贝莱斯芽孢杆菌的鉴定和抑菌作用研究.pdf

贝莱斯芽孢杆菌的鉴定和抑菌作用研究周淑贞1，辜质纯1，张瑞雪2，廖洁丹3，谢志恒1，张悻2，顾万军3，黄良宗3*（1.佛山市南海东方澳龙制药有限公司，广东 佛山 528234；2.佛山市南海区维德生物技术有限公司，广东 佛山 528234；3.佛山科学技术学院 生命科学与工程学院，广东 佛山 528231）摘 要：该研究对6株贝莱斯芽孢杆菌分离株进行测序鉴定、药敏试验与抑菌试验。结果表明：所分离的6株菌16S rDNA序列与贝莱斯芽孢杆菌处于同一遗传进化树分支，对选定的7种抗菌药物均敏感。应用指示菌进行抑菌试验，6株菌及其代谢产物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均有抑菌作用，抑菌作用从强到弱依次是：贝莱斯芽孢杆菌菌液、上清液和菌液滤液。关键词：贝莱斯芽孢杆菌；鉴定；抑菌试验中图分类号：S815.1文献标识码：A文章编码：10058567（2023）04003005Identification and Antimicrobial Test of Bacillus VelezensisZHOU Shuzhen1，GU Zhichun1，ZHANG Ruixue2，LIAO Jiedan3，XIE Zhiheng1，ZHANG Xing2，GU Wanjun3，HUANG Liangzong3*（1.Eastern Along Pharmaceutical Co.，Ltd.，Nanhai，Foshan Guangdong 528234；2.Foshan Nanhai District Weide BioTechnology Co.，Ltd，Guangdong 528234；3.Foshan University School of Life Science and Engineering，Guangdong 528231）Abstract：In this study,sequencing identification，drug sensitivity testing，and antibacterial assays wereconducted on six Bacillus velezensis strains isolated from diverse sources.The results indicated that the 16S rDNAsequences of these six isolates were positioned within the same genetic evolutionary branch of Bacillus velezensis，andsensitivity to seven selected antimicrobial drugs was exhibited.Bacteriostatic effects against both Staphylococcusaureus and Escherichia coli were demonstrated for the six strains and their metabolites.The bacteriostatic intensity ofthe samples followed the order of Bacillus velezensis liquid,supernatant，and filtrate.Keywords：Bacillus velezensis；Identification；Antibacterial test收稿日期：20211118基金项目：广东省现代草牧业（羊）产业技术体系项目（2019KJ127）作者简介：周淑贞（1980年生），女，高级兽医师，主要从事新兽药研发。Email：*通讯作者：黄良宗（1978年生），男，副教授，硕士生导师，主要从事猪传染病诊断与防治。Email：芽孢杆菌是一种公认的可以产生细菌素的细菌，而贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）属于芽孢杆菌属的一个新种，在抑制病原菌和生物防治方面具有显著的优点，因此目前引起业界的广泛关注12。