水稻耐盐相关基因的克隆及转化研究进展解读.doc

0引言水稻(Oryza sativa L. 源于淡水沼泽植物，因此对盐较为敏感。水稻作为中国第一大粮食作物，现正面临可耕种面积逐渐缩小尴尬。某些原因导致土壤盐碱化也是导致水稻耕种面积缩小原因之一。在亚洲，2150hm 2水稻受到盐胁迫危害，并且这种状况仍在不停加剧。因此，研究、培育耐盐水稻品种，提高土地运用率，从而扩大水稻种植面积，提高水稻产量已刻不容缓。目前，国内外已克隆了某些耐盐有关基因，并转化水稻，获得了耐盐性较高转基因水稻。此文就转耐盐基因水稻及耐盐有关新基因克隆研究现实状况做简要综述。
1耐盐转基因水稻研究
基因工程技术诞生使得水稻育种变得轻易，通过将耐盐基因转化到盐敏水稻品种中提高了盐敏水稻对盐耐受能力。
1.1渗透有关基因
植物在盐胁迫下，细胞会代偿性地增长某些相容性物质，减少细胞渗透势，保护酶和细胞膜构造，清除氧自由基[1]。这些物质包括：脯氨酸、甜菜碱、果糖、蔗糖、多胺等。它们具有较强亲水力，可以替代蛋白质、蛋白复合物或膜表面水[1]。
基金项目：福建农林大学校青年教师基金(06B03。
第一作者简介：陈煜，女，1977年出生，四川泸州人，讲师，硕士，重要从事植物分子生物学研究。通信地址：350002福建福州金山福建农林大学生命科学学院，Tel ：8，E-mail。
通讯作者：柯玉琴，女，1954年出生，福建莆田人，专家，大普，重要从事植物逆境生理生化研究。通信地址：350002福建福州金山福建农林大学生命科学学院，Tel ：3，E-mail。
收稿日期：-01-06，修回日期：-02-27。
水稻耐盐有关基因克隆及转化研究进展
陈煜，杨燕凌，谢小芳，柯玉琴
（福建农林大学生命科学学院，福州350002）
摘要：盐分是影响水稻生长发育重要环境原因之一。伴随工业化进程及淡水资源匮乏而出现土壤盐碱化是当今水稻育种需要突破一种难点。在此背景下，克隆耐盐基因和培育耐盐转基因水稻成为水稻育种新技术手段。作者在耐盐转基因水稻研究、耐盐有关新基因克隆两个方面进行了综述，以期能使水稻育种科技人员对该领域有较为全面理解，同步能为他们科研工作提供某些借鉴。最终，对盐胁迫下转基因水稻前景以及存在问题进行了展望和讨论。
关键词：水稻；耐盐基因；基因克隆；转基因水稻；研究进展
中图分类号：S511文献标志码：A 论文编号：-0053
Research Progress on Cloning and Translation of the Salt Resistance Genes in Rice
Chen Yu, Yang Yanling, Xie Xiaofang, Ke Yuqin (College of Life Science, Fujian Agriculture and Forestry University , Fuzhou 350002 Abstract :Salinity is one of the factors which affect the growth and development of rice. At present,
Soil
salinization, which followed with the industrialization progress and the lack of fresh water resource, became one difficult point in the rice
breeding.
In such situation, cloning genes of salinity resistance and raising
transgenic rice
of salinity resistance are the new
methods
for
rice breeding. Transgenic rice with salinity
resistance and new genes cloned recently were reviewed as to support totally comprehension and advice for
researchers. At last, prosperity of transgenic rice with salt resistance was predicted and the problems exist in
