液相色谱∕质谱联用.ppt

液相色谱液相色谱/质谱联用质谱联用主讲教师杜振霞LC/MS导论LC/MS的历史1917电喷雾(Electrospray)被发现(并非为了MS)60s-70s大气压电离(APcI)源被发现70s-80s开始广泛研究LC/MS1979传送带式LC/MS接口成为商业产品1982粒子束LC/MS接口出现1984第一台电喷雾MS仪宣告诞生1988电喷雾离子源MS首次应用于蛋白质的分析仪器参数质量扫描范围:2-3000Da 质量稳定性:0.2 amu/24h 质量精度 5000 amu/sec(Profile 或 Centroid 模式)扫描方式：全扫描/SIR/MRM/母离子扫描/子离子扫描/中性碎片丢失扫描/正负离子扫描灵敏度:(ESI+)5pg Reserpine 进样（200ul/min），S/N500:1（m/z609-195）(ESI-)50pg Raffinose进样（200ul/min），S/N50:1（m/z503-179）(APCI+)100 pg17-Hydroxy-Progesterone 进样（200ul/min），S/N70:1 分辨率:质谱扫描全程R 2.5M定量线性范围：105（1-10pg 保证线性定量）仪器用途 该系统是Waters-Micromass公司在2005年推出的一款最新高质量三重四极杆串联液质联用仪，它能广泛应用于医药、农药、生物化学、食品安全、环保、生命科学等领域，它是解决不易挥发、热不稳定、大分子量及宽极性范围等样品分析难题的强有力工具。通过高灵敏度的串联质谱系统，结合高效液相色谱的分离或直接进样可以详细地研究未知组分的结构。从分子水平上准确阐述样品的化学成分，也十分适合新产品、新配方的开发研制，同时可准确和深入地了解各种化合物的实质性差异，并实时定性、定量地描述样品中的复杂组分的产生和变化过程。对科研有明确的指导作用。该系统有极高的灵敏度，因此特别适用于环境监测，医院的临床诊断，法医鉴定，药物代谢，生物体液的代谢跟踪，食品和饮料污染监控，还适用于科学研究残留农药及其在环境中的衍生物的检测、鉴定，农业品种改良科研中对植物生长素以及其他新型添加剂的结构分析,环保型生物农药等新型物质及天然产物的结构确定及分子量确定等。LC可以直接分析不挥发性化合物、极性化合物、热不稳可以直接分析不挥发性化合物、极性化合物、热不稳定化合物和大分子化合物定化合物和大分子化合物(包括蛋白、多肽、多糖、多聚包括蛋白、多肽、多糖、多聚物等物等)，分析范围广，而且不需衍生化步骤。，分析范围广，而且不需衍生化步骤。MS是强有力的结构解析工具，能为结构定性提供较多的是强有力的结构解析工具，能为结构定性提供较多的信息，作为理想的色谱检测器，不仅特异性强，而且具有信息，作为理想的色谱检测器，不仅特异性强，而且具有极高的检测灵敏度。自极高的检测灵敏度。自1983年年McLaffeny等等 开发串联质开发串联质谱技术谱技术(MSMS)以来，经过短短十几年的发展，串联质以来，经过短短十几年的发展，串联质谱已成为一种成熟的技术，在许多领域发挥了巨大作用。谱已成为一种成熟的技术，在许多领域发挥了巨大作用。串联质谱法是指质量分离的质谱检测技术，在单极质谱给串联质谱法是指质量分离的质谱检测技术，在单极质谱给出化合物相对分子量的信息后，对准分子离子进行多级裂出化合物相对分子量的信息后，对准分子离子进行多级裂解，进而获得丰富的化合物碎片信息，确认目标化合物，解，进而获得丰富的化合物碎片信息，确认目标化合物，对目标化合物进行定量等，有分离、结构解析同步完成的对目标化合物进行定量等，有分离、结构解析同步完成的特点，能直接分析混合物组分，有高度的选择性和可靠性，特点，能直接分析混合物组分，有高度的选择性和可靠性，其检测水平可以达到其检测水平可以达到pg级级LC/MS 分析流程示意图离子源（IONSource）大气压电离(API)离子化过程发生在大气压下(与在真空下的电离有本质的不同,例如,EI电子轰击离子源)API（大气压电离）技术包括：ESI-电喷雾离子源APCI-大气压化学电离源大气压电离(API)原理基础大气压电离原理简介电喷雾(Electrospray,ESI)(1)机理(2)影响被分析物响应的因素(3)多电荷离子大气压化学电离(APcI)大气压电离(API)技术ESI和APCI共同点:使用高电压元件和充气喷雾法产生气相离子通常产生(M+H)+或(M-H)-等准分子离子产生极少的碎片，但可以控制产生结构碎片非常灵敏的技术大气压电离(API)技术一般而言,ESI和APCI不同点:(1)生成离子方式不同ESI-液相离子化APCI-气相离子化(2)样品兼容性ESI-极性化合物和生物大分子APCI-非极性,小分子化合物(相对于用ESI电离的化合物而言)且有一定的挥发性(3)流速兼容性ESI-0.001到1mL/minAPCI-0.2到2mL/min电喷雾离子源电喷雾离子化分为三个过程:形成带电小液滴溶剂蒸发和小液滴碎裂最终形成气相离子在在ESI高压电极处施以正的高电压高压电极处施以正的高电压,小液滴从毛细管高小液滴从毛细管高速喷出而带有过量的正电荷。速喷出而带有过量的正电荷。