DB43_T+2412-2022鸡冷冻精液制作技术规程.docx

ICS 65.020.30CCS B 4343湖南省地方标准DB43/T 24122022鸡冷冻精液制作技术规程Code of practice for making rooster frozen semen2022- 07 - 08 发布2022- 10 - 08 实施湖南省市场监督管理局发 布目次前言1 范围 12 规范性引用文件13术语和定义 14准备 15精液采集与品质检测26细管精液制作 27细管精液冷冻 38细管冷冻精液解冻及活力检测39细管冷冻精液保存及解冻应用4附录 A（资料性）主要器具与耗材 5附录 B（规范性）冷冻精液用液配制与保存 6附录 C（资料性）精子密度估测方法示例 7附录 D（资料性）精子活力评判方法 8附录 E（资料性）液氮熏蒸法冷冻装置与细管铺放示例9附录 F（资料性）解冻精液应用及输精效果检测10参考文献11前言本文件按照 GB/T 1.12020标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由湖南省农业农村厅提出。本文件由湖南省农业标准化技术委员会归口。本文件起草单位：湖南省畜牧兽医研究所、全国畜牧总站、浏阳市农业发展事务中心、湖南光大牧业科技有限公司、浏阳市湘依园生态农业有限公司、湖南陶氏生态禽业科技发展有限公司。本文件主要起草人：燕海峰、李安定、朱芳贤、宋武、白文娟、李闯、赵晓、张旭、刘伯承、黄璇、邓萍、伍国强、江为民、冯小花、文平、刘海林、朱斌、陶金彪。鸡冷冻精液制作技术规程1 范围本文件规定了鸡冷冻精液制作的准备、精液采集与品质检测、细管精液制作、细管精液冷冻、细管冷冻精液解冻及活力检测、细管冷冻精液保存及解冻应用。本文件适用于鸡细管冷冻精液的制作。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T30396牛冷冻精液包装、标签、储存和运输NY/T1234牛冷冻精液生产技术规程NY/T3458种鸡人工授精技术规程NY/T4047家禽精液品质检测方法3 术语和定义NY/T 3458、NY/T 4047 界定的术语和定义适用于本文件。4 准 备4.1 器具与耗材4.1.14.1.2字母。4.1.3主要器具与耗材准备见附录 A。细管标示按 NY/T 1234 的规定执行，其中制作单位名称标示，采用习惯字母、英文或者拼音首重复使用的器具，使用后立即用清水浸泡。器具清洗和消毒操作按 NY/T 1234 与 NY/T 3458 的规定执行。4.1.4 细管、细管搓板、细管承载泡沫框等细管精液制作用具使用前置于 2 5 保温箱中，温度平衡后待用。4.1.5 水浴解冻保温箱中加入清洁自来水,水深大于 10 cm，放入冰袋或者冰块，保持水温为 2 5 。4.2 用液4.2.1 按照附录 B 配制所有用液。4.2.2 所有用液使用前置于 2 5 操作保温箱中，温度平衡后待用。4.2.3 所有用液与精液吸取前应摇匀。4.3 公鸡挑选与训练按 NY/T 3458 规定执行。4.4 操作环境4.4.1 操作环境应避免污染。4.4.2 冷冻精液制作室环境温度为 20 25 。5 精液采集与品质检测5.1 精液采集前准备5.1.1 根据所采公鸡数量准备规格为 5 mL 的离心管。5.1.2 每只离心管中移入 0.2 mL 稀释液（I 液）。5.2 精液采集与稀释5.2.1 手握加热已移入稀释液（I 液）的离心管，采用双人或单人背腹式按摩采精法采集精液，收集无污染、纯净精液，轻轻摇匀，置于 2 5 采精保温箱中。