亲和层析技术.pdf

1亲和层析技术亲和层析技术亲和层析技术亲和层析技术主要内容：主要内容：1亲和层析原理2亲和吸附剂3亲和层析实验方法-溴化氰活化4亲和层析过程中的注意事项-5亲和层析优缺点6亲和层析的应用亲和层析原理亲和层析原理生物分子间存在很多特异性的相互作用，它们之间都能够专一而可逆的结合，这种结合力就称为亲和力。亲和层析就是通过将具有亲和力的两个分子中一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化。被固定在基质上的分子称为配体，配体和基质是共价结合的，构成亲和层析的固定相，称为亲和吸附剂。亲和层析时首先选择与待分离的生物大分子有亲和力物质作为配体，并将配体共价结合在适当的不溶性基质上。将制备的亲和吸附剂装柱平衡，当样品溶液通过亲和层析柱的时候，待分离的生物分子就与配体发生特异性的结合，从而留在固定相上；而其它杂质不能与配体结合，仍在流动相中，并随洗脱液流出，这样层析柱中就只有待分离的生物分子。通过适当的洗脱液将其从配体上洗脱下来，就得到了纯化的待分离物质。亲和吸附剂亲和吸附剂选择并制备合适的亲和吸附剂是亲和层析的关键步骤之一。它包括基质和配体的选择、基质的活化、配体与基质的偶联等等。基质基质基质的性质基质的性质基质构成固定相的骨架，亲和层析的基质应该具有以下一些性质：1.1.具有较好的物理化学稳定性。在与配体偶联、层析过程中配体与待分离物结合、以及洗脱时的 pH、离子强度等条件下，基质的性质都没有明显的改变。2.2.能够和配体稳定的结合。亲和层析的基质应具有较多的化学活性基团，通过一定的化学处理能够与配体稳定的共价结合，并且结合后不改变基质和配体的基本性质。3.3.基质的结构应是均匀的多孔网状结构。以使被分离的生物分子能够均匀、稳定的通透，并充分与配体结合。基质的孔径过小会增加基质的排阻效应，使被分离物与配体结合的机率下降，降低亲和层析的吸附容量。所以一般来说，多选择较大孔径的基质，以使待分离物有充分的空间与配体结合。4.4.基质本身与样品中的各个组分均没有明显的非特异性吸附，不影响配体与待分离物的结合。基质应具有较好的亲水性，以使生物分子易于靠近并与配体作用。一般纤维素以及交联葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺、多孔玻璃珠等用于凝胶排阻层析的凝胶都可以作为亲和层析的基质，其中以琼脂糖凝胶应用最为广泛。纤维素价格低，可利用的活性基团较多，但它对蛋白质等生物分子可能有明显的非特异性吸附作用，另外它的稳定性和均一性也较差。交联葡聚糖和聚丙烯酰胺的物理化学稳定性较好，但它们的孔径相对比较小，而且孔径的稳定性不好，可能会在与配体偶联时有较大的降低，不利待分离物与配体充分结合，只有大孔径型号凝胶可以用于亲和层析。多孔玻璃珠的特点是机械强度好，化学稳定性好。但它可利用的活性基团较少，对蛋白质等生物分子也有较强的吸附作用。琼脂糖凝胶则基本可以较好的满2足上述四个条件，它具有非特异性吸附低、稳定性好、孔径均匀适当、宜于活化等优点，因此得到了广泛的应用。琼脂糖凝胶微球的商品名为 Sepharose，含糖浓度为 2%、4%、6%时分别称为 2B、4B、6B。因为 Sepharose 4B 的结构比 6B 疏松，而吸附容量比 2B 大，所以 4B应用最广。基质的活化基质的活化基质的活化是指通过对基质进行一定的化学处理，使基质表面上的一些化学基团转变为易于和特定配体结合的活性基团。配体和基质的偶联，通常首先要进行基质的活化。多糖基的活化多糖基的活化多糖基质尤其是琼脂糖是一种常用的基质。琼脂糖通常含有大量的羟基，通过一定的处理可以引入各种适宜的活性基团。琼脂糖的活化方法很多，下面介绍一些常用的活性基团及活化方法。