it were discussed. Key words :rice (Oryza sativa L.; salt resistance genes; gene clone; transgenic rice; research progress
中国农学通报,26(11:23-27
Chinese Agricultural Science

Bulletin

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1.1.1脯氨酸脯氨酸是水溶性最大氨基酸，分布最广渗透调整剂。它不仅作为渗透调整剂减少细胞质水势，维持胞质水分状况，还是一种保护剂，使胞内大分子物质免受盐离子毒害[2]。并且还参与氮代谢和能量代谢[3]。P5CS(2-氢吡咯-5-羧酸合成酶 基因是一种双功能基因，编码γ-谷氨酰激酶(γ-GK 和谷氨酸-5-半醛脱氢酶(GSA两种酶，催化从谷氨酸合成脯氨酸最初两步反应。Anoop 等[4]成功地把P5CS 基因转入水稻中，并发现转基因水稻植株体现为很好根生长和较高生物量。1.1.2甜菜碱甜菜碱(GB是生物界广泛存在细胞相容性物质，作为细胞渗透调整剂，发挥平衡液泡中水势功能，并对细胞内大分子物质起保护作用，从而维持细胞正常生理功能。盐胁迫下，水稻细胞中会大量积累GB ，以维持细胞内外渗透平衡，其积累水平与植物抗胁迫能力成正比。其合成途径是由胆碱经由甜菜碱醛生成甜菜碱，需要胆碱单氧化酶(CMO和甜菜碱醛脱氢酶(BADH催化[5]。Shirasawa [6]用农杆菌将菠菜(Spinacia oleracea CMO 转化水稻，成果发现：转基因水稻GB 含量增长，并且提高了对盐胁迫、温度胁迫耐受性。Su 等[7]制备了几种产GB 转基因水稻。在这些转基因水稻中，分别使用了ABA-诱导启动子(SIP和泛素蛋白(UBI基因启动子，使胆碱氧化酶基因(COX与叶绿体打靶序列(TP融合体现。发现应用SIP 种系GB 水平(2.60μmol/gDW不如UBI 种系高(3.12μmol/gDW。因此，应用ABA-诱导启动子在GB 初始生产方面并不合适。不过，SIP 种系在盐生长环境中提高了GB 积累达89%，然而UBI 种系只有44%。尽管GB 浓度较低，但在记录学上发现，SIP 种系比UBI 种系可以产生更强胁迫耐受水平，暗示在SIP 种系中发现胁迫保护不能完全用所增长GB 含量来解释。而甜菜碱醛脱氢酶(BADH对植物细胞中甜菜碱合成和积累有直接作用。1990年Weretilnyk 等[8]从菠菜中初次克隆了BADH cDNA 。郭岩等[9]应用基因枪法将含盐生植物山菠菜(Atriplex hortensis BADH 基因植物双元体现载体导入粳稻中花8号中，得到转BADH 基因水稻植株具有较高耐盐性。1.1.3糖醇糖醇作为相容性溶质在渗透调整和渗透保护中起重要作用。王慧中等[10]通过农杆菌介导法将1-磷酸甘露醇脱氢酶(mtlD基因，6-磷酸山梨醇脱氢酶(gutD基因同步整合进水稻基因组并且在转基因水稻中得到体现，气相色谱分析证明转基因水稻合成并积累了甘露醇和山梨醇。与未转基因对摄影比，转基因植株耐盐性明显提高。
1.2功能蛋白有关基因
LEA 基因是在种子成熟和发育阶段体现基因，称为晚期胚胎发生丰富蛋白基因，在种子发育过程中
胚胎晚期引起LEA 蛋白高度富集。在植物受到盐胁迫后导致脱水营养组织中也有所体现。LEA 基因体现与植物环境胁迫成正有关。在胁迫条件下，LEA 蛋白对植物细胞起保护作用。在ABA 和盐诱导下，LEA 蛋白在耐盐水稻根部有积累而在盐敏感品种中没有积累[11]。Xu 等人[12]将大麦LEA-2基因
HV A1转入水稻，转基因水稻获得高耐盐性。
钙依赖/钙调素不依赖蛋白激酶(OsCDPK7是一种依赖于Ca 2+参与寒冷与盐胁迫正向调整因子。已经有资料报道OsCDPK7在根中柱和花冠维管束中大量体现，同步，该基因也在花冠维管束鞘以及根厚壁组织中体现。Saijo 等[13]制备了过量体现OsCDPK7基因转化体，转化体中加入了花椰菜病毒35S 启动子，证明了上述成果。

OsbZIP23是水稻亮氨酸拉链转录因子家族组员之一，为研究其功能和细胞内定位，Xiang 等[14]将其转化酵母细胞，发现OsbZIP23作为转录激活因子而发挥功能。用OsbZIP23-绿色荧光蛋白在洋葱(Allium cepa 细胞中瞬时体现确定了该蛋白在核内定位。同步还发现，体现OsbZIP23转基因水稻体现出对干旱、高盐很强耐受性以及对ABA 敏感性。并且，该基因无效突变体对高浓度ABA 、高盐和干旱胁迫体现出明显敏感性减少及耐受性减少，该表型可通过将OsbZIP23转导该突变体而得到弥补，暗示其在胁迫耐受遗传改良方面具有潜在应用价值。质外体蛋白在水稻盐胁迫中也饰演了重要角色。Zhang 等[15]用200mmol/LNaCl 对10日龄水稻进行处理，然后用二维蛋白质电泳对抽提质外体进行
