率下降；因为外源化合物存在，使得反应速率下降；有些反应，当产物浓度到达一定值后会使反应速率下降。这些情况就是所谓抑制作用。这些情况就是所谓抑制作用。54/114不可逆抑制不可逆抑制：假如抑制剂与酶基团成共价结合，则此时不能用物理方法去掉抑制剂。这类抑制可使酶永久性地失活。比如：重金属离子对木瓜蛋白酶抑制作用。可逆抑制：可逆抑制：可用诸如透析等物理方法把抑制剂去掉而恢复酶活性，此时酶与抑制剂结合存在着解离平衡关系。包含：竞争竞争性抑制，非竞争性抑制，反竞争性抑制，性抑制，非竞争性抑制，反竞争性抑制，混合型抑制，底物抑制和产物抑制。混合型抑制，底物抑制和产物抑制。抑抑制制作作用用抑制剂对酶促反应速率影响抑制剂对酶促反应速率影响55/114若在反应体系中存在有与底物结构相类似物质，该物质也能在酶活性部位上结合，从而妨碍了酶与底物结合，使酶催化底物反应速率下降。这种抑制称为竞争性抑制，该物质称为竞争性抑制剂。1.3.1 竞争性抑制动力学竞争性抑制动力学56/114 抑制剂与底物竞争酶活性部位，当抑制剂与酶活性部位结合之后，底物就不能再与酶结合，反之亦然。在琥珀酸脱氢酶催化琥珀酸为延胡索酸时，丙二酸是其竞争性抑制剂。竞争性抑制主要特点：竞争性抑制主要特点：57/114 竞争性抑制EIS58/114竞争性抑制反应机理：59/114采取稳态法推导动力学方程：60/114解方程组，得：式中:61/114令可可变变形形为为:62/114能够看出，竞争性抑制动力学主要特点是米氏常数值改变，rmax不受竞争性抑制剂影响。因为有抑制剂存在，须有较高基质浓度，才能维持一定rmax值。KI抑制剂解离常数（mol/l）Km有竞争性抑制时米氏常数（mol/l）63/114抑制程度取决于CS，CI，Km和Km，当CI增加，或KI减小，都会使Km值增大，使酶与底物结合能力下降，活性复合物降低，因而使底物反应速率下降。若CI不变，增加CS，抑制程度降低；若CS不变，增加CI，抑制程度增加。在一定CS和CI条件下，KI值越低，抑制程度越大。竞争性抑制动力学主要特点：64/114竞争性抑制Cs-r关系图65/114竞争性抑制双倒数方程式66/114竞争性抑制L-B图67/114抑制剂解离常数由此可看出，KI愈小，表明抑制剂与酶结协力愈强，对酶催化反应能力抑制作用就越强。68/114以Km对CI作图，据此图可求出Km和KI值 69/114例2-6：在一定酶浓度、pH和温度条件下，没有抑制剂时，酶催化反反应速率为r0；当抑制剂浓度为510-3M时，酶反应速率为rsI，底物浓度与对应反应结果以下表，求Km、Km、rmax值。1.251.000.750.50r0(任意单位)15113811893rsI(任 意 单位)83.972.458.841.970/114解：依据数据作图。71/114有抑制剂时，抑制作用为竞争性抑制。72/114若抑制剂能够在酶活性部位以外与酶相结合，而且这种结合与底物结合没有竞争关系，这种抑制称为非竞争性抑制。1.3.2 非竞争性抑制动力学非竞争性抑制动力学73/114 抑制剂既可与游离酶相结合，也能够与复合物ES相结合，生成了底底物物酶酶抑抑制制剂剂复合物SEI。绝大多数情况是复合物SEI为一无催化活性端点复合物，不能分解为产物，即使增大底物浓度也不能解除抑制剂影响。还有一个是三元复合物SEI也能分解为产物，但对酶催化反应速率依然产生了抑制作用。如核苷对霉菌酸性磷酸酯酶抑制属于非竞争性抑制。非竞争性抑制特点非竞争性抑制特点74/114非竞争性抑制ESI75/114非竞争性抑制反应机理非竞争性抑制反应机理76/114稳态法推导动力学方程：稳态法推导动力学方程：77/114解方程组，得解方程组，得式中式中:78/114可可变变形形为为:令79/114对非竞争性抑制，因为抑制剂作用使最大反应速率降低了 倍，而且增加CI、KI减小都使其抑制程度增加。此时rS对CS关系如图。80/114以 作图，可得一直线，并求出Km和 rmax值。依据LB作图法，上式可整理成81/11482/114又依据式可经过试验测得不一样CI下rmax，进而确定KI值。83/114 竞争性抑制，伴随底物浓度增大，抑制剂影响可减弱；非竞争性抑制，即使增大底物浓度也不能减弱抑制剂影响。