依次采集完所有公鸡精液，存于采精保温箱带回。5.2.2 在冷冻精液制作室外，将精液从采精保温箱中转移至 2 5 操作保温箱中。液（I 液）等比稀释，存放于 2 5 保温箱中尽快带回，应在精液采集后 4 h 内完成冷冻精液制作。5.3 精液品质检测5.3.1 将显微镜温度设置在 32 ，按照 NY/T 4047 的方法检测精液品质。不同精子密度样品图示见附录 C。精子活力判定见附录 D。5.3.2 用于冷冻的精液应符合下列要求： a） 精子密度不小于 15 亿个/mL；b） 精子活力不低于 70或有效精子数不少于 10.5 亿个/mL。6 细管精液制作6.1 液氮添加至少在细管冷冻前 10 min，将液氮倒入细管熏蒸泡沫箱等容器，液氮深度 3 cm4 cm。6.2 冷冻保护液添加6.2.1 按照精子密度 7.5 亿个/mL、甘油最终浓度 6的冷冻精液制作要求，根据 5.3 检测的精子密度， 选择甘油浓度适宜的冷冻保护液（II 液）并计算添加量。6.2.2 按计算量添加 2 5 的冷冻保护液（II 液），在 2 5 条件下平衡 10 min，准备灌装。6.3 精液灌装6.3.1 人工灌装5.2.3 自采集精液开始计时，宜在 30 min 时开始细管精液制作。如果远距离采集精液，采集后用稀释6.3.1.1 握住细管精液棉塞端，另一端插入待灌装的精液中，分 2 次吸取精液，细管中间段留约 1 cm 空气柱。6.3.1.2 擦干细管外壁残留液体，用热熔、超声波或封口粉封口，存放于 2 5 操作保温箱中。6.3.1.3 采用封口粉封口时，细管端含封口粉 2 mm，擦净细管外壁残留粉末。封口粉应根据需要量现取现用，防止污染。6.3.2 机械自动灌装使用全自动细管精液灌装机灌装时，按操作说明书进行操作。7 细管精液冷冻7.1 液氮熏蒸法7.1.1 将厚度为 1 cm 的细管承载泡沫框套入细管搓板并置于搓板底部。7.1.2 以细管棉塞端指向操作者的方向，将细管铺放在细管搓板上。如需防止细管滑动或便于分组标记，则在细管棉塞端黏贴无纺布医用胶带形成细管带，胶带黏贴应既牢固，又利于浸入液氮后细管之间或胶带与细管间的剥离。7.1.3 平行抬起细管承载泡沫框，将细管从细管搓板整体转移至细管承载泡沫框上。冷冻装置与细管铺放示例见附录 E。氮中。7.2 程序冷冻仪法7.2.1 将细管架置于冷冻室，以-7 /min 速率从 5 下降到-35 ，再以-60 /min 速率从-35 下降到-140 ，于-140 停留 10 min，将细管立即浸入液氮中。7.2.2 其他操作按仪器操作说明书进行。8 细管冷冻精液解冻及活力检测8.1 精液解冻8.1.1 将冷冻细管精液从液氮中取出，迅速浸入 2 5 水浴解冻泡沫箱中水浴 1 min3 min，取出擦干细管表面水分。解冻大批量细管精液时，应及时搅动细管，避免细管瞬间被冰包裹而影响解冻效果。8.1.2 剪掉封口端，用推针从棉塞端将精液推至规格为 2 mL 的离心管中。解冻大批量细管精液时，可同时剪掉多支细管棉塞端，使精液自然流出，并吹出管内余液。细管精液解冻后立即置于 2 5 保温箱中。8.2 精子活力检测8.2.1 用于精子活力检测的细管冷冻精液，应已在液氮中保存 15 min 以上，精液解冻按 8.1 操作。8.2.2 按 5.3.1 检测精子活力，不低于 40为合格。7.1.4 将载有细管的细管承载泡沫框叠加于厚度为 3 cm5 cm 的泡沫框上，浮于已注入液氮的熏蒸泡沫箱液氮面上，细管带离液氮面距离 4 cm6 cm。