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怎样用计算方法来分析、预测、设计蛋白质序列及结构主题：基于蛋白质的物理 VS.经验知识的方法7.91 Amy Keating 对一个分子模拟或模型，你需要：1.蛋白质的表征2.能量函数3.搜索算法或最优化算法 共价势能项Brooks et al.,J.Comput.Chem.4:187-217(1983)非共价势能项莱纳德 琼斯势能“精确项”近似项 势能面是一个 3N-6 维的空间。对蛋白质分子，假定存在一个能量最小的天然结构。这些分子构象可能有多个局部极小点。其中，可能仅有一些能量点靠近全局最小点能量 势能面的取样能量极小化“堤度下降”搜索，一般到最临近局部极小点可以用于松弛结构可能对因变异导致的局部结构改变也适用正则模式分析定义关于局部极小结构扭曲的“特征运动”运动次序从易（“低频”）到难（“高频”）分子动力学在给定的温度下运动（300K）全体统计力学均等蒙特卡罗/模拟退火算法描述景观的性质和没有模拟分子实际运动的热力学参数 能量极小点势能，U（R）X 射线结构构象空间，R迭代步骤 到达规定误差终止，比如小 的梯度 差的初始结构产生差的局部极小点多极小点问题 只能找到局部极小点 简单极小点应用1.“极小点微扰方法”对变异建模 假定单点变异与自然结构变异类似 对自然类型蛋白质的支链结构寻找稳定构象 用能量极小来松弛待研究的结构（所有的自由度）Shih,Brady,and Karplus,Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:16971700(1985);hemagglutinin Gly to Asp mutation1.在分析试验或预测结构的能量之前消除应力2.用 X 射线晶体学或 NMR 来建立和修正结构 正则模式分析运动及其相对运动表征热动力学性质数学近似：独立的谐振子序列如预言所示表示势能面的局部扩张实际谐振子近似 正则模式查找“易”形变点低频，易于运动的点在高分子起决定作用 蛋白质的正则运动有时符合生物的相关运动“剪切”或“扭曲”构象改变在酶中是常见的比较用 NMA 计算的结构与实验观察到的结构。通常低频模式表示这种变化（但可能不是能量最低的模型）NMA 是从静态结构获得其运动状态的一种方法。分子动力学模拟用一含时函数来模拟分子运动 获得蛋白质在溶液中的短程运动状态可以用这种模拟方法来计算：平均结构（在给定的温度下，T）原子的振动（在温度 T 下）热动力学定量描述（含时）Verlet“蛙跳”算法 运行分子动力学模型最小化初始坐标按麦克斯韦玻尔兹曼分布给定初始向量用小的时间步子来对牛顿运动方程积分（典型的 1 飞秒=1 x 10-15秒）平衡态（运行动力学程序直至到达平衡）生产动态特动力学（在预想的温度下动力学仍然有用）用蒙特卡罗对构象空间取样用蒙特卡罗随机样本构象取样，而不是模拟分子实际的含时运动1.从一随机的（能量极小点）构象开始2.评估其能量 E03.使构象随机改变（如：转动一个键）4.评价新的能量 E 5.判决：如果 E E0，且如果 exp-(E-E0)/kT 随机数#，然后接受改变，设 E0 E，到步骤 3 否则丢弃这种改变，到步骤 36.继续按任意的依时随机运行接受标准使产生的构象符合玻尔兹曼分布 蒙特卡罗和分子动力学的用途1.浏览能量全景图 全局极小是什么 其它的极小点是什么 这些极小点的能垒是什么2.计算热动力学值3.观察不同状态间的连接方式 分子动力学和蒙特卡罗间的区别？分子动力学和蒙特卡罗都能用于多种用途如果你想知道体系的含时状态，就必须用分子动力学蒙特卡罗对宽范围的构象空间取样比较好，因为它随机移动可以远离局部极小 GroEL 变构的机理动力学模型分子动力学模拟用于探求 GroEL 分子伴侣的变构机理，该分子是在ATP 和 GroES 分子间产生的请看下文的图 1 aMa,J,PB Sigler,Z Xu,and M Karplus.A Dynamic Model for The Allosteric Mechanism of GroEL.J Mol Biol.302,no.2(15 September 2000):303-13.显示了与 ATP 作用的变构机理计算的终点由 X射线实验结构决定，但是通常不容易到达实验结构模拟正常的变构很慢，但“靶分子动力学”能确定这些变化过程。首先黄色的中间体的结构域向下移动，引发定点上绿色的结构域向上移动。模拟能显示正负协同相互作用的可靠性的细节请看下文的图 2b 和 5bMa,J,PB Sigler,Z Xu,and M Karplus.A Dynamic Model for The Allosteric Mechanism of GroEL.J Mol Biol.302,no.2(15 September 2000):303-13.分子动力学模拟现在可以用于庞大的系统水通道（水可以通过，质子却不能）的模拟。水分子和磷脂双分子层都要计算在内总计 101，000 个原子。请看下文的图 1de Groot,Bert L.,and Helmut Grubmller.Water Permeation Across Biological Membranes:Mechanismand Dynamics of Aquaporin-1 and GlpF.Science 294(14 December 2001):2353-2357.分子动力学模拟水通道允许溶剂分子通过10 纳秒模拟足以观察水分子的实时运动因为渗透速率是 3x109 s-1。可以观察其选择性机理速率的决定因素。