从这个意义上说，竞争性抑制作用是可逆，非竞争性抑制作用是不可逆。非竞争性抑制与竞争性抑制主要不一样点非竞争性抑制与竞争性抑制主要不一样点：84/114反竞争性抑制特点是抑制剂不能直接与游离酶相结合，而只能与复合物ES相结合生成SEI复合物。1.3.3 反竞争性抑制动力学反竞争性抑制动力学85/114反竞争性抑制反应机理反竞争性抑制反应机理86/114据拟稳态假设和物料平衡，经整理后可得其速率方程为式中：87/114以 rS 对CS作图88/114据LB作图法，方程为89/114直线斜率为与纵坐标交点为与横坐标交点为在不一样CI浓度下得一系列平行线。90/114线形混合型最简单机制可表示为：1.3.4 线性混合型抑制动力学线性混合型抑制动力学91/114 以上基本上与非竞争性抑制模型相同，不一样是，当EI与S结合生成SEI时，因为抑制剂存在影响了EI与S结合，因而其解离常数由KS变为 ，一样ES与I结合时，其解离常数由KI变 为 。92/114上式中：依据上述机理式，可推出其速率方程为93/114对此种抑制，式中 为KS和KI修正系数。当 ，时，上述抑制实为非竞争性抑制。94/114例2-7：某酶Km值为4.710-5 mol/L，假如rmax值为2.210-5mol/Lmin，在底物浓度为210-4mol/L和在（1）竞争性抑制剂与（2）非竞争性抑制剂浓度均为510-4mol/L情况下，其反应速率分别为多大？假定在上述情况下KI值均为310-4mol/L，则在上述两种抑制情况下抑制程度各有多大？95/114解：（1）对竞争性抑制，可列出下式 96/114（2）对非竞争性抑制，可列出下式 mol/Lmin 97/114（3）求抑制程度当无抑制剂存在时反应速率为mol/Lmin98/114所以上述两种抑制抑制程度应分别为 竞争性抑制非竞争性抑制99/114酶促反应中，有时随产物浓度提升，产物与酶形成复合物，妨碍了底物与酶结合，从而降低了酶促反应速度。1.3.5 产物抑制产物抑制100/114反应机理：其中EP为无活性端点复合物101/114稳态法推导动力学方程稳态法推导动力学方程:102/114解方程组解方程组,得：得：式中式中:称为产物抑制解离常数。103/114与无抑制相比较，最大反应速率值rmax不变，米氏常数增大了 倍，同竞争性抑制一样，使反应速率下降。104/114 对于一些酶促反应，当底物浓度较高时，反应速率呈下降趋势，称为底物抑制。1.3.6 1.3.6 底物抑制底物抑制105/114底物抑制反应机理：底物抑制反应机理：106/114快速平衡法推导动学方程：快速平衡法推导动学方程：107/114解方程组解方程组,得：得：式中式中:KSS为底物抑制解离常数mol/l108/114当底物抑制时，r与CS关系表示在图中。109/114速率曲线有一最大值，即为最大底物消耗速率。相对应底物浓度值可经过下式求出。在点（）处可微分且有极值，则 为最正确底物浓度 110/1141.4 影响酶催化反应原因影响酶催化反应原因内部原因内部原因：包含酶结构特征和底物结构特征。外部原因：外部原因：包含各种物质浓度原因（比如酶浓度、底物和产物浓度、抑制剂浓度等）和操作条件(如：温度、压力、离子强度、pH值等）。111/114内部原因是由反应体系所决定，这不是本门课程讨论内容。本节重点讨论对酶催化反应速率最显著两个原因，即 PH值和温度。对酶促反应影响有两方面含义：(1)酶稳定性影响(2)对酶活性影响112/1141.4.1 pH影响影响 酶分子上有许多酸性和碱性氨基酸侧链基团，假如酶 要表示其活性，则这些基团必须有一定解离型式。伴随pH改变，这些基团可处于不一样解离状态，而含有催化活性离子基团仅是其中一个特定解离形式，因而伴随pH值改变，含有催化活性这种特殊离子基团在总酶量中所占百分比就会不一样，因而使酶所含有催化能力也不一样。113/1141.4.2 温度影响温度影响对于酶反应，只有在较低温度范围内，其反应速率才会随温度提升而加紧，超出某一温度，即酶被加热到生理许可温度以上，酶就会失活，反应速率反而随温度提升而下降。酶热稳定性和酶操作稳定性。114/114