光学显微镜技术.pdf

1第二部分 光学显微镜技术第二部分 光学显微镜技术第一章 概述第一节 显微镜的作用人眼对微观世界观察的局限性光学显微镜是人类探索微观世界的光学精密仪器光学显微镜的发展在很大程度上决定了人们对生命现象的认识第一章 概述第一节 显微镜的作用人眼对微观世界观察的局限性光学显微镜是人类探索微观世界的光学精密仪器光学显微镜的发展在很大程度上决定了人们对生命现象的认识第二节 显微镜的类型根据照明源的性质一、光学显微镜：利用可见光（或紫外光）为照明源，一般有单式及复式显微镜两类。复式显微镜可分为：1.普通型：常规使用。2.特种型：如荧光、相衬显微镜等；供专门观察和研究。3.高级型：万能显微镜。4.共焦激光扫描显微镜（第二节 显微镜的类型根据照明源的性质一、光学显微镜：利用可见光（或紫外光）为照明源，一般有单式及复式显微镜两类。复式显微镜可分为：1.普通型：常规使用。2.特种型：如荧光、相衬显微镜等；供专门观察和研究。3.高级型：万能显微镜。4.共焦激光扫描显微镜（Confocal）。）。2第三节 光学显微镜的发展简史第三节 光学显微镜的发展简史1625年法布尔提出显微镜的概念年法布尔提出显微镜的概念1610年伽利略制造出具有物镜、目镜及镜筒的复式显微镜年伽利略制造出具有物镜、目镜及镜筒的复式显微镜1611年开普勒说明了显微镜的原理年开普勒说明了显微镜的原理1665年虎克制造出放大年虎克制造出放大140倍的显微镜，提出倍的显微镜，提出“Cell”的概念的概念1684年惠更斯制造出双透镜目镜：惠更斯目镜年惠更斯制造出双透镜目镜：惠更斯目镜19世纪阿贝提出显微镜的完整理论世纪阿贝提出显微镜的完整理论1902年艾夫斯建立了双目镜系统年艾夫斯建立了双目镜系统1935年泽尼克发现了相衬原理，并因此获得诺贝尔奖年泽尼克发现了相衬原理，并因此获得诺贝尔奖20世纪世纪60年代微分干涉衬显微镜问世年代微分干涉衬显微镜问世20世纪世纪80年代共焦激光扫描显微镜开始应用年代共焦激光扫描显微镜开始应用第四节 显微镜的基本光学原理第四节 显微镜的基本光学原理一、折射与折射率光线的折射现象物质的折射率二、透镜的性能凸透镜可以会聚光线凹透镜可以发散光线一、折射与折射率光线的折射现象物质的折射率二、透镜的性能凸透镜可以会聚光线凹透镜可以发散光线3三、透镜的成像质量象差：是指透镜所形成的象与理想象在形状、颜色等方面存在差异。三、透镜的成像质量象差：是指透镜所形成的象与理想象在形状、颜色等方面存在差异。4色差：由于不同的颜色光线折射率差异而形成的象差。色差的校正（1）采用单色光为光源。（2）利用透镜的性质。色差：由于不同的颜色光线折射率差异而形成的象差。色差的校正（1）采用单色光为光源。（2）利用透镜的性质。四、显微镜的成象（几何成象）原理利用凸透镜成象原理物镜成象：利用物体在凸透镜一倍焦距以外二倍焦距以内，成倒立的放大的实象。目镜成象：是利用物体在凸透镜一倍焦距以内，成正立的放大的虚象。四、显微镜的成象（几何成象）原理利用凸透镜成象原理物镜成象：利用物体在凸透镜一倍焦距以外二倍焦距以内，成倒立的放大的实象。目镜成象：是利用物体在凸透镜一倍焦距以内，成正立的放大的虚象。5显微镜成象原理：显微镜成象原理：第二章、显微镜的主要光学技术参数第二章、显微镜的主要光学技术参数6第一节数值孔径（第一节数值孔径（Numerical Aperture，NA）数值孔径（NA）是物镜前透镜与被检物体间介质的折射率（）和孔径角（u）半数正弦的乘积。