PCR引物流程设计详解.doc

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PCR引物设计流程详解
本文目的：复制出IL-4基因片段

一、 查找基因序列
1、 进入NCBI主页，下拉选框选择Nucleotide，在搜索栏输入要查找的目的基因，即IL-4，点击搜索

2 、在搜索结果选择灵长类（Homo sapiens）

2、 在灵长类IL-4基因中选择需要的mRNA序列

3、 查看基因的相关信息

外显子区域

CDs区域

4、 点击FASTA格式，并将序列保存到文档

二、 使用primer premier 5.0设计引物
1、 建立新文件，将所得的序列复制进输入框内

2、 点击搜索按钮，搜索引物

3、 设置引物设计参数（因为在之前查找基因序列的时候获知，外显子区域分别为：1-200、201-248、249-425、426-618，又知在引物设计时引物位置最好跨越一个内含子，PCR产物长度通常为100-150bp，故设定上游引物位置为201-248，下游引物位置为249-425，产物长度为100-150bp）

4、确认条件后，显示搜索结果

4、 双击选中得分最高的引物查看引物情况

（上图为上游引物情况，下图为下游引物情况）

5、 将设计的上下游引物复制出来，保存到文档中

三、 使用oligo 6.0对设计的引物进行评价
1、 建立新文件，将从cnki上获得的cDNA复制进输入框，并点击accept接收

2、 接收后显示出该序列的相关信息

3、 点击edit按钮录入用primer设计的上游引物，每一次输入新数据后都需要点击accept按钮接收

4、 同理，录入下游引物

5、 分析上下游引物二聚体形成情况

6、 分析上下游引物发卡形成情况

7、 分析上下游引物GC%

8、 检测上下游引物与PCR模板其它位置错配情况

9、 分析PCR整体情况

四、 引物特异性检验（primer blast）
1、 进入NCBI主页，并选择blast

2、 选择primer blast

3、 在输入框内输入模板序列和上下游引物，并设定对比数据库，点击get primer进行对比

4、 查看blast结果

Blast 结果显示，尽管IL-4与其它基因有相似区，但是引物的3’端没有完全互补。故设计的引物能特异性的扩增出目的基因
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