溴化氰活化溴化氰活化溴化氰活化法是常用的活化方法之一，活化过程主要是生成亚胺碳酸活性基团，它可以和伯氨基（NH2）反应，主要生成异脲衍生物。溴化氰活化的基质可以在温和的条件下与配体结合，结合的配体量大。利用溴化氰活化的基质通过进一步处理还可以得到很多其它的衍生物。这种方法的缺点是溴化氰活化法的基质和配体偶联后生成的异脲衍生物中氨基的 pKa10.4，所以通常会带一定的正电荷，从而使基质可能有阴离子离子交换作用，增大了非特异性吸附，影响亲和层析的分辨率。另外溴化氰活化的基质与配体结合不够稳定，尤其是当与小配体结合时，可能会出现配体脱落现象。另外溴化氰有剧毒、易挥发，所以操作不便。环氧乙烷基活化环氧乙烷基活化这类方法活化后的基质都含有环氧乙烷基。如在含有 NaBH4 的碱性条件下，1，4丁二醇双缩水甘油醚的一个环氧乙烷基可以与羟基反应，而将另一个环氧乙烷基结合在基质上。另外也可以用环氧氯丙烷活化，将环氧乙烷基结合在基质上。这种活化方法的优点是活化后不引入电荷基团，而且基质与配体形成的 NC、OC 和 SC 键都很稳定，所以配体与基质结合紧密，亲和吸附剂使用寿命长，而且便于在亲和层析中使用较强烈的洗脱手段，另外这种处理方法没有溴化氰的毒性。它的缺点是用环氧乙基活化的基质在与配体偶联时需要碱性条件，pH 为 913，温度为 2040?C。这样的条件对于一些比较敏感的配体可能不适用。上面两种方法是比较常用的方法，另外还有很多种活化方法如：N羟基琥珀酰亚胺（NHS）活化、三嗪（triazine）活化、高碘酸盐（periodate）活化、羰酰二咪唑（carbonyldiimidazole）活化、2,4,6三氟 5氯吡啶（FCP）活化、乙二酸酰肼（adipic acid dihydrazide）活化、二乙烯砜（divinylsulfone）活化等，总之，目前对基质的活化方法很多，各有其特点，应根据实际需要选择适当的活化方法。聚丙烯酰胺的活化聚丙烯酰胺的活化聚丙烯酰胺凝胶有大量的甲酰胺基，可以通过对甲酰胺基的修饰而对聚丙烯酰胺凝胶进行活化。一般有以下三种方式：氨乙基化作用、肼解作用和碱解作用。另外在偶联蛋白质配体时也通常用戊二醛活化聚丙烯酰胺凝胶。多孔玻璃珠的活化多孔玻璃珠的活化对于多孔玻璃珠等无机凝胶的活化通常采用硅烷化试剂与玻璃反应生成烷基胺玻璃，在多孔玻璃上引进氨基，再通过这些氨基进一步反应引入活性基团，与适当的配体偶联。间隔臂分子间隔臂分子在亲和层析中，由于配体结合在基质上，它在与待分离的生物大分子结合时，很大程度上要受到基质和待分离的生物大分子间的空间位阻效应的影响。尤其是当配体较小或待分离的生物大分子较大时，由于直接结合在基质上的小分子配体非常靠近基质，而待分离的生物大分子由于受到基质的空间障碍，使得其与配体结合的部位无法接近配体，影响了待分离的3生物大分子与配体的结合，造成吸附量的降低。解决这一问题的方法通常是在配体和基质之间引入适当长度的“间隔臂”，即加入一段有机分子，使基质上的配体离开基质的骨架向外扩展伸长，这样就可以减少空间位阻效应，大大增加配体对待分离的生物大分子的吸附效率。加入手臂的长度要恰当，太短则效果不明显；太长则容易造成弯曲，反而降低吸附效率。引入间隔臂分子常用的方法是将适当长度的氨基化合物 NH2(CH2)n R 共价结合到活化的基质上，R 通常是氨基或羧基，n 一般为 212。例如Pharmacia 公司生产的 AHSepharose4B 和 CHSepharose 4B 就是分别将 1,6乙二胺，6氨基乙酸与 CNBr 活化的琼脂糖反应引入间隔臂分子。二者的末端分别为氨基或羧基，通过碳二亚胺的缩合作用可以分别与含羧基或氨基的配体偶联。另外也可以通过进一步的活化处理，生成 N羟基琥珀酰亚胺酯、环氧基等活性基团直接与各种配体偶联。引入间隔臂的基质与配体结合时，配体就可以离开基质一定的空间，从而可以减少空间位阻效应，易于与待分离物质结合。