用公式表示：NA=sin u/2数值孔径代表了物镜或聚光镜光通量的大小，是衡量物镜或聚光镜性能高低的重要指标。同样放大倍数下，数值孔径越大，物镜的性能越高。干燥系物镜 NA1,最大为1.4聚光镜的数值孔径大小，可通过孔径光阑进行调解，一般为0.05-1.4数值孔径（NA）是显微镜中最重要的技术参数,它几乎决定和影响了其它技术参数。它与分辨率成正比；与有效放大率成正比；与焦深成反比；NA的平方数值孔径（NA）是物镜前透镜与被检物体间介质的折射率（）和孔径角（u）半数正弦的乘积。用公式表示：NA=sin u/2数值孔径代表了物镜或聚光镜光通量的大小，是衡量物镜或聚光镜性能高低的重要指标。同样放大倍数下，数值孔径越大，物镜的性能越高。干燥系物镜 NA1,最大为1.4聚光镜的数值孔径大小，可通过孔径光阑进行调解，一般为0.05-1.4数值孔径（NA）是显微镜中最重要的技术参数,它几乎决定和影响了其它技术参数。它与分辨率成正比；与有效放大率成正比；与焦深成反比；NA的平方与图象亮度成正比与图象亮度成正比NANA值增大视场宽度与工作距离都会相应变小值增大视场宽度与工作距离都会相应变小第二节分辩率（第二节分辩率（Resolving power）分辨率分辨率是衡量显微镜性能的另一个重要技术参数。往往用最小分辨距离来表示。在显微镜的设计中确定，当最小点的衍射斑象的中心刚好落在另一个衍射斑象的边缘，则认为两物点象刚刚能够被分辨；这就是可以分辨的最小距离。最小分辨距离：=/NA其中为照射光波长，NA为显微镜物镜的数值孔径可见显微镜的最小分辨距离是有限的。光学显微镜的最小分辨距离，理论上看约为0.3微米左右。是衡量显微镜性能的另一个重要技术参数。往往用最小分辨距离来表示。在显微镜的设计中确定，当最小点的衍射斑象的中心刚好落在另一个衍射斑象的边缘，则认为两物点象刚刚能够被分辨；这就是可以分辨的最小距离。最小分辨距离：=/NA其中为照射光波长，NA为显微镜物镜的数值孔径可见显微镜的最小分辨距离是有限的。光学显微镜的最小分辨距离，理论上看约为0.3微米左右。7第三节有效放大率（第三节有效放大率（Magnification）总放大率 M=Mob（物镜放大率）Moc（目镜放大率）Mob=/F1为标准镜筒长度160毫米；F1为物镜的焦距Moc=250/F2250为人的明视距离，单位为毫米F2为目镜的焦距显微镜的总放大率 M=Mob（物镜放大率）Moc（目镜放大率）Mob=/F1为标准镜筒长度160毫米；F1为物镜的焦距Moc=250/F2250为人的明视距离，单位为毫米F2为目镜的焦距显微镜的“有效放大率有效放大率”，是在标准筒长下，所使用的物镜数值孔径的500-1000倍。物镜在显微镜中的重要作用！，是在标准筒长下，所使用的物镜数值孔径的500-1000倍。物镜在显微镜中的重要作用！第四节焦深第四节焦深焦深是焦点深度的简称，即在使用显微镜时，当焦点对准某一物体点时，不仅位于该点平面上的各点都可看清楚，而且在此平面上下的一定厚度内，也能看得清楚，这个清晰部分的厚度就是焦深。焦深大，可看到被检物体的全层；而焦深小，则只能看到被检物体的一薄层。