了分析，发现其中一种质外体蛋白具有富含半胱氨酸功能域(DUF26胞外构造域——OsRMC 。该蛋白在盐胁迫初期对盐胁迫应答提高非常明显。应用RNAi 技术，确定了其在转基因水稻盐胁迫应答中功能。成果表明，与非转基因水稻相比，在转基因水稻中下调OsRMC 体现水平可以使种子发芽缓慢、生
长克制状况得到缓和，同步提高了水稻对NaCl 盐胁迫耐受性。
1.3Na +/H+反向转运蛋白基因
Fukada [16]等初次从单子叶植物水稻中克隆得到了水稻液泡膜Na +/H+逆向运送蛋白基因OsNHX1。为确

定OsNHX1产物在细胞内定位，Fukuda 等[17]运用OsNHX1产物特异性抗体对其详细定位进行了分析，成果发现OsNHX1体现产物定位于液泡膜，成果暗示了OsNHX1基因编码液泡(Na+、K +/H+ 反向转运体。高浓度NaCl 和KCl 处理都可以提高OsNHX1在水稻根和地上部OsNHX1转录，OsNHX1受盐和甘露醇处理诱导体现，过量体现OsNHX1可以提高水稻耐盐性[17]。Ohta [18]运用耐盐植物野滨藜(Atriplex fera 液泡膜逆向转运蛋白AgNHX1过量体现，提高转基因水稻耐盐性。液泡膜上OsNHX1在将Na +以及积累于细胞质中K +运送到液泡区室化过程中饰演了重要角色，阐明反向转运体数量是决定水稻盐胁迫重要原因。Kader 等[19]研究发现OsHKT2(K+/Na+共转运体 和OsVHA(盐胁迫下液泡Na +/H+反向转运体激发器 诱导多数发生于韧皮部、韧皮部到叶肉细胞过渡部分和叶片叶肉细胞。邱生平等[20]通过RT-PCR 技术从水稻幼苗组织中克隆了一种新Na +/H +逆向转运蛋白基因OsNHX2，成果表明，水稻2个液泡膜Na +/H+逆向转运蛋白基因OsNHX2、OsNHX1在盐敏感程度不一样水稻品种中体既有所不一样，液泡膜Na +/H+逆向转运蛋白基因转录调控也许是决定水稻耐盐能力一种重要原因。1.4其他基因Katsuhara [21]将大麦HvPIP2;1基因转入水稻，得到转基因水稻。HvPIP2;1过量体现提高了水稻根保水性达140%，茎杆到根到达150%。使得生长在100mmol/LNaCl 盐胁迫下转基因水稻，生长速度不小于非转基因植株。Hu [22]通过研究展示了胁迫应答基因SNAC1过量体现明显提高了转基因水稻对干旱耐受性(比对照组发芽率高22%~34%，这些水稻是生长于大田、处在极度干旱胁迫条件下，且处在发育阶段，没有表型变化和产量上损失。转基因水稻在幼苗期体现出对干旱和盐耐受性明显提高。SNAC1重要在保卫细胞中通过干旱诱导体现出来，编码具有转录激活活性NAM ，ATAT 和CUC(NAC转录因子。DNA 芯片分析显示，在过量体现SNAC1水稻中，大量胁迫有关基因体现出上调。数据暗示SNAC1在通过水稻对干旱和盐耐受方面具有良好应用前景。2耐盐有关新基因克隆建立盐胁迫下水稻cDNA 文库是筛选盐胁迫有关基因最佳措施。Qian 等[23]构建了盐胁迫下和没有盐胁迫水稻cDNA 文库，通过差异筛选得到3个盐胁迫应答克隆，Ts1、Ts2、Ts3这3个克隆分别定位于1、3、7号染色体上。Northern blotting 分析显示在盐胁迫3h 内Ts1和Ts2转录水平提高，并在24h 内保持高水平，然而Ts3转录水平在3h 内到达高峰。
Rabbani [24]等运用干旱、寒冷、高盐处理水稻植株cDNA 文库，建立了cDNA 微阵列，微阵列中包括了1700种cDNA 。最终他们鉴定了73个胁迫诱导基因，其中包括了58个新未见报道基因。其中，第36、
62、57和43号基因分别是由寒冷、干旱、高盐和ABA 诱导体现。发现，胁迫应答基因体既有很强有关性，并且发现了对上述4种处理而应答15个基因。分析发现，在因干旱、ABA 和高盐胁迫而产生信号途径之间有很强有关性，该有关性比因寒冷、ABA 胁迫或寒冷与高盐胁迫所引起信号有关性强。同步转录组分析显示，水稻中存在与拟南芥中不一样源胁迫诱导基因。
李子银等[25]运用差异显示PCR(RT-PCR技术从水稻中克隆了2个受盐胁迫诱导和1个受盐胁迫克制cDNA 片段，分别代表了S-腺苷蛋氨酸脱羧酶(SAMDC基因、水稻翻译延伸因子1A 蛋白(eEF1A基因家族中新组员(称为REF1A 以及一种功能未知新基因(命名为SRG1 。深入运用RT-PCR 技术克隆了SAMDC 基因全长cDNA 序列(SAMDC1，发现该