配体配体配体的性质配体的性质亲和层析是利用配体和待分离物质的亲和力而进行分离纯化的，所以选择合适的配体对于亲和层析的分离效果是非常重要的。理想的配体应具有以下一些性质：1.1.配体与待分离的物质有适当的亲和力。亲和力太弱，待分离物质不易与配体结合，造成亲和层析吸附效率很低。而且吸附洗脱过程中易受非特异性吸附的影响，引起分辨率下降。但如果亲和力太强，待分离物质很难与配体分离，这又会造成洗脱的困难。总之，配体和待分离物质的亲和力过弱或过强都不利于亲和层析的分离。应根据实验要求尽量选择与待分离物质具有适当的亲和力的配体。2.2.配体与待分离的物质之间的亲和力要有较强的特异性，也就是说配体与待分离物质有适当的亲和力，而与样品中其它组分没有明显的亲和力，对其它组分没有非特异性吸附作用。这是保证亲和层析具有高分辨率的重要因素。3.3.配体要能够与基质稳定的共价结合，在实验过程中不易脱落，并且配体与基质偶联后，对其结构没有明显改变，尤其是偶联过程不涉及配体中与待分离物质有亲和力的部分，对二者的结合没有明显影响。4.4.配体自身应具有较好的稳定性，在实验中能够耐受偶联以及洗脱时可能的的较剧烈的条件，可以多次重复使用。完全满足上述条件的配体实际上很难找到，在实验中应根据具体的条件来选择尽量满足上述条件的最适宜的配体。根据配体对待分离物质的亲和性的不同，可以将其分为两类：特异性配体（specific ligand）和通用性配体（general ligand）。特异性配体一般是指只与单一或很少种类的蛋白质等生物大分子结合的配体。如生物素和亲和素、抗原和抗体、酶和它的抑制剂、激素受体等，它们结合都具有很高的特异性，用这些物质作为配体都属于特异性配体。配体的特异性是保证亲和层析高分辨率的重要因素，但寻找特异性配体一般是比较困难的，尤其对于一些性质不很了解的生物大分子，要找到合适的特异性配体通常需要大量的实验。解决这一问题的方法是使用通用性的配体。通用性配体一般是指特异性不是很强，能和某一类的蛋白质等生物大分子结合的配体，如各种凝集素（lectine）可以结合各种糖蛋白，核酸可以结合 RNA、结合 RNA 的蛋白质等。通用性配体对生物大分子的专一性虽然不如特异性配体，但通过选择合适的洗脱条件也可以得到很高的分辨率。而且这些配体还具有结构稳定、偶联率高、吸附容量高、易于洗脱、价格便宜等优点，所以在实验中得到了广泛的应用。配体与基质的偶联除了前面已经介绍了基质的一些活化基团外，通过对活化基质的进一步处理，还可以得到更多种类的活性基团。这些活性基团可以在较温和的条件下与含氨基、羧基醛基、酮基、羟基、硫醇基等多种配体反应，使配体偶联在基质上。另外通过碳二亚胺、4戊二醛等双功能试剂的作用也可以使配体与基质偶联。以上这些方法使得几乎任何一种配体都可以找到适当的方法与基质偶联。关于配体和基质偶联的具体实验操作可以参阅本书后面的实验部分或相应的参考文献。配体和基质偶联完毕后，必须要反复洗涤，以去除未偶联的配体。另外要用适当的方法封闭基质中未偶联上配体的活性基团，也就是使基质失活，以免影响后面的亲和层析分离。例如对于能结合氨基的活性基团，常用的方法是用 2乙醇胺、氨基乙烷等小分子处理。配体与基质偶联后，通常要测定配体的结合量以了解其与基质的偶联情况，同时也可以推断亲和层析过程中对待分离的生物大分子吸附容量。配体结合量通常是用每毫升或每克基质结合的配体的量来表示。测定配体结合量的方法很多，下面简单介绍几种：1.1.差量分析：根据加入配体的总量减去配体与基质偶联后洗涤出来的量即可大致推算出配体的结合量。当配体可以用光谱法准确定量时，这种方法还是相当准确的。2.2.直接光谱测量：对于能够吸收 250nm 以上波长的配体，可以直接用光谱法测定与基质结合的配体的量。3.3.