焦深计算公式：D=K./M.NA其中，K：常数为240微米，：被检物体周围的折射率M：总放大率，NA：物镜的数值孔径焦深是焦点深度的简称，即在使用显微镜时，当焦点对准某一物体点时，不仅位于该点平面上的各点都可看清楚，而且在此平面上下的一定厚度内，也能看得清楚，这个清晰部分的厚度就是焦深。焦深大，可看到被检物体的全层；而焦深小，则只能看到被检物体的一薄层。焦深计算公式：D=K./M.NA其中，K：常数为240微米，：被检物体周围的折射率M：总放大率，NA：物镜的数值孔径8第五节视场直径第五节视场直径视场直径也称视场宽度或视场范围，是指在显微镜下看到的圆形视场内所能容纳被检物体的实际范围。视场直径越大，越便于观察。计算方法：=FN/Mob，：视场直径；FN：视场数（Field Number，是目镜的固定参数，标刻在目镜的外面）；Mob：物镜放大率视场直径也称视场宽度或视场范围，是指在显微镜下看到的圆形视场内所能容纳被检物体的实际范围。视场直径越大，越便于观察。计算方法：=FN/Mob，：视场直径；FN：视场数（Field Number，是目镜的固定参数，标刻在目镜的外面）；Mob：物镜放大率第六节覆盖差第六节覆盖差由于盖玻片厚度不标准，而产生的象差，称为覆盖差。国际上规定，盖玻片的标准厚度为0.17毫米，允许范围在0.16-0.18毫米。物镜外壳上标刻的0.17，即表明该物镜要求的盖玻片厚度。由于盖玻片厚度不标准，而产生的象差，称为覆盖差。国际上规定，盖玻片的标准厚度为0.17毫米，允许范围在0.16-0.18毫米。物镜外壳上标刻的0.17，即表明该物镜要求的盖玻片厚度。9带校正环的40倍物镜带校正环的40倍物镜第七节镜象亮度与视场亮度第七节镜象亮度与视场亮度镜象亮度是显微镜图象亮度的简称，指在显微镜下所观察到的图象的明暗程度。镜象亮度与两个因素有关：1、与物镜的数值孔径的平方成正比。2、与总放大率的平方成反比。镜象亮度与视场亮度是两个不同的概念。视场亮度是指显微镜下整个视场的明暗程度。镜象亮度是显微镜图象亮度的简称，指在显微镜下所观察到的图象的明暗程度。镜象亮度与两个因素有关：1、与物镜的数值孔径的平方成正比。2、与总放大率的平方成反比。镜象亮度与视场亮度是两个不同的概念。视场亮度是指显微镜下整个视场的明暗程度。10第八节工作距离第八节工作距离工作距离：也叫物距，指物镜前透镜的表面到被检物体之间的距离。一般情况下，物镜的数值孔径越大，其工作距离越小。工作距离：也叫物距，指物镜前透镜的表面到被检物体之间的距离。一般情况下，物镜的数值孔径越大，其工作距离越小。第三章显微镜的光学部件第三章显微镜的光学部件11第一节物镜（Objective）第一节物镜（Objective）一、物镜的作用、齐焦合轴的概念二、物镜的分类1、按物镜前透镜与 盖玻片间的介质（1）干燥系物镜（2）水浸系物镜（3）油浸系物镜2、按物镜放大率的高低（1）极低倍物镜：放大率 1（2）低倍物镜：放大率在 1一、物镜的作用、齐焦合轴的概念二、物镜的分类1、按物镜前透镜与 盖玻片间的介质（1）干燥系物镜（2）水浸系物镜（3）油浸系物镜2、按物镜放大率的高低（1）极低倍物镜：放大率 1（2）低倍物镜：放大率在 16（3）中倍物镜：放大率在 66（3）中倍物镜：放大率在 625（4）高倍物镜：放大率在 2525（4）高倍物镜：放大率在 