基因序列与其他植物及酵母、人类SAMDC 基因均
有一定同源性。Northern 杂交成果显示，SAMDC1和REF1A 基因转录均明显受盐胁迫诱导，而SRG1基因转录在盐胁迫6h 后即受到克制。Southern 杂交分析表明SAMDC1和SRG1基因在水稻基因组中均以单拷贝存在，而REF1A 基因则检测到多种拷贝。
运用ZYQ8/JX17组合构建DH 群体和RFLP 图谱将REF1A ，SAMDC1和SRG1基因分别定位在水稻第3，第4和第6染色体上。
Lin 等[26]通过用高度耐盐水稻品种与感盐品种构建群体和分子标识进行耐盐QTL 定位分析，共定位得到11个控制水稻耐盐性状QTL 。发现其中有2个是遗传效果较大主效QTL ，一种是位于第1号染色体、控制盐胁迫下K +含量SKC1，它通过增长K +(营养元素 含量而有助于增长耐盐性；另一种是位于第7染色体、控制Na +含量SNC7，它通过减少Na +含量而有助于增长耐盐性。Ren 等[27]成功克隆了与水稻耐盐有关数量性状基因SKC1，并阐明了该基因
生物学功能和作用机理。发现SKC1编码蛋白是钠离子特异性转运蛋白而不直接运送钾离子，钾离子含量变化是由于钠离子竞争引起；该蛋白定位于陈煜等：水稻耐盐有关基因克隆及转化研究进展·
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细胞膜上，在耐盐水稻品种中其功能活性明显强于感盐品种。这对水稻耐盐遗传育种研究有重要学术意义和一定应用前景。HAL3是前人在筛选酵母耐盐基因过程中分离克隆抗逆有关基因，研究发现其编码一种增进细胞分裂以及提高耐盐性核黄素蛋白，其过量体现不仅可以提高植物耐盐性，还可以加速植物生长。Sun 等[28]对水稻中HAL3同源基因OsHAL3开展了功能和作用机理研究发现，这一基因介导了一种与一般光受体模式不一样光控发育机制。这是第一次发现HAL3饰演细胞分裂信号传导角色。Huang 等[29]通过图位克隆措施分离克隆了控制抗逆性状基因DST ，该基因编码一种只具有一种C2H2类型锌指构造域蛋白。过氧化氢是一种重要
诱导气孔关闭信号分子。DST 作为抗逆性负调控因子，当其功能缺失时可直接下调过氧化氢代谢有关基因(如过氧化物酶基因 体现，使清除过氧化氢能力下降，从而增长过氧化氢在保卫细胞中累积，促使叶片气孔关闭，减少水分蒸发，最终提高水稻抗旱耐盐能力。3问题与展望水稻基因组测序完毕是水稻研究一种里程碑，使人类在基因组水平上对水稻有了更深入地理解，使得某些老式学说、假说受到挑战，但这并不意味这所有问题可以迎刃而解。植物耐盐机理较复杂，从植株水平到细胞水平、分子水平，波及信号传递、基因调控、蛋白质翻译与体现等一系列复杂体系。至今尚未能完全弄清晰。国内外学者从不一样角度去研究、分析与水稻盐胁迫有关机理，已经获得了很大进步。近年来进行了植物耐盐胁迫功能基因组研究，即运用盐胁迫特异性体现序列标签(EST和cDNA 微阵列(或基因芯片 技术筛选胁迫有关基因，然后在拟南芥中超量体现或通过基因敲除等技术对初步筛选基因进行功能研究，再运用酵母双杂交等技术对基因间互相关系及基因产物间互相作用做深入研究[5]。水稻耐盐性状是数量性状，不仅仅是某个基因在单独发挥作用，也许是几种基因或更多基因起作用成果。因此，采用复合基因方略有助于获取高度耐盐转基因植株。郭龙彪等[30]采用双价基因共转化和杂交选育措施聚合了2~5价耐盐基因，得到了不一样耐盐能力转基因植株。王慧中等[10]通过农杆菌介导法将mtlD 、gutD 基因同步整合进水稻基因组并且在转基因水稻中得到体现，与未转基因对摄影比，转基因植株耐盐性明显提高。
尽管转基因水稻安全性仍颇具争议，不过转基因水稻将会在未来发挥其巨大作用。华中农大作物遗
传改良国家重点试验室研发2个转基因水稻品种“华恢1号”和“Bt 汕优63”，已获得农业部下发转基因水稻生产应用安全证书。安全证书有效期为8月17日—8月17日，种植区域限定在湖北省[31]。这意味着未来3~4年间转基因水稻将进入商业化生产应用，在未来加强转基因基础研究工作、转基因技术与常规育种技术有机结合，转基因水稻商业化生产。未来，一定能克服并处理因土壤盐碱
化而带来水稻种植问题甚至整个世界粮食问题，为人类造福。
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