凝胶溶解：通过适当的方法将凝胶溶解，如 75?C 下与酸或碱作用，而后直接用光谱法测量。4.4.酸或酶的水解：用酸或酶作用，使得基质释放出配体或配体的裂解物进行分析。5.5.2,4,6三硝基苯磺酸钠（TNBS）分析：利用 TNBS 与未结合配体和结合某些配体的基质作用呈现不同的颜色，可以计算出配体结合量。6.元素分析：如果配体中含有某种特别的元素，通过元素分析就可以确定配体结合量。7.7.放射性分析法：偶联中加入一定量带有同位素的配体，通过放射性分析确定配体结合量，这是一种非常灵敏的方法。影响配体结合量的因素很多，包括基质和配体的性质、基质的活化方法及条件、基质和配体偶联反应的条件等等。例如通常溴化氰活化的基质的活性基团比环氧基活化的基质多，配体结合量可能较大。在用溴化氰活化时，增加溴化氰的量及反应的 pH，可以增加基质上活化基团的量，从而增大配体结合量。偶联过程中增加配体的量及增大反应的 pH，也可以增大配体结合量。实验中通常希望配体结合量较高，但应注意增加配体结合量应根据实际情况，还要考虑到其它因素的影响。因为提高配体的结合量不等价于提高亲和吸附剂的吸附容量，配体结合量只是影响亲和吸附剂吸附容量的一个因素，还有很多因素，如基质、配体以及待分离物质本身的性质，配体在基质的结合情况以及后面要介绍的实验操作条件等都可能对亲和吸附剂的吸附容量产生很大的影响。例如增大配体的结合量通常可以增加吸附容量，但有些增大配体结合量的条件可能会影响配体的结构，降低配体和待分离物质的亲和力，这样反而会降低亲和吸附剂的吸附容量。实际影响亲和吸附剂吸附容量的因素是非常复杂的，各种因素的影响都不是绝对的，要获得较高的吸附容量往往要考虑很多因素，并通过实验摸索来选择合适的条件。目前已有多种活化的基质以及偶联各种配体的亲和吸附剂制成商品出售，可以省去基质活化，配体偶联等复杂的步骤。使用方便，效果好，但一般价格昂贵。亲和吸附剂的再生和保存亲和吸附剂的再生和保存亲和吸附剂的再生就是指使用过的亲和吸附剂，通过适当的方法使去除吸附在其基质和配体（主要是配体）上结合的杂质，使亲和吸附剂恢复亲和吸附能力。一般情况下，使用过的亲和层析柱，用大量的洗脱液或较高浓度的盐溶液洗涤，再用平衡液重新平衡即可再次使用。但在一些情况下，尤其是当待分离样品组分比较复杂的时候，亲和吸附剂可能会产生较严重的不可逆吸附，使亲和吸附剂的吸附效率明显下降。这时需要使用一些比较强烈的处理手段，使用高浓度的盐溶液、尿素等变性剂或加入适当的非专一性蛋白酶。但如果配体是蛋白质等一些易于变性的物质，则应注意处理时不能改变配体的活性。5亲和吸附剂的保存一般是加入 0.01%的叠氮化钠，4下保存。也可以加入 0.5%的醋酸洗必泰或 0.05%的苯甲酸。应注意不要使亲和吸附剂冰冻。亲和层析实验方法亲和层析实验方法-溴化氰活化溴化氰活化亲和层析的实验操作和一般柱层析类似，都包括：装柱、上样、洗脱、样品收集、结果处理等步骤。溴化氰活化琼脂糖用于配体固相化是实验室亲和层析最常用的技术之一，该方法简便廉价，并广泛应用于蛋白质、核酸、凝集素等。下面以此为例介绍亲和层析的实验方法：试剂与配制试剂与配制1.Sepharose 4B2.CNBr（剧毒）3.抗原或抗体4.1Mol/L NaHCO3 取 NaHCO3 84.01g 加水至 1 000ml。5.0.1Mol/L NaHCO36.2Mol/L NaOH7.0.01mol/L pH7.4 PBS（0.2mol/L Na2HPO4 38.0ml；0.2mol/L Na2HPO4 162.0ml；NaCl32.76g 加水至 4 000ml）。80.1mol/L pH 2.8 甘氨酸即氨基乙酸HCl 缓冲液（甘氨酸 15.01g 加水至 1 000ml，取此液，加 0.2Mol/L HCl 84ml 加水 166ml 共 500ml）。