贝莱斯芽孢杆菌在自然界中分布广泛，具有稳定、生长快速等特性，易于分离和培养，对人类和动物无害，对环境友好。其代谢产物丰富，具有广谱抗菌活性和较强的抗应激能力，在农业、环境和发酵工业等许多领域发挥着越来越重要的作用34。试验研究广东畜牧兽医科技广东畜牧兽医科技2023年（第48卷）第4期Guangdong Journal of Animal And Veterinary ScienceDOI:10.19978/ki.xmsy.2023.04.06 30芽孢杆菌可以通过核糖体途径合成小分子抑菌物质如细菌素，也可以通过非核糖体途径合成多肽类抑菌物质如脂肽类化合物5。细菌素、脂肽类物质因具有稳定的理化性质、广谱的抗菌性以及不易产生耐药性等优点备受医药、农业等领域的青睐，已成为生物防治研究的重点6。近年来，国内外有关贝莱斯芽孢杆菌的报道越来越多，研究主要集中在促进动植物生长、拮抗植物病原菌、诱导植物系统抗性、抑菌物质及基因簇鉴定、拮抗作用机制等方面。贝莱斯芽孢杆菌能够分泌多种次级代谢产物，部分代谢产物具有抑菌和杀菌作用7。贝莱斯芽孢杆菌也是一种促进植物生长的细菌，还可以抑制植物病原体810。研究发现从不同来源分离的不同贝莱斯芽孢杆菌可以产生抗菌化合物并对肠道菌群产生有益的影响，贝莱斯芽孢杆菌有可能成为动物饲料工业中的益生菌11。体外抑菌实验结果显示，贝莱斯芽孢杆菌LF01 菌株拮抗物质冻干粉对嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、无乳链球菌和海豚链球菌的最小抑菌浓度分别为64、64、64 和 32 g/mL，此实验中贝莱斯芽孢杆菌表现出较强的抑菌活性，提示该菌拮抗物质在水产动物细菌性病害防控方面具有替代传统抗生素的潜力12。本文以近几年从不同环境和益生菌产品中分离到的6株贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis 01、02、03、04、05、06）为素材，进行序列测定、药敏试验和抑菌作用比较分析，为贝莱斯芽孢杆菌在动物益生菌菌种的开发应用及其抑菌代谢产物研究应用奠定基础。1材料与方法1.1材料LB 培养基（g/L）：葡萄糖 10，酵母粉 5，NaCl10，蛋白胨 10，琼脂 17（固体培养基添加），121，20 min灭菌，备用。细菌生化反应试剂购自广东环凯微生物科技有限公司。药敏实验纸片购自赛默飞世尔（中国）科技有限公司。指示菌：大肠杆菌（K12D31）、金黄色葡萄球菌（ATCC 29213）来自中国微生物菌种保藏管理中心。供试贝莱斯芽孢杆菌分离株，通过对 16SrDNA 基因测序，并与 GenBank 数据库序列进行BLAST比对鉴定；其命名见表1。1.2方法1.2.1指示菌培养将金黄色葡萄球菌和大肠杆菌分别接种于LB培养基，37，振摇（120 r/min）培养16 h，取出，置4，备用。1.2.2贝莱斯芽孢杆菌培养将贝莱斯芽孢杆菌菌株应用普通琼脂平板分离培养，挑取典型菌落，接种于LB培养基，37，振摇（120 r/min）培养24 h，取出菌液，置4，备用。上清液制备：取菌液1 mL加入离心管，10000rpm离心10 min，取上清液，置4，备用。滤过液制备：取上清液1 mL，以0.45 m滤器过滤，收集过滤液，置4，备用。1.2.3贝莱斯芽孢杆菌送检样品制备将贝莱斯芽孢杆菌菌株应用普通琼脂平板分离培养，将纯化菌用接种环刮取到2 mL含有LB肉汤的EP管，贝莱斯芽孢杆菌基因组DNA抽提和16S rDNA 测序由广州艾基生物技术有限公司完成。1.2.4生化鉴定挑取待检菌落进行革兰染色镜检，将新鲜菌苔接种于普通肉汤中37 培养1824 h，用无菌生理盐水稀释至108cfu/mL，吸取50 L肉汤培养物或菌悬液加入各种微量西林瓶内。