251001003、按物镜校正象差的程度（1）消色差物镜（3、按物镜校正象差的程度（1）消色差物镜（Achromatic objective，Ach）（2）复消色差物镜（）（2）复消色差物镜（Apochromatic objective，APO）（3）半复消色差物镜（）（3）半复消色差物镜（Semi Apochromatic objective，FL）（4）平场物镜（）（4）平场物镜（Plan objective）Plan Ach，Plan APO，Plan semi APO，Splan APO（5）多功能无限远补偿物镜（5）多功能无限远补偿物镜（Universal Infinity system objective）UIS：UPLAPO（相当于（相当于SPLAPO），），UPLFL（相当于（相当于SPLFL）12（6）特种物镜（6）特种物镜A，带校正环物镜（，带校正环物镜（Correction coller ob）B，带虹彩光阑物镜（，带虹彩光阑物镜（Iris diaphragm ob）C，相衬物镜（C，相衬物镜（Phase contrast ob）D，无应变物镜（）D，无应变物镜（Strain-free ob）E，无荧光物镜（）E，无荧光物镜（Non-fluorescing ob）F，无罩物镜（）F，无罩物镜（No cover ob）G，长工作距离物镜（）G，长工作距离物镜（Long working distance ob）13第二节目镜第二节目镜1、惠更斯目镜2、冉姆斯登目镜3、凯尔勒目镜4、补偿目镜5、平场目镜1、惠更斯目镜2、冉姆斯登目镜3、凯尔勒目镜4、补偿目镜5、平场目镜6、广视场目镜7、超广视场目镜8、摄影目镜9、其它目镜6、广视场目镜7、超广视场目镜8、摄影目镜9、其它目镜14第三节聚光镜第三节聚光镜1、阿贝聚光镜2、消色差等光程聚光镜3、摇出式聚光镜4、极低倍聚光镜1、阿贝聚光镜2、消色差等光程聚光镜3、摇出式聚光镜4、极低倍聚光镜5、特殊聚光镜（1）暗场聚光镜（2）相衬聚光镜（3）偏光聚光镜（4）微分干涉聚光镜（5）长工作距离聚光镜5、特殊聚光镜（1）暗场聚光镜（2）相衬聚光镜（3）偏光聚光镜（4）微分干涉聚光镜（5）长工作距离聚光镜15第四节显微镜的照明系统第四节显微镜的照明系统一、透射式照明1、中心照明：照明光束的中轴与显微镜的光轴重合（1）临界照明：光线经聚光镜后会聚到被检物体上。光线照射不均匀，不适合进行显微照相。一、透射式照明1、中心照明：照明光束的中轴与显微镜的光轴重合（1）临界照明：光线经聚光镜后会聚到被检物体上。光线照射不均匀，不适合进行显微照相。（2）柯勒照明：其光线经聚光镜后不会聚到被检物体上。光线照射均匀，适合进行显微照相。是研究用显微镜的理想照明方法。（2）柯勒照明：其光线经聚光镜后不会聚到被检物体上。光线照射均匀，适合进行显微照相。是研究用显微镜的理想照明方法。162、斜射照明：照明光束的中轴与显微镜的光轴不在同一直线上，而是与光轴形成某种角度斜射到被检物体上。相衬显微镜（明场斜射）与暗场显微镜（暗场斜射）使用斜射照明。2、斜射照明：照明光束的中轴与显微镜的光轴不在同一直线上，而是与光轴形成某种角度斜射到被检物体上。相衬显微镜（明场斜射）与暗场显微镜（暗场斜射）使用斜射照明。二、落射式照明落射式照明又称二、落射式照明落射式照明又称“反射式照明反射式照明”或或“垂直式照明垂直式照明”。