97mol/L 尿素100.2mol/L NaHCO3（含 0.1Mol/L NaCl）（1mol/L NaHCO3 100.00ml，NaCl 2.93g 加水至 500.00ml）。琼脂糖活化琼脂糖活化1.1.取20ml Sepharose 4B放在布氏漏斗中抽干，加少量的0.1Mol/L pH 9.0 NaHCO3液洗涤，立即转入 100ml 烧杯中，冰浴置于磁力搅拌器上。2.2.在通风橱内称取 2g 溴化氰，加水 20ml 溶解，然后倒入琼脂糖中，小心滴加 2Mol/L NaOH,使 pH 保持在 11 左右，反应 10min。在 1min2min 迅速调整 pH 为 8.011.0 维持 10min。3.3.将活化的琼脂糖迅速倒入布氏漏斗中，以冰水抽洗成中性，再迅速以 250ml冷的 0.1Mol/LpH 9.0 NaHCO3 抽洗。4.4.偶联蛋白 20ml 4B 液体相当于一半的固相载体。事先将需偶联的抗原（或抗体）蛋白200mg 置于 0.1Mol/L pH 9.0 NaHCO3 液中透析数小时(一般偶联量为 1030mg/g 载体)。5.5.将活化的琼脂糖迅速倒入蛋白液中（在 1.5min 内，从抽洗到偶联），4缓慢搅拌过夜，使蛋白与活化的琼脂结合。6.6.6.6.在烧结玻璃漏斗中用 200ml偶联缓冲液（0.1mol/L碳酸氢钠，0.5mol/L氯化钠，pH8.3）洗偶联介质一次。7.7.7.7.转移偶联介质至含 100ml 阻断缓冲液（1mol/L 乙醇胺，盐酸调 pH 至 8.0）的烧瓶内，室温孵育 2h 或者4过夜。8.8.8.8.在烧结漏斗中依次用100ml 偶联缓冲液 100乙酸盐缓冲液（0.1mol/L乙酸钠，0.5mol/L氯化钠，pH4.0）洗偶联介质一次，重复此步骤四次。9.9.9.9.如果不准备立即使用偶联介质，影使用含 0.02%叠氮钠的偶联缓冲液再洗一次。装柱装柱1.1.选柱：不宜过大，一般以 1.515cm 的层析柱可装偶联蛋白的琼脂糖约 30ml。2.2.装柱：将已与蛋白偶联的琼脂糖装入层析柱内，拧紧下口夹，让其下沉，数分钟后松开下口夹，使溶液约以 1ml/min 的速度流出。63.3.洗柱：以 0.2mol/L pH 9.0 NaHCO3（含 0.1Mol/L NaCl）洗涤至洗出液的 OD2800.02为止。收集全部的洗脱液，测得的 OD280 值洗脱液的总 ml 数即为未偶联蛋白的含量，由此可计算偶联率。吸附与解吸附吸附与解吸附1.1.按床体积 1/10 加样，浓度为 12%，缓慢加入待纯化的抗体（或抗原），用0.01mol/LpH7.4 PBS 液洗脱，流速为 1ml/min，至洗出液 OD2800.02 为止。2.2.加 0.1mol/L pH2.4 甘氨酸HCl 缓冲液，流速 1ml/min，收集解吸附下来的成分，立即以 1mol/L NaHCO3中和，以免蛋白变性。以两倍体积的 7mol/L 尿素洗涤，再用 0.01mol/L pH 7.4 PB 液或生理盐水洗涤，平衡后，可继续使用。保存可加入 0.02%NaN3于 4保存。防止冷冻和干裂。结果判定结果判定1.1.对解吸附下来的蛋白以圆盘电泳或双相琼脂糖电泳进行纯度鉴定。2.2.将纯度好的各管洗脱液合并，以生理盐水透析，然后浓缩或冻干保存。亲和层析过程中的注意事项亲和层析过程中的注意事项1.1.上样上样亲和层析纯化生物大分子通常采用柱层析的方法。亲和层析柱一般很短，通常 10cm 左右。上样时应注意选择适当的条件，包括上样流速、缓冲液种类、pH、离子强度、温度等，以使待分离的物质能够充分结合在亲和吸附剂上。一般生物大分子和配体之间达到平衡的速度很慢，所以样品液的浓度不易过高，上样时流速应比较慢，以保证样品和亲和吸附剂有充分的接触时间进行吸附。