将已接种的西林瓶再套上胶塞，放置于合适的瓶架中，于37 表1供试贝莱斯芽孢杆菌的来源与序列文件名菌株序号贝莱斯芽孢杆菌 01贝莱斯芽孢杆菌 02贝莱斯芽孢杆菌 03贝莱斯芽孢杆菌 04贝莱斯芽孢杆菌 05贝莱斯芽孢杆菌 06分离来源土壤环境乌龟池底泥仙溪湖底泥养鱼池沉淀物益生菌产品益生菌产品菌株序列文件名BvelezensisE06.01B.velezensisF11.02BvelezensisD01.03BvelezensisF12.04BvelezensisC12.05BvelezensisF10.06分离鉴定时间2021年3月2017年2月2018年7月2019年7月2019年12月2019年12月贝莱斯芽孢杆菌的鉴定和抑菌作用研究周淑贞，等试验研究 31培养箱中培养，鉴定结果判定参照试剂说明书。1.2.5药敏试验试验采用平皿药敏试纸片扩散法进行药敏试验。将贝莱斯芽孢杆菌纯培养物接种到试验培养基上，再将药敏纸片贴附到培养基表面。37，培养24 h，测量纸片周围的抑菌环，测量抑菌圈直径，记录结果，判定贝莱斯芽孢杆菌对抗菌药物的敏感性。1.2.6抑菌试验取熔化后冷却至5060 LB琼脂，取指示菌液，每平皿加20 L，充分混匀，浇注平板，放在有对流的无菌净化台中吹干培养基表面凝集水，备用。菌液的抑菌试验采用滤纸片法：取直径6 mm经灭菌（121、20 min）的干燥滤纸片，按预设位置贴附培养基表面，取10 L测试菌液，滴加于贴附指示菌平皿表面滤纸片上，并设强力霉素药敏片（金黄色葡萄球菌指示菌平板）和培养基作对照（大肠杆菌指示菌平板），每株菌试验样品做3皿次重复，置37，1824 h后取出，用游标卡尺计量抑菌圈直径，记录结果。上清液和滤过液抑菌试验，在同一指示菌平皿进行，采用琼脂扩散法。按预设位置，以直径5 mm打孔器打孔，挑出孔内琼脂，取被测菌液50 L，滴加于孔内，加满不溢出为度，其他与滤纸片法相同。抑菌结果的判定参照抗菌药物敏感性试验性能标准（2021），根据抑菌圈直径（mm）判定抑菌强度13。0 判定为“-”；10 以下为“+”；1014 为“+”；1520为“+”；20以上为“+”。2结果2.1贝莱斯芽孢杆菌16S rDNA进化树将6株贝莱斯芽孢杆菌分离株16S rDNA序列与 GenBank 数据库进行 BLAST 分析并构建进化树，见图1。分析表明：所分离的6株菌均与贝莱斯芽孢杆菌处于同一进化树分支，确认均为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）。2.2生化试验结果6株贝莱斯芽孢杆菌生化试验结果，见表2。结果表明：6株贝莱斯芽孢杆菌的生化试验结果符合芽孢杆菌特性，但各菌株间细菌生化反应略有不同。2.3药敏试验选择阿米卡星（AK）、青霉素（P）、阿莫西林（AML）、强力霉素（DO）、恩诺沙星（ENR）、头孢曲松（CRO）和磺胺甲恶唑/甲氧嘧啶（SXT）7种常用药物，对6株贝莱斯芽孢杆菌进行药敏试验，结果见表3。结果表明：6株贝莱斯芽孢杆菌对7种常用的代表性药物均在敏感水平。图16株贝莱斯芽孢杆菌分离株的遗传进化树表26株贝莱斯芽孢杆菌生化反应鉴定结果鉴定项目/菌株序号葡萄糖半乳糖麦芽糖甘露醇蔗糖山梨醇木糖鼠李糖阿拉伯糖D核糖纤维二糖水解淀粉6.5%高盐肉汤丙二酸盐产生 H2S鞭毛运动性1W-W-W不生长-2WWWW-不生长-3-W-生长-4W-不生长-5-W-W-生长-6-W-不生长-注：“”阳性反应；“-”阴性反应；“W”弱阳性反应。试验研究贝莱斯芽孢杆菌的鉴定和抑菌作用研究周淑贞，等 32贝莱斯芽孢杆菌的鉴定和抑菌作用研究周淑贞，等试验研究2.4抑菌试验6株贝莱斯芽孢杆菌抑菌试验结果见表4和图2、3和4。抑菌试验结果表明，6株贝莱斯芽孢杆菌菌液、菌液上清和菌液滤液对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均有抑菌作用。本次抑菌试验是采用滤纸片法和琼脂扩散试验方法在同一指示菌平皿进行的，如抑菌试验方法中所述，两种方法的加样量不同，从样品的抑菌作用结果综合判断从强到弱依次是：贝莱斯芽孢杆菌菌液、上清液和菌液滤液。相互比较，有的菌株对革兰阳性菌（金黄色葡萄球菌）抑菌作用更强，如图1中的贝莱斯芽孢杆菌01菌株；有的菌株对革兰阴性菌（大肠杆菌）抑菌作用更强，如图2中的贝莱斯芽孢杆菌05菌株。