DB12_T 1189-2023牛亲子鉴定技术规程-.docx

ICS 65.020.3012CCS B 43天津市地方标准DB12/T 11892023牛亲子鉴定技术规程Technical specification for parentage identification in cattle2023 - 04 - 07 发布2023 - 05 - 07 实施天津市市场监督管理委员会发 布DB12/T 11892023前言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由天津市农业农村委员会提出并归口。 本文件起草单位：天津市农业科学院。本文件主要起草人：马毅、赵欣、陈丽丽、张漫、谭冬飞、赵康、芦娜、王丽学。IDB12/T 11892023牛亲子鉴定技术规程1 范围本文件规定了牛亲子鉴定的技术方法。本文件适用于牛（Bos taurus）亲子鉴定。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法GB/T27642牛个体及亲子鉴定微卫星DNA法NY/T1672绵羊多胎主效基因FecB分子检测技术规程SN/T1193基因检验实验室技术要求3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1等位基因数 allele，A反映群体遗传变异大小的一个指标，其数值越接近所检测到的等位基因的绝对数，表明等位基因在群体中分布越均匀。3.2期望杂合度 heterogosity，He期望杂合度主要是根据种群内当前优势等位基因的分布频率来推算的，稀有基因的贡献极其微弱。3.3多态信息含量 polymorphic information content，PICDNA的多态性指标。nn -1n7PIC= 1 - Pi 2 - 2Pi 2 Pj 2i =1i =1j =i +1Pi和Pj分别为第i个和第j个等位基因频率，n为等位基因数。3.4排除概率 PE在亲子鉴定中一个随机的个体被排除为亲生父亲的概率，是评价微卫星标记在亲子鉴定中实用价值大小的一个指标。(1) 当没有另一亲本信息时，排除子代与假设亲本是亲子关系的排除概率：nnnnp = 1- 4 Pi 2 + 2( Pi 2 )2 + 4 Pi 3 - 3 Pi 43.5(2) 累计排除概率：CPE= 1 - (1 - P1)(1 - P 2)L (1 - Pk )微卫星 DNA microsatellite又称短串联重复序列（STR）或简单重复序列（SSR），一类广泛存在于真核生物基因组中的，核心 序列为26 bp，重复次数通常为1530次的DNA串联重复序列。3.6多重聚合酶链反应 multiplex PCR又称多重引物PCR或复合PCR，在同一PCR反应体系中加入两对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应。4 鉴定原理利用常染色体微卫星分型技术，选取不同染色体上的微卫星位点，采用多重PCR技术扩增微卫星标记，检测微卫星位点的遗传多态性，分型得出各位点等位基因的大小，通过软件统计分析，确定或排除 亲子关系。5 试剂配制水为符合 GB/T 6682 的一级水；高压灭菌条件为 1.034105 Pa 压力，蒸汽灭菌 20 min。试剂配制如下：ACD 抗凝剂：柠檬酸 0.48 g、柠檬酸钠 1.32 g、葡萄糖 1.47 g，定容于 100 mL 水中，高压灭菌；10% SDS（十二烷基硫酸钠）：100 g SDS 溶于 90 mL 水中，加热至 68助溶，用 HCl 调 pH 至 7.2，定容至 1000 mL，0.2 m 的滤膜过滤，高压灭菌；PBS（磷酸缓冲液）：8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na2HPO4、0.24 g KH2PO4 溶于 800 mL 蒸馏水中，用 HCl 调 pH 至 7.4，加水定容至 1000 mL，高压灭菌，室温保存；0.5 mol/L NaCl（氯化钠）：5.844 g NaCl 溶于双蒸水中，加水定容至 200 mL，高压灭菌；蛋白酶 K（20 mg/mL）：200 mg 蛋白酶 K 定溶于 10 mL 水中，以 1 mL 分装，-20冷冻保存；氯仿：异戊醇（24：1）：异戊醇 2 mL 加入到 500 mL 的氯仿试剂瓶中，混匀；1 mol/L Tris-HCl（pH=8）：将 121.1 g Tris 溶于 800 mL 水中，加浓盐酸调 pH 至 8.0，容至 1000 mL，高压灭菌；0.5 mol/L EDTA（pH=8）：800 mL 水中加入 186.1 g EDTA-Na22H2O（二水合乙二胺四乙酸二钠），在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用 NaOH 调节溶液 pH 至 8.0，然后容至 1000 mL，高压灭菌；TE 