特别是当配体和待分离的生物大分子的亲和力比较小或样品浓度较高、杂质较多时，可以在上样后停止流动，让样品在层析柱中反应一段时间，或者将上样后流出液进行二次上样，以增加吸附量。样品缓冲液的选择也是要使待分离的生物大分子与配体有较强的亲和力。另外样品缓冲液中一般有一定的的离子强度，以减小基质、配体与样品其它组分之间的非特异性吸附。生物分子间的亲和力是受温度影响的，通常亲和力随温度的升高而下降。所以在上样时可以选择适当较低的温度，使待分离的物质与配体有较大的亲和力，能够充分的结合；而在后面的洗脱过程可以选择适当较高的温度，使待分离的物质与配体的亲和力下降，以便于将待分离的物质从配体上洗脱下来。上样后用平衡洗脱液洗去未吸附在亲和吸附剂上的杂质。平衡缓冲液的流速可以快一些，但如果待分离物质与配体结合较弱，平衡缓冲液的流速还是较慢为宜。如果存在较强的非特异性吸附，可以用适当较高离子强度的平衡缓冲液进行洗涤，但应注意平衡缓冲液不应对待分离物质与配体的结合有明显影响，以免将待分离物质同时洗下。2.2.洗脱洗脱亲和层析的另一个重要的步骤就是要选择合适的条件使待分离物质与配体分开而被洗脱出来。亲和层析的洗脱方法可以分为两种：特异性洗脱和非特异性洗脱。（1 1）特异性洗脱特异性洗脱是指利用洗脱液中的物质与待分离物质或与配体的亲和特性而将待分离物质从亲和吸附剂上洗脱下来。特异性洗脱也可以分为两种：一种是选择与配体有亲和力的物质进行洗脱，另一种是选择与待分离物质有亲和力的物质进行洗脱。前者在洗脱时，选择一种和配体亲和力较强的物质加入洗脱液，这种物质与待分离物质竞争对配体的结合，在适当的条件下，如这种物质与配体的亲和力强或浓度较大，配体就会基本被这种物质占据，原来与配体结合的待分离物质被取代而脱离配体，从而被洗脱下来。例如用凝集素作为配体分离糖蛋白时，可以用适当的单糖洗脱，单糖与糖蛋白竞争对凝集素的结合，可以将糖蛋白从凝集素上置换下来。后一种7方法洗脱时，选择一种与待分离物质有较强亲和力的物质加入洗脱液，这种物质与配体竞争对待分离物质的结合，在在适当的条件下，如这种物质与待分离物质的亲和力强或浓度较大，待分离物质就会基本被这种物质结合而脱离配体，从而被洗脱下来。例如用染料作为配体分离脱氢酶时，可以选择 NAD+进行洗脱，NAD+是脱氢酶的辅酶，它与脱氢酶的亲和力要强于染料，所以脱氢酶就会与 NAD+结合而从配体上脱离。特异性洗脱方法的优点是特异性强，可以进一步消除非特异性吸附的影响，从而得到较高的分辨率。另外对于待分离物质与配体亲和力很强的情况，使用非特异性洗脱方法需要较强烈的洗脱条件，很可能使蛋白质等生物大分子变性，有时甚至只能使待分离的生物大分子变性才能够洗脱下来，使用特异性洗脱则可以避免这种情况。由于亲和吸附达到平衡比较慢，所以特异性洗脱往往需要较常的时间和较大的洗脱条件，可以通过适当的改变其它条件，如选择亲和力强的物质洗脱、加大洗脱液浓度等等，来缩小洗脱时间和洗脱体积（2 2）非特异性洗脱非特异性洗脱是指通过改变洗脱缓冲液 pH、离子强度、温度等条件，降低待分离物质与配体的亲和力而将待分离物质洗脱下来。当待分离物质与配体亲和力较小时，一般通过连续大体积平衡缓冲液冲洗，就可以在杂质之后将待分离物质洗脱下来，这种洗脱方式简单、条件温和，不会影响待分离物质的活性。但洗脱体积一般比较大，得到的待分离物质浓度较低。当待分离物质和配体结合较强时，可以通过选择适当的 pH、离子强度等条件降低待分离物质与配体的亲和力，具体的条件需要在实验中摸索。可以选择梯度洗脱方式，这样可能将亲和力不同的物质分开。如果希望得到较高浓度的待分离物质，可以选择酸性或碱性洗脱液，或较高的离子强度一次快速洗脱，这样在较小的洗脱体积内就能将待分离物质洗脱出来。但选择洗脱液的 pH、离子强度时应注意尽量不影响待分离物质的活性，而且洗脱后应注意中和酸碱，透析去除离子，以免待分离物质丧失活性。