DB15T+2956-2023马铃薯干腐病菌PCR检测方法.docx

ICS65.020.01CCSB 1615内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准DB15/T 29562023马铃薯干腐病菌 PCR 检测方法Detection of pathogenic fungus for potato dry rot by PCR method2023-04-26 发布2023-05-26 实施内蒙古自治区市场监督管理局发 布目次前言II1 范围12 规范性引用文件13 术语和定义14 原理15 试剂与仪器1试剂1溶液配制1仪器26 操作步骤2对照的设立2取样2马铃薯组织样品 DNA 提取2PCR 扩增27 琼脂糖凝胶电泳38 结果3试验成立的条件3结果判定3前言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由内蒙古自治区农牧厅提出。本文件由内蒙古自治区马铃薯标准化技术委员会（SAM/TC 40）归口。本文件起草单位：内蒙古自治区产品质量检验研究院、内蒙古中加农业生物科技有限公司、乌兰察布市检验检测中心、内蒙古朱日和镇综合保障和技术推广中心。本文件主要起草人：刘晓权、赵莉、张键、吕文霞、高俊、齐桂敏、任玮、赵欣、孙翠翠、孙辉远、姜涛、王斌、常青、李燕、田艳花、包美丽、刘广晶、连普琛、俎爱忠、毕晓宇、董林峰、李建青、姬媛琦、陈曦、胡越然、王勐。马铃薯干腐病菌 PCR 检测方法1 范围本文件规定了马铃薯干腐病菌PCR检测方法。本文件适用于马铃薯块茎中干腐病菌的检测。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。马铃薯干腐病 potato dry rot由镰刀菌属（Fusarium spp.）真菌引起的病害。该病在马铃薯生长期和贮藏期均可发生，主要危害块茎，病斑多发生于薯块脐部。发病初期薯块表面出现黑褐色凹陷病斑，随后扩大形成轮纹状褶皱； 后期薯块内部变空，整个薯块变硬、变轻、干缩，呈灰褐色或深褐色，干燥时薯块内部长满白色菌丝； 湿度大时发病处变红呈糊状。4 原理本文件采用聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）方法检测马铃薯干腐病菌。其原理是：以马铃薯干腐病菌保守序列设计特异性引物，以基因组 DNA 为模板，在Taq DNA聚合酶的作用下进行PCR扩增，根据PCR扩增结果判断该样品中是否含有目的片段，从而达到鉴定马铃薯干腐病菌的目的。5 试剂与仪器 试剂5.1.1 以下所有试剂，除另有规定外，均使用分析纯试剂；水为符合 GB/T 6682 中规定的一级水。5.1.2 植物基因组提取试剂盒、2Taq PCR Master Mix、无水乙醇、50TAE 电泳缓冲液、溴化乙锭、DNA Marker、6DNA Loading Buffer 等均从试剂公司购买。 溶液配制5.2.1 1TAE 电泳缓冲液量取50TAE电泳缓冲液20 mL，加水定容至1 L。5.2.2 1.5%琼脂糖凝胶称取1.5 g琼脂糖，加入100 mL的1TAE电泳缓冲液，微波炉加热至琼脂糖融化，待溶液冷却至50 左右时，加入5 L溴化乙锭溶液，摇匀，倒入制胶板中均匀铺板，凝固后取下梳子，备用。5.2.3 溴化乙锭溶液（10 mg/mL）称取溴化乙锭100 mg，加水溶解，定容至10 mL。 仪器PCR仪、台式高速离心机（离心力1180 g12470 g）、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像仪、水浴锅、移液器、高压蒸汽灭菌锅、4 冰箱、普通天平（感量0.01 g）。6 操作步骤 对照的设立检测体系以马铃薯干腐病菌的DNA作为阳性对照，以不添加DNA模板的反应体系作为阴性对照。一块地取发病马铃薯块茎组织，将样品保存于4 冰箱中，DNA提取时将马铃薯块茎组织切成0.1 g见方小块，样品需现用现取。马铃薯组织样品 DNA 提取将样品置于灭过菌的研钵中，加液氮研磨成粉末，转至1.5 mL离心管，利用植物基因组DNA提取试剂盒提取。PCR 扩增6.4.1 PCR 扩增引物以核糖体5.8S rDNA 和28S rDNA 基因的间隔序列ITS:（Intergenic Transcribed Spacer ）设计引物，引物序列如下：上游引物：5-TTGGTTGTAGCTGGTCTATTT-3。下游引物：5- TATCACGCTGAGTGGAACCA-3。扩增片段为309 bp。用超纯水将上、下游引物分别配制成工作浓度为10 ng/L的溶液。6.4.2 PCR 反应体系马铃薯干腐病菌PCR扩增反应体系如表1所示，按照以下顺序加入相应试剂到PCR管中，混匀并离心10 s，使混合液都沉降到PCR管底。 取样表1 PCR 扩增反应体系PCR反应物加入PCR反应体系的体积uLddH2O9.52Taq PCR Master Mix12.5上游引物（10 ng/L）1.0下游引物（10 ng/L）1.0模板 DNA1.0总体积25.06.4.3 PCR 反应程序第1步：94 ，4 min。第2步：94 ，40 s；61 ，40 s；72 ，20 s，28个循环。第3步：72 ，7 min。PCR产物置于4 冰箱保存备用。7 琼脂糖凝胶电泳使用1.5%的琼脂糖凝胶，取5 L PCR扩增产物，加到1 L 6DNA Loading Buffer中混匀、上样，用DNA Marker作为分子量标记，进行凝胶电泳。电泳结束后在凝胶成像仪的紫外透射光下观察，凝胶上是否出现预期大小的特异性DNA条带，并拍照记录。8 结 果试验成立的条件阳性对照检测到预期大小的特异性扩增条带，阴性对照没有条带，表明试验有效。结果判定若待检样品在309 bp对应位置出现特异性条带，则判定样品为阳性；若待检样品没有出现条带，则判定为阴性。