盖上泡沫箱盖，静置 5 min 后将细管带迅速浸入液9 细管冷冻精液保存及解冻应用9.1 每批次细管冷冻精液应按 10比例随机抽样，按 8.2 检测精子活力，抽检样品全部检测合格判定为批次检测合格。批次检测合格的冷冻精液继续保存，如细管上有胶带则应在液氮中将胶带去除。批次检测不合格的冷冻精液不再保存，进行无害化处理。9.2 合格冷冻精液的包装、标签、储存和运输应符合 GB/T 30396 的规定。9.3 解冻精液应用及输精效果检测见附录 F。附 录 A（资料性） 主要器具与耗材A.1 温度可调恒温显微镜（20 倍物镜）。A.2 程序冷冻仪。A.3 便携式低速冷冻离心机（10 mL,1000g,30 kg）。A.4 超低温温度计（直径 0.5 mm T 型热电偶探头）。A.5 恒温干燥箱。A.6 细管搓板（长 17 cm、宽 9 cm、高 6 cm）。A.7 液氮罐 2 个（每个容量 10 L 以上）。A.8 长柄镊子 2 把、中柄镊子 2 把、剪刀 2 把、细管推针 2 根、插线板 2 个。A.9 自配稀释液设备：渗透压测定仪；酸度计；高压灭菌锅；超净工作台；石英蒸馏水器。A.10 液氮熏蒸法冷冻装置:液氮熏蒸泡沫箱，深不小于 25 cm，厚 4.5 cm，长、宽大于细管承载泡沫框；细管承载泡沫框，1 cm 厚 2 个，4 cm 厚 1 个，框外径 14.5 cm25.0 cm，厚 1.8 cm。A.11 2 5 采精保温箱、操作保温箱。A.12 2 5 水浴解冻保温箱（长 30 cm、宽 30cm、高 20 cm）。A.13 0.25 mL 细管。A.14 封口粉。A.15 医用无纺布透气纸胶带、布胶带、拇指管、拇指管袋、棉线。A.16 标签纸，卫生纸，记号笔，冰袋。A.17 2 mL、5 mL、10 mL 离心管盒及相应离心管。A.18 10 L、200 L、1 mL 移液枪及相应枪头。A.19 载玻片、盖玻片。A.20 精液稀释液。A.21 液氮。磁力搅拌仪；附 录 B（规范性）冷冻精液用液配制与保存B.1 稀释液（I 液）配方稀释液（I 液）配方见表B.1。表 B.1 稀释液（I 液）配方试剂中文名称试剂英文名称或分子式每100 mL稀释液（I液）用量葡萄糖（一水）Glucose monohydrate0.530 g柠檬酸钾（一水）Potassium citrate tribasic monohydrate0.102 gL-谷氨酸钠（一水）L-Sodium glutamate. H2O1.210 g乙酸鎂(四水)Magnesium acetate tetrahydrate0.064 gBES（N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulphonic acid2.430 g氢氧化钠NaOH0.185 gB.2 配制方法B.2.1 稀释液（I 液）称取表 B.1 中试剂定容到 100 mL，稀释液（I 液）pH 为 7.1，渗透压为 320 mOsm/kg。B.2.2 冷冻保护液（II 液）B.2.2.1 12甘油冷冻保护液（12甘油 II 液）取稀释液（I 液）44 mL 加甘油 6 mL，磁力搅拌 30 min 以上。B.2.2.2 18甘油冷冻保护液（18甘油 II 液）取稀释液（I 液）41 ml 加甘油 9 mL，磁力搅拌 30 min 以上。B.2.3 清洗液（III 液）可直接使用稀释液（I 液），也可自配或购买专用清洗液。B.2.4 重悬液（IV 液）可直接使用稀释液（I 液），也可自配或购买专用重悬液。B.3 保存方法2 5 或-20 以下保存。