对于待分离物质与配体结合非常牢固时，可以使用较强的酸、碱或在洗脱液中加入脲、胍等变性剂使蛋白质等待分离物质变性，而从配体上解离出来。然后再通过适当的方法使待分离物质恢复活性。亲和层析优缺点亲和层析优缺点1.1.亲和层析法是分离蛋白质的一种极为有效的方法，它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。2.2.是最有效的生物活性物质纯化方法，它对生物分子选择性的吸附和分离，可以取得很高的纯化倍数。此外蛋白在纯化过程中得到浓缩，结合到亲和配基后，性质更加稳定，其结果提高了活性回收率。此外它可以减少纯化步骤，缩短纯化时间，对不稳定蛋白的纯化十分有利。3.3.除特异性的吸附外，仍然会因分子的错误认别和分子间非选择性的作用力而吸附一些杂蛋白质，另洗脱过程中的配体不可避免的脱落进入分离体系。4.4.载体较昂贵，机械强度低，配基制备困难，有的配基本身要经过分离纯化，配基与载体耦联条件激烈等。亲和层析的应用亲和层析的应用亲和层析的应用主要是生物大分子的分离、纯化。下面简单介绍一些亲和层析技术用于纯化各种生物大分子的情况。1.1.抗原和抗体抗原和抗体利用抗原、抗体之间高特异的亲和力而进行分离的方法又称为免疫亲和层析。例如将抗原结合于亲和层析基质上，就可以从血清中分离其对应的抗体。在蛋白质工程菌发酵液中所需蛋白质的浓度通常较低，用离子交换、凝胶过滤等方法都难于进行分离，而亲和层析则是8一种非常有效的方法。将所需蛋白质作为抗原，经动物免疫后制备抗体，将抗体与适当基质偶联形成亲和吸附剂，就可以对发酵液中的所需蛋白质进行分离纯化。抗原、抗体间亲和力一般比较强，其解离常数为 1081012M，所以洗脱时是比较困难的，通常需要较强烈的洗脱条件。可以采取适当的方法如改变抗原、抗体种类或使用类似物等来降低二者的亲和力，以便于洗脱。另外金黄色葡萄球菌蛋白A（Protein A）能够与免疫球蛋白G（Ig G）结合，可以用于分离各种 Ig G。2.2.生物素和亲和素生物素和亲和素生物素（biotion）和亲和素（avidin）之间具有很强而特异的亲和力，可以用于亲和层析。如用亲和素分离含有生物素的蛋白等。生物素和亲和素的亲和力很强，其解离常数为1015M，洗脱通常需要强类的变性条件，可以选择 biotion 的类似物，如 2-iminobiotin、diiminobiotin 等降低与 avidin 的亲和力，这样可以在较温和的条件下将其从 avidin 上洗脱下来。另外，可以利用生物素和亲和素间的高亲和力，将某种配体固定在基质上。例如将生物素酰化的胰岛素与以亲和素为配体的琼脂糖作用，通过生物素与亲和素的亲和力，胰岛素就被固定在琼脂糖上，可以用于亲和层析分离与胰岛素有亲和力的生物大分子物质。这种非共价的间接结合比直接将胰岛素共价结合与 CNBr 活化的琼脂糖上更稳定。很多种生物大分子可以用生物素标记试剂（如生物素与 NHS 生成的酯）作用结合上生物素，并且不改变其生物活性，这使得生物素和亲和素在亲和层析分离中有更广泛的用途。3.3.维生素、激素和结合转运蛋白维生素、激素和结合转运蛋白通常结合蛋白含量很低，如 1000 升人血浆中只含有 20 毫克 Vit-7-10-B12 结合蛋白，用通常的层析技术难于分离。利用维生素或激素与其结合蛋白具有强而特异的亲和力（解离常数为 1016M）而进行亲和层析则可以获得较好的分离效果。由于亲和力较强，所以洗脱时可能需要较强烈的条件，另外可以加入适量的配体进行特异性洗脱。4.4.激素和受体蛋白激素和受体蛋白激素的受体蛋白属于膜蛋白，利用去污剂溶解后的膜蛋白往往具有相似的物理性质，难于用通常的层析技术分离。但去污剂溶解通常不影响受体蛋白与其对应激素的结合。