表46株贝莱斯芽孢杆菌抑菌试验结果（抑菌圈直径 mm）项目贝莱斯芽孢杆菌 01贝莱斯芽孢杆菌 02贝莱斯芽孢杆菌 03贝莱斯芽孢杆菌 04贝莱斯芽孢杆菌 05贝莱斯芽孢杆菌 06强力霉素（DO）对照/培养基对照对金黄色葡萄球菌抑菌强度原菌液22242524262532上清24242422252330滤液101210810828对大肠杆菌抑菌强度原菌液2425262224220上清2223202020200滤液121414121480表36株贝莱斯芽孢杆菌药物敏感性试验（抑菌圈直径 mm）药物/菌株序号阿米卡星（AK）青霉素（P）阿莫西林（AML）强力霉素（DO）恩诺沙星（ENR）头孢曲松（CRO）恶唑/甲氧嘧啶（SXT）128222624182416226242524262624326242426172417426242424262420526242624242624626242626242620注：指示菌：左金黄色葡萄球菌，右大肠杆菌；1、2、3分别为贝莱斯芽孢杆菌01株菌液、滤液、上清；4、5、6分别为贝莱斯芽孢杆菌02株菌液、滤液、上清；7：左强力霉素（DO）对照，右培养基对照。图2贝莱斯芽孢杆菌抑菌试验注：指示菌：左金黄色葡萄球菌，右大肠杆菌；1、2、3分别为贝莱斯芽孢杆菌05株菌液、滤液、上清；4、5、6分别为贝莱斯芽孢杆菌03株菌液、滤液、上清；7：左强力霉素（DO）对照，右培养基对照。图3贝莱斯芽孢杆菌抑菌试验 333讨论芽孢杆菌属有生产具有多种结构形式的抗菌物质的能力。在抑菌特性方面，贝莱斯芽孢杆菌不同菌株的抑菌和潜在功能已被广泛评估。细菌中只有 3%4%的芽孢杆菌属拥有参与抗生素等生物合成的基因簇。芽孢杆菌属参与抗生素等生物合成的基因簇总数达到 350 kb，但没有一株现有菌株拥有所有的这些基因，并且已知的基因组会产生抗菌化合物14。贝莱斯芽孢杆菌产生抗生素等抑菌物质的性质和过程受自身所具有的基因簇编码和调控，它的特征之一是可能包含制造强抗菌活性的次生代谢物的基因簇15。此外，贝莱斯芽孢杆菌主要通过分泌脂肽类抗生素、聚酮类化合物和抗菌蛋白等产生抑菌作用。本试验研究的6株贝莱斯芽孢杆菌及其代谢产物相互比较，有的菌株对革兰阳性金黄色葡萄球菌抑菌强些；有的菌株对革兰阴性大肠杆菌抑菌强些。本试验是定性试验，定量试验有待于再提取或纯化相关产物进行进一步验证。研究表明，贝莱斯芽孢杆菌产酶丰富，耐极端环境，综合6株贝莱斯芽孢杆菌抑菌试验结果，结合相关文献分析揭示贝莱斯芽孢杆菌在动物益生菌菌种的开发及其抑菌代谢产物研究方面具有极大的潜力1619。4结论6株分离菌经16S rDNA序列鉴定和生化试验分析，确认均为贝莱斯芽孢杆菌；对7种代表性药物均敏感。6株贝莱斯芽孢杆菌菌液、菌液上清和菌液滤液对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均有抑菌作用；抑菌作用从强到弱依次是：贝莱斯芽孢杆菌菌液、上清液和菌液滤液。参考文献：1 乔晓妮，张军，孙晓雯，等.海洋源细菌素研究现状及展望J.中国海洋药物，2020，39（4）：7180.2 张德锋，高艳侠，王亚军，等.贝莱斯芽孢杆菌的分类、拮抗功能及其应用研究进展 J.微生物学通报，2020，47（11）：36343649.3 张妙宜，云天艳，周登博，等.甲基营养型芽孢杆菌的研究进展 J.热带农业科学，2017，37（9）：6671.4 高晓丹，马鸣超，曹凤明，等.基于生物化学和基因组学方法的Bacillus velezensis195733生防潜力评价 J.植物营养与肥料学报，2021，27（6）：10681079.5 王青华，孙晓晖，唐旭，等.深海贝莱斯芽孢杆菌 DH82 的筛选、鉴定及其抗菌粗蛋白性质分析 J.海洋通报，2019，38（1）：6369.6 高圣风，徐毕爽，陆大倩，等.生防菌株Bacillus velezensis Z全基因组测序分析 J.热带作物学报，2021，42（5）：12161222.7 张海林，刘占燕，张梦宇，等.一种芽孢杆菌广谱细菌素的分离纯化及其性质研究 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