2 5 条件下保存不应超过 24 h，冷冻保存的用液解冻后不应二次冷冻。附 录 C（资料性）精子密度估测方法示例精子密度估测方法示例见图 C.1。a） 精子密度 40 亿个/mLb） 精子密度 20 亿个/mLc） 精子密度 10 亿个/mLd） 精子密度 5 亿个/mL图 C.1 精子密度估测方法示例附 录 D（资料性） 精子活力评判方法精子活力九级评判方法见表 D.1。表 D.1 精子活力九级评判表活力等级（）102030405060708090运动精子数量极少量少量部分较多较多大部分大部分几乎所有所有摆动/直线运动摆动摆动摆动摆动+直线直线直线直线直线直线运动速率几乎无很慢很慢一般较快较快快速快速快速位移大小没有极小较小较大较大较大很大很大很大附 录 E（资料性）液氮熏蒸法冷冻装置与细管铺放示例液氮熏蒸法冷冻装置与细管铺放示例见图 E.1。a） 将细管承载泡沫框套入细管搓板b） 将细管铺放在搓板c） 粘贴无纺布胶带d） 细管承载转移与冷冻图 E.1 液氮熏蒸法冷冻装置与细管铺放示例图附 录 F（资料性）解冻精液应用及输精效果检测F.1 解冻精液应用F.1.1 冷冻离心机温度设置F.1.1.1 离心管装入体积与温度均相当于待离心样品的自来水，置于离心机转子中，根据环境温度高低，设置离心机腔温度-10 2 ，以 600g 离心 10 min，运行 1 轮2 轮。F.1.1.2 用线径 0.5 mm 热电偶电子温度计快速检测离心管中水温，温度 2 5 。温度不符合要求时重新设置离心机腔温度再进行调试。F.1.2 解冻精液稀释在解冻后精液（见 8.1）中加入清洗液（III 液）进行稀释。按解冻后精液与清洗液（III 液）比例分别为 10.035、10.09、10.165、10.3、10.62 和 10.79 的要求，分 6 次、每次间隔 2 min 加入清洗液（III 液），最终比例为 12。每次加入后都应轻轻混匀。示例：当解冻后精液体积为 1 mL 时，加入清洗液（III 液）的体积与比例依次为 35 L （10.035）、90 L（1 0.09）、165 L（10.165）、300 L（10.3）、620 L（10.62）和 790 L （10.79），添加清洗液（III 液）总体积为 2 mL。F.1.3 离心、重悬去除甘油F.1.3.1 将稀释后精液（见 F.1.2）以 600g 离心 10 min，用移液枪彻底吸除上清。F.1.3.2 加入与解冻后精液（见 8.1）等体积的重悬液（IV 液）重悬沉淀，混匀，以 600g 离心 10 min， 用移液枪彻底吸除上清。F.1.4 精液使用在去除甘油的解冻精液（见 F.1.3）中加入与解冻后精液（见 8.1）等体积的重悬液（IV 液）重悬沉淀，存放于 2 5 保温箱或冰水混合物杯中，立即用于输精。F.2 输精效果检测F.2.1 在 16:00 以后，每只母鸡输精 0.2 mL （有效精子数不少于 4 千万个），输精深度 4 cm。F.2.2 前 2 d 每天输精 1 次，随后每 72 h 输精 1 次，总输精次数一般为 5 次。F.2.3 第一次输精 24 h 后开始收集种蛋，最后一次输精后第 4 d 停止收集种蛋。F.2.4 收集的种蛋按 GB/T 40454 规定的方法进行孵化。按 NY/T 823 给出的方法，检测、计算种蛋的受精率、受精蛋孵化率。F.2.5 种蛋的受精率、受精蛋孵化率、冷冻精液精子活力等数据可用于冷冻精液精子活力与冷冻精液孵化效果的相关性分析。参 考 文 献1 GB/T 40454 家禽孵化良好生产规范2 NY/T 823 家禽生产性能名词术语和度量计算方法