所以利用激素和受体蛋白间的高亲和力（1061012M）而进行亲和层析是分离受体蛋白的重要方法。目前已经用亲和层析方法纯化出了大量的受体蛋白，如乙酰胆碱、肾上腺素、生长激素、吗啡、胰岛素等等多种激素的受体。5.5.凝集素和糖蛋白凝集素和糖蛋白 D-甲基葡萄糖苷洗脱。同样，用适当的糖蛋白或单糖、多糖作为配体也可以分离各种凝集素。-D-甲基甘露糖苷或-D-吡喃葡萄糖苷的糖蛋白，麦胚凝集素可以特异的与 N-乙酰氨基葡萄糖或 N-乙酰神经氨酸结合，可以用于血型糖蛋白 A、红细胞膜凝集素受体等的分离。洗脱时只需用相应的单糖或类似物，就可以将待分离的糖蛋白洗脱下来。如洗脱伴刀豆球蛋白 A 吸附的蛋白可以用-D-吡喃甘露糖苷或凝集素是一类具有多种特性的糖蛋白，几乎都是从植物中提取。它们能识别特殊的糖，因此可以用于分离多糖、各种糖蛋白、免疫球蛋白、血清蛋白甚至完整的细胞。用凝集素作为配体的亲和层析是分离糖蛋白的主要方法。6.6.辅酶辅酶核苷酸及其许多衍生物、各种维生素等是多种酶的辅酶或辅助因子，利用它们与对应酶的亲和力可以对多种酶类进行分离纯化。例如固定的各种腺嘌呤核苷酸辅酶，包括 AMP、cAMP、ADP、ATP、CoA、NAD+、NADP+等等应用很广泛，可以用于分离各种激酶和脱氢酶。7.7.多核苷酸和核酸多核苷酸和核酸利用 poly-U 作为配体可以用于分离 mRNA 以及各种 poly-U 结合蛋白。poly-A 可以用于分离各种 RNA、RNA 聚合酶以及其它 poly-A 结合蛋白。以 DNA 作为配体可以用于分离各种DNA 结合蛋白、DNA 聚合酶、RNA 聚合酶、核酸外切酶等多种酶类。8.8.氨基酸氨基酸固定化氨基酸是多用途的介质，通过氨基酸与其互补蛋白间的亲和力，或者通过氨基酸9的疏水性等性质，可以用于多种蛋白质、酶的分离纯化。例如 L精氨酸可以用于分离羧肽酶，L赖氨酸则广泛的应用于分离各种 rRNA。9.9.染料配体染料配体结合在蓝色葡聚糖中的蓝色染料 Cibacron Blue F3GA 是一种多芳香环的磺化物。由于它具有与 NAD+相似的空间结构，所以它与各种激酶、脱氢酶、血清清蛋白、DNA 聚合酶等具有亲和力，可以用于亲和层析分离。另外较常用的还有 Procion Red HE3B 等。染料作为配体吸附容量高、可以多次重复使用。但它有一定的阳离子交换作用，使用时应适当提高缓冲液离子强度来减少非特异性吸附。10.10.分离病毒、细胞分离病毒、细胞利用配体与病毒、细胞表面受体的相互作用，亲和层析也可以用于病毒和细胞的分离。利用凝集素、抗原、抗体等作为配体都可以用于细胞的分离。例如各种凝集素可以用于分离红细胞以及各种淋巴细胞，胰岛素可以用于分离脂肪细胞等。由于细胞体积大、非特异性吸附强，所以亲和层析时要注意选择合适的基质。目前已有特别的基质如 Pharmacia 公司生产的 Sepharose 6MB，颗粒大、非特异性吸附小，适合用于细胞亲和层析。11.11.金属螯合色谱金属螯合色谱金属螯合色谱以及后面介绍的共价色谱、疏水色谱是一些特殊的亲和层析技术。金属螯合色谱通常使用亚氨二乙酸（IDA）等螯合剂，它能与 Cu2+、Zn2+、Fe2+等作用，生成带有多个配位基的金属螯合物，可以用于生物分子尤其是对重金属有较强亲和力的蛋白质的分离纯化。例如 Cu2+IDA 配体可以用于分离带精氨酸的蛋白质。12.12.共价色谱共价色谱共价色谱与常规的亲和色谱方法不同之处在于它是利用亲和吸附剂与待分离的蛋白质的共价结合而将其吸附，而后用适当的处理方法将共价键打开而将蛋白释放出来。例如活化的巯基Sepharose、巯丙基Sepharose 等活化基质可以直接与含巯基的蛋白质通过二硫键共价结合而将其吸附在基质上，通过适当的洗脱液如半胱氨酸，巯基乙醇等还原二硫键即可将蛋白质洗脱下来。共价色谱结合和洗脱条件一般都很温和，可以多次重复使用。