缓冲液：取 1 mol/L Tris-HCl（pH=8）10 mL，0.5 mol/L EDTA（pH=8）2 mL，加水定容至 1000 mL，高压灭菌，室温保存；血样裂解液：1 mol/L Tris-HCl（pH=8）1 mL，0.5 mol/L EDTA（pH=8）20 mL，10% SDS 5 mL， 双蒸水 74 mL；精子 DNA 抽提液：称取二硫苏糖醇 0.06 g 与 1 mL 0.5 mol/L Tris-HCl，0.5 mol/L EDTA，0.5 mol/L NaCl，2 mL 10% SDS 混合后，补水至 10 mL；50TAE 缓冲液：Tris-base 242 g，冰乙酸 57.1 mL，0.5 mol/L EDTA（pH=8）100 mL，加水定容至 1000 mL。使用时稀释 50 倍或 100 倍 即 1TAE；2%琼脂糖：2g 琼脂糖充分溶解于 50TAE，定容至 100 mL；琼脂糖电泳上样缓冲液：0.25%溴酚蓝；0.25%二甲苯菁 FF；40%蔗糖水溶液；10Buffer：0.05%色素溴酚蓝；MgCl2（50 mmol/L）：分子量为 95.211，计算配制所需固体溶质的质量，用托盘天平称取固体 MgCl2 加入一级水溶解；dNTP（10mmol/L）：dNTP 溶于 pH 为 7.0 的 NaOH 贮存液中，最初的贮存液可稀释到 10mol/L， 分装后存放在-20冰箱中；Taq DNA 聚合酶：Taq DNA 聚合酶长为 832 个氨基酸,分子量为 94 Kd。该酶可以广泛用于 PCR、RT-PCR 和加尾反应等；GoldView：可代替溴化乙锭（EB）的新型核酸染料；6DNA Loading Buffer：0.05% 色素溴酚蓝；0.05% 二甲苯菁 FF；2000 bp DNA Marker：2000 DNA Marker 是由 2000 bp、1000 bp、750 bp、500 bp、250 bp 以及 100 bp 共 6 条线状双链 DNA 片段组成，保存于 1DNA Loading Buffer 中，可直接用于电泳分析；去离子甲酰胺：产品规格：100 mL，分子式：CH3NO，分子量：45.04；四甲基罗丹明（TAMRA）：溶剂：DMSO，储存条件 20C 干燥避光保存有效期为 12 个月。6 仪器设备6.1 单道可调移液器0.252.5 L、110 L、220 L。6.2 基因扩增仪温度范围099，样品规格960.2 mL，反应体积10100 L。6.3 离心机最高转速12000 r/min，最大容量241.5 mL。6.4 恒温振荡器0200 r/min，060。6.5 电子天平万分之一精度。6.6 旋涡混合器转速2800 r/min，工作台直径110 mm。6.7 手持式均质器转速范围500035000 rpm，处理量0.05100 ml。6.8 紫外分光光度计波长范围2001000 nm。6.9 凝胶成像分析系统有胶像素12801024，检测灵敏度DNA0.05 ng。6.10 稳压稳流电泳仪输出电压0600 V，输出电流0100 mA。6.11 水平电泳槽外形尺寸182 mm85 mm5 mm，凝胶板面积60 mm60 mm。6.12 高压灭菌锅使用温度范围45135，最高使用压力0.255 Mpa。6.13 自动双重纯水蒸馏器功率3000 W，出水量2500 mL/h。6.14 微波炉容积20 L。6.15 干燥箱温控范围50300，箱内尺寸350 mm350 mm450 mm。6.16 冰箱4，-20。7 检测方法7.1 样本采集与保存静脉采集血样35 mL，复方枸橼酸钠注射液（ACD）抗凝，4可以保存35 d，-20可以保存一个月，-80可以保存一年。对公牛，亦可采集23剂细管精液，液氮保存。7.2 DNA 提取按 GB/T 27642规定的方法执行。7.3 DNA 浓度和纯度检测按NY/T 1672的规定执行。7.4 引物序列引物序列参考联合国粮农组织（FAO）和国际动物遗传学会（ISAG）的推荐引物。9个微卫星标记分 为4个扩増组合，具体按照附录A。7.5 PCR 扩増7.5.1 多重 PCR 扩増体系产物扩增分4次PCR反应完成。同一扩増组合的引物加入同一PCR反应管中，25 L反应体系： 10Buffer 2.5 L、50 mmol/L MgCl2 1.2 L、10mmol/L dNTP 0.6 L、Taq DNA聚合酶2 L、10 mol/L引物（扩増组合）各1.0 L、待测个体模板DNA（或者阳性对照DNA）100 ng、加一级水至反应总体积为25 L。PCR扩增时设计阴性对照（一级水作为模板）。7.5.2 PCR 扩増条件94预变性5 min；94变性30 s，5760.5退火30 s，35个循环；72延伸5 min，4保存。7.6 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳检测7.6.1 先用水清洗制胶板，再用 1TAE 冲洗一次，水平放置。