这种照明的光束来自物体的上方，通过物镜后照射到被检物体上，这样物镜又起着聚光镜的作用。这种照明法适用于非透明物体。目前，荧光显微镜主要使用落射式照明方法。这种照明的光束来自物体的上方，通过物镜后照射到被检物体上，这样物镜又起着聚光镜的作用。这种照明法适用于非透明物体。目前，荧光显微镜主要使用落射式照明方法。17第五节 显微镜的光轴调节第五节 显微镜的光轴调节在显微镜的光学系统中，光源、聚光镜、物镜和目镜的光轴以及光阑的中心必须与显微镜的光轴在同一直线上。在研究用显微镜使用前，尤其是显微照相前，应进行光轴中心的调节。1、光源灯丝的调正2、聚光镜的中心调正3、孔径光阑的调节显微观察时，聚光镜的数值孔径应与所用物镜的数值孔径一致。在显微镜的光学系统中，光源、聚光镜、物镜和目镜的光轴以及光阑的中心必须与显微镜的光轴在同一直线上。在研究用显微镜使用前，尤其是显微照相前，应进行光轴中心的调节。1、光源灯丝的调正2、聚光镜的中心调正3、孔径光阑的调节显微观察时，聚光镜的数值孔径应与所用物镜的数值孔径一致。第四章研究用显微镜第四章研究用显微镜18研究用显微镜的设计研究用显微镜的设计第一节明场显微镜第一节明场显微镜19明场显微镜是以标本的颜色及其透射率为基础的显微镜。一般透射式的明视场镜检，标本应经过染色处理，才能达到应有的效果。在各种显微镜的观察方法中，明场显微镜观察是最常规的一种，在生物学研究中被广泛应用。明场显微镜是以标本的颜色及其透射率为基础的显微镜。一般透射式的明视场镜检，标本应经过染色处理，才能达到应有的效果。在各种显微镜的观察方法中，明场显微镜观察是最常规的一种，在生物学研究中被广泛应用。20明场显微镜的观察效果明场显微镜的观察效果21第二节暗场显微镜第二节暗场显微镜暗场显微镜特点：暗场显微镜特点：1、可以观察在普通明视场中看不见的标本。2、可以观察细菌等微小标本。3、观察效果如同星空。1、可以观察在普通明视场中看不见的标本。2、可以观察细菌等微小标本。3、观察效果如同星空。22暗场显微镜原理：通过在明场显微镜上安装暗场聚光镜，使来自聚光镜的光线不直接入射到物镜内，而被标本散射的光则可以进入物镜，从而达到在黑暗的背景下可看到标本的外部形态。暗场显微镜原理：通过在明场显微镜上安装暗场聚光镜，使来自聚光镜的光线不直接入射到物镜内，而被标本散射的光则可以进入物镜，从而达到在黑暗的背景下可看到标本的外部形态。暗场聚光镜：1、浸液系暗场聚光镜（暗场聚光镜：1、浸液系暗场聚光镜（DCW）20 X100 X 物镜。2、干燥系暗场聚光镜（物镜。2、干燥系暗场聚光镜（DCD）4 X40 X 物镜。物镜。23暗场显微镜的观察效果暗场显微镜的观察效果24第三节偏光显微镜第三节偏光显微镜特点：1、根据有关物质所具有的偏光性，可以进行定性观察和定量测定。2、广泛应用于矿物、晶体、陶瓷、金属、药物和生物组织等具有双折射性偏光物质的观察、研究和鉴别。特点：1、根据有关物质所具有的偏光性，可以进行定性观察和定量测定。2、广泛应用于矿物、晶体、陶瓷、金属、药物和生物组织等具有双折射性偏光物质的观察、研究和鉴别。25偏光显微镜基本原理偏光显微镜基本原理262728偏光显微镜的观察效果偏光显微镜的观察效果29第四节相衬显微镜第四节相衬显微镜30相衬显微镜的特点：相衬显微镜的特点：可以对无色透明的标本进行观察。