请看下文图 2de Groot,Bert L.,and Helmut Grubmller.Water Permeation Across Biological Membranes:Mechanismand Dynamics of Aquaporin-1 and GlpF.Science 294(14 December 2001):2353-2357.用分子动力学来模拟蛋白质的折叠绒毛蛋白（36 个残基，与溶剂显相关）头部的折叠模拟：1 us 模拟，2 fs 步长，512Clay 处理器耗时数月！结论：在模型中 NMR 结构是稳定的。60ns 后结构显示 50 的螺旋性，与其它蛋白质的实验数据符合较好。对给定的初始高能状态产生一螺旋结构和稳定接触对二级和三级与稳定态接触的相似性，存在一个亚稳态Duan&Kollman Science(1998)282,740-744 绒毛蛋白头部A.非折叠B.980 ns 部分折叠C.自然态E.源于稳定聚类的结构时间进化：A.自然螺旋状态B.自然接触C.旋转半径D.溶剂化自由能请看下文的图 1 和图 2:Duan,Yong,and Peter A.Kollman.Pathways to a Protein Folding Intermediate Observed in a 1-Microsecond Simulation in Aqueous Solution.Science 282(23 October 1998):740-744.分子模型一些最后忠告模型的势能函数是近似的（出于一些相当好的目的）；计算并不能代替实验有能力将计算结果分成多步，可以发现用其它方法得不到的结果对具体的问题建立一个精确的模型有其自身的价值 解析结构问题用X射线晶体学NMR 谱 怎样确定X 射线晶体结构1.晶体生长 用 X 射线晶体学来确定结构依赖于晶格点的重复结构2.收集衍射样本晶体中原子周期性的空隙在 X 射线透过时产生衍 射现象而出现“斑点”4.经过傅立叶变换得到一个倒易空间以描述其电子密度的 4.这一步需要解析相位波状态的知识，该波不能直接的由状态问题测得。4.建立蛋白质的初步模型来描述由实验数据得到的电子密度的信封模型5.通过迭代改变模型以修正结构并比较其于实验数据的符合程度 蛋白质晶体的生长在解决结构问题时通常有一速决步。蒸汽扩散悬滴法 缓冲溶液，盐，沉淀1.选择一个你认为比较典型得折叠结构 2.提纯蛋白质3.浓度 10 mg/ml 收集衍射数据 衍射图中的斑点有什么含义？每一个斑点表示原子空隙满足布拉格定律而在衍射时产生连续的干涉n=2dsin 晶体平面因此由斑点的强度得到的 q 表示平面的电子密度的大小，该平面是周期性的 d 间隔平面注意：=0.5 到 1.5 衍射模式表示倒易空间大的 -小的 d;高分辨率小的-大的 d;低分辨率每一个斑点源于在衍射方向上该平面具有恰当的距离由于版权原因衍射图像未能给出蛋白质的电子密度表示这些周期性函数的重叠 傅立叶变换这是电子密度这是衍射模式Courtesy of Kevin Cowtan:http:/www.ysbl.york.ac.uk/cowtan/sfapplet/sfintro.html 相位问题：我们不知道使用什么相位对波函数有贡献。大问题可见调幅原子散射因子与原子 j 周围的电子密度相关相位由原子 j 的坐标 X,Y,Z 决定我们观察的是 Ihkl|Fkhl|2 我们不能直接测量相位Fhkl 为结构因子 Courtesy of Kevin Cowtan:http:/www.ysbl.york.ac.uk/cowtan/sfapplet/sfintro.html Courtesy of Kevin Cowtan:http:/www.ysbl.york.ac.uk/cowtan/sfapplet/sfintro.html 强度的影响 VS 相位的傅立叶变换 duck 强度 cat 相位Courtesy of Kevin Cowtan:http:/www.ysbl.york.ac.uk/cowtan/sfapplet/sfintro.html 因此，怎样得到相位呢？分子替换你认为结构中“Borrow”相位比较相似比如：duck 强度和 goose 相位能合理地确定真实的结构注意“模型偏好”需要控制，以确保你没有把数据强加再假想模型结构上它是怎样工作的：取出模型结构并按晶体的基本单位来转换/旋转。计算预期的结构因子。控制 R 值如果你找到了一个很有意义的非随机的 R 值，这个模型可能就是一个好的模型。尽量优化该模型，看 Rfree 值是否有改进 因此，怎样得到相位呢？重原子方法如果你可以得到含有重原子的一个或多个相同几何结构的晶体的话，那么F蛋白质重原子=F蛋白质+F重原子，得到含有重原子的衍射模式和不含重原子的衍射模式，该模式仅仅给出了重原子的衍射模式。该结构可以由“模式图”来表示模式图给出了原子间的所有向量。这对蛋白质整体并没有帮助，但对一足够小的结构，你可以得到全体结构信息（手性信息除外）。一旦你有重原子衍射结构，你可以用这来推出原始结构的相位。（相信我的这一点我们没有时间来详细的解释）谱图迹通常需要序列知识 X 射线晶体结构精讲模型：斑点的计算强度数据：斑点的实际强度所有斑点的总和实验观察的斑点实际强度从试验计算的斑点强度U 杂化=U 分子模型+sU X 射线 实验模拟退火算法用在杂化势能上能快速的改进结构和 X射线观察结果，该结构是在 保持合理的化学性质的基础上得到的。（大半径收敛）以前有效的方法是局部极小，而局部极小容易停留在局部极小区域（小半径收敛）结构修正和 R 因子当前模型观察到的 X 射线幅度衍生模型幅度R=所有测量项|F观察|-|F计算|/|F观察|在观察数据立体化学原理的指导下做相应改变 自由 R 因子90 的 X射线幅度当前模型10 的 X 射线幅度衍生模型幅度R=|F观察|-|F计算|/|F观察|R 自由=|F观察|-|F计算|/|F观察|改变模型评估模型