7.6.2 根据电泳胶板的规格和检测样品的数量，配制 2%的琼脂糖溶液，在微波炉中加热融化至溶液澄清透明，室温下冷却至 60时，加入 goldview 并混匀，使 goldview 的终浓度为 0.5 g/L。7.6.3 将混合液缓慢倒入制胶板中，排除气泡，插入多齿梳子。待凝胶凝固后，拔出梳子，将凝胶转移至水平电泳槽中，往电泳槽中加入 1TAE 缓冲液，使电泳缓冲液没过胶面。7.6.4 将待检 PCR 产物 5 L 和上样缓冲液（6DNA Loading Buffer）以 5：1 的比例混合均匀，加入点样孔；同时选择点样孔点上 5 L 2000 bp DNA Marker 作参照。恒压 100 V，电泳 30 min。电泳结束后于凝胶成像系统观察，并分析记录。7.7 微卫星 DNA 多态性分析PCR产物、去离子甲酰胺和TAMRA内标按 0.5 L：10 L：0.5 L比例混合，95变性15 min，遗传分析仪测序，配套软件分析微卫星的基因型。FAM、HEX和TANRA分别表示蓝色、绿色和黑色。8 结果判定8.1 多重 PCR 产物检测若多重 PCR 均出现清晰条带，表明产物扩增成功，可以进行测序，见图 1。注：从左至右依次为参照、组合1、组合2、组合3及组合4（见附录A ）。图 1 多重 PCR 产物 2%琼脂糖凝胶电泳图8.2 微卫星标记分型利用遗传分析仪对微卫星标记进行基因分型。检测个体的9个微卫星标记的基因分型结果，根据相对荧光强度和片段大小，可获得待测个体不同STR标记的基因型。不同亲缘关系的个体，其微卫星标记的等位基因大小不同，表现出不同的基因型，阳性对照样品9个STR标记不同等位基因的大小按附录B所示。8.3 亲子关系判定根据待检个体STR标记的基因型，计算其等位基因数（A）、期望杂合度（He）和多态信息含量（PIC） 等指标分析微卫星标记多态性，计算累积非父排除概率（CPE）分析标记的亲子鉴定效力（按照附录C）。根据孟德尔遗传定律以及STR位点分型来判断亲子关系，如果两者之间孟德尔错误的位点数是0，则判断为亲子关系。9 废弃物处理按照NY/T 1672的规定执行。10 交叉污染防止措施按照SN/T 1193的规定执行。AA附 录A（规范性）微卫星基因座及其引物序列微卫星基因座及其引物序列见表A.1。表 A.1 微卫星基因座及其引物序列扩增组合基因座引物序列（5-3）退火温度（）片段范围（bp）荧光标记1TGLA53GCTTTCAGAAATAGTTTGCATTCA ATCTTCACATGATATTACAGCAGA55150-189TANRAINRA23GAGTAGAGCTACAAGATAAACTTC TAACTACAGGGTGTTAGATGAACTC55190-220HEX2BM1824GAGCAAGGTGTTTTTCCAATC CATTCTCCAACTGCTTCCTTG53.8170-210HEXTGLA122CCCTCCTCCAGGTAAATCAGC AATCACATGGCAAATAAGTACATAC53.8137-190TANRA3SPS115AAAGTGACACAACAGCTTCTCCAG AACGAGTGTCCTAGTTTGGATGTG63235-270HEXBM2113GCTGCCTTCTACCAAATACCC CTTCCTGAGAGAAGCAACACC63118-143FAM4TGLA126CTAATTTAGAATGAGAGAGGCTTCT TGGTCCTCTATTCTCTGAATATTCC58112-130FAMETH10GTTCAGGACTGGCCCTGCTAACACCTCCAGCCCACTTTCTCTTCTC58205-225HEXETH225GATCACCTTGCCACTATTTCCTACATGACAGCCAGCTGCTACT58133-165TANRADB12/T 11892023BB附 录B（规范性）9 个多态微卫星位点的遗传信息9个多态微卫星位点的遗传信息见表B.1。表 B.1 9 个多态微卫星位点的遗传信息标记名称片段长度范围（bp）等位基因数期望杂合度（He）多态信息含量（PIC）BM211315070.8420.759SPS115250-30090.9250.853TGLA53150-20050.8080.717INRA23200-25040.6750.570BM182420050.7750.682TGLA122150-20060.8500.768ETH225150-20060.8330.748ETH10200-25030.5080.427TGLA12650-1000002CC附 录C（规范性） 各座位 PE 及 CPE各座位PE及CPE表C.1。表 C.1 各座位 PE 及 CPE标记名称非父排除率（PE）累计非父排除率（CPE）BM21130.5840.999890419SPS1150.426TGLA530.648INRA230.785BM18240.684TGLA1220.576ETH2250.603ETH100.886