适合于观察活细胞。1935年荷兰人泽尼克（可以对无色透明的标本进行观察。适合于观察活细胞。1935年荷兰人泽尼克（Zernike)提出相衬原理。1941年蔡司工厂生产出第一台相衬显微镜。1953年，泽尼克因此获诺贝尔奖。)提出相衬原理。1941年蔡司工厂生产出第一台相衬显微镜。1953年，泽尼克因此获诺贝尔奖。相衬显微镜基本原理：相衬显微镜基本原理：光具有波动性。当光线透射透明的、折射率与周围介质折射率不同的物体时，其相位会发生变化，而振幅（明、暗差别）和波长（颜色）的变化不明显，因此无法被人的眼睛识别。相衬显微镜，则是依靠装在物镜内的相位板，使照射物体点的直射光与衍射光发生干涉，使相位差转换成振幅差（明暗差别），从而使人们可以观察无色透明的标本。光具有波动性。当光线透射透明的、折射率与周围介质折射率不同的物体时，其相位会发生变化，而振幅（明、暗差别）和波长（颜色）的变化不明显，因此无法被人的眼睛识别。相衬显微镜，则是依靠装在物镜内的相位板，使照射物体点的直射光与衍射光发生干涉，使相位差转换成振幅差（明暗差别），从而使人们可以观察无色透明的标本。3132相衬显微镜基本光学部件相衬显微镜基本光学部件33相衬显微镜观察效果相衬显微镜观察效果3435第五节微分干涉衬显微镜（DIC）第五节微分干涉衬显微镜（DIC）微分干涉衬显微镜的特点：1、与相衬显微镜类似，可以观察到在普通显微镜下看不见的无色透明标本。2、可以对活细胞进行观察。3、观察的影象呈立体浮雕状，观察效果较相衬显微镜更具艺术感。微分干涉衬显微镜的特点：1、与相衬显微镜类似，可以观察到在普通显微镜下看不见的无色透明标本。2、可以对活细胞进行观察。3、观察的影象呈立体浮雕状，观察效果较相衬显微镜更具艺术感。36微分干涉衬显微镜的原理：微分干涉衬显微镜是利用偏光干涉原理的一种显微镜。从起偏镜出来的偏振光通过渥拉斯顿棱镜后，分成相互垂直的两束偏振光。两束光分别在距离很近（小于显微镜的最小分辨距离）的两点上通过被检物体，两束光在相位上略有差别。两路光通过物镜后，经第二组渥拉斯顿棱镜相吻合。在经过检偏镜后使它们震动方向一致而发生干涉。从而形成较连续的明暗反差，构成具浮雕感的图象。微分干涉衬显微镜的原理：微分干涉衬显微镜是利用偏光干涉原理的一种显微镜。从起偏镜出来的偏振光通过渥拉斯顿棱镜后，分成相互垂直的两束偏振光。两束光分别在距离很近（小于显微镜的最小分辨距离）的两点上通过被检物体，两束光在相位上略有差别。两路光通过物镜后，经第二组渥拉斯顿棱镜相吻合。在经过检偏镜后使它们震动方向一致而发生干涉。从而形成较连续的明暗反差，构成具浮雕感的图象。37微分干涉衬显微镜的观察效果微分干涉衬显微镜的观察效果38可观察透明标本显微镜的比较可观察透明标本显微镜的比较39第五章显微照相第五章显微照相40各种显微照相系统各种显微照相系统41显微照相中目镜与物镜的选择显微照相中目镜与物镜的选择42滤光片在显微照相中的使用滤光片在显微照相中的使用43照相范围的选择照相范围的选择44显微照相焦距的调节显微照相焦距的调节45其它有关显微照相的滤光片其它有关显微照相的滤光片显微照相使用的胶卷显微照相使用的胶卷46显微摄影技术进展显微摄影技术进展47484950Zeiss显微镜显微镜5152利用软件消除荧光显微镜图象光晕现象利用软件消除荧光显微镜图象光晕现象5354