当在当在ESI高压电极处施以负的高电压，小液滴从毛细高压电极处施以负的高电压，小液滴从毛细管高速喷出而带有过量的负电荷。管高速喷出而带有过量的负电荷。影响化合物ESI电离的因素化合物的浓度基质的性质化合物的表面活性流速流速对API的影响大气压化学电离源（APCI）大气压化学电离大气压化学电离（atmospheric pressure chemical ionization APCI)APCI的结构与电喷雾源大致相同，不同之处在于的结构与电喷雾源大致相同，不同之处在于APCI喷喷嘴的下游放置一个针状放电电极，通过放电电极的高压放嘴的下游放置一个针状放电电极，通过放电电极的高压放电，使空气中某些中性分子电离，产生电，使空气中某些中性分子电离，产生H3O+,N2+,O2+O+等离子，溶剂分子也会电离，这些等离子，溶剂分子也会电离，这些离子与分析物分子进行离子与分析物分子进行离子离子-分子反应，使分析物分子离子化，这些反应过程包分子反应，使分析物分子离子化，这些反应过程包括由质子转移和电荷交换产生正离子，质子脱离和电子捕括由质子转移和电荷交换产生正离子，质子脱离和电子捕获产生负离子等。获产生负离子等。大气压化学电离源主要用来分析中等极性的化合物，有些大气压化学电离源主要用来分析中等极性的化合物，有些化合物由于结构和极性方面的原因，化合物由于结构和极性方面的原因，ESI不能产生足够强不能产生足够强的离子，可以采用的离子，可以采用APCI 方式增加离子产率。方式增加离子产率。APCI 主要主要产生的是单电荷离子，所分析的化合物分子量一般小于产生的是单电荷离子，所分析的化合物分子量一般小于1000Da.质量分析器质量分析器选择一定质量的离子通过一级质谱选择一定质量的离子通过一级质谱(MS1)，使其进入碰撞室，与室，使其进入碰撞室，与室内充有的碰撞气体内充有的碰撞气体(常用气体为常用气体为He，Ar，Xe等等)进行碰撞诱导裂解进行碰撞诱导裂解(collisioninduced dissociation，CID)，发生离子一分子碰撞，发生离子一分子碰撞反应，产生子离子，再经第二级质谱反应，产生子离子，再经第二级质谱(MS2)进行分析进行分析三重四极杆相对于单击四极杆的优势就在于三套四极杆同时工作，三重四极杆相对于单击四极杆的优势就在于三套四极杆同时工作，这时不但可以进行简单的定量工作，还可以对样品的结构进行定性这时不但可以进行简单的定量工作，还可以对样品的结构进行定性的分析；并且可以结合四极杆突出的定量能力，对样品进行高质量的分析；并且可以结合四极杆突出的定量能力，对样品进行高质量的定性、定量同步分析。三重四极杆中有三把四极杆，其中只有前的定性、定量同步分析。三重四极杆中有三把四极杆，其中只有前后两把是高精度的四极杆，用于后两把是高精度的四极杆，用于过滤离子过滤离子（mass filter），每一把），每一把四极杆的四根杆子价格高达四极杆的四根杆子价格高达10万万20万人民币；第二把可能是四极万人民币；第二把可能是四极杆，也可能是六极杆或者八极杆，用途是杆，也可能是六极杆或者八极杆，用途是打碎离子打碎离子，稍微便宜一点。，稍微便宜一点。扫描类型选择全扫描(Full Scan)子离子扫描(Daughter Scan)母离子扫描(Parent Scan)中性碎片丢失扫描(Constant Neutral Loss Scan)选择离子监测(SIR)多反应监测(MRM)全扫描用于检测离子源产生的离子流中，各种离全扫描用于检测离子源产生的离子流中，各种离子的子的m/z和强度。从全扫描得到的信息可以知道目和强度。从全扫描得到的信息可以知道目前样品中的组分状态。前样品中的组分状态。全扫描模式下三重四极杆只有一把四极杆发挥了全扫描模式下三重四极杆只有一把四极杆发挥了功能，相当于单击四极杆的能力。这种模式仅仅功能，相当于单击四极杆的能力。这种模式仅仅是为了对样品有个初步的了解。挑选需要进一步是为了对样品有个初步的了解。挑选需要进一步分析的离子分析的离子 全扫描主产物分子量：主产物分子量：180.1副产物分子量：副产物分子量：168 202 253 347原料分子量原料分子量 62子离子扫描 MS1 CollisionCell MS2这时这时Q1工作在工作在SIM模式，即只允许母离子这一种模式，即只允许母离子这一种m/z的离子通过；的离子通过；Q2碰撞室工作在碰撞碎裂模式（碰撞室工作在碰撞碎裂模式（CID，Collision Induced Dissociation），气压上升、碰撞能量提高；），气压上升、碰撞能量提高；Q3在做全扫描，在做全扫描，检测检测Q2产生的碎片离子的产生的碎片离子的m/z和强度。和强度。用用MS2质量分析器扫描指定母离子的子离子碎片，所质量分析器扫描指定母离子的子离子碎片，所得到的质谱图只能是由指定母离经碰撞产生得到的质谱图只能是由指定母离经碰撞产生。扫描静态子离子扫描，子离子扫描，pruduct ion scan子离子扫描可以得到母离子的碎片信息。这子离子扫描可以得到母离子的碎片信息。这些信息可以帮助操作者了解母离子的结构信些信息可以帮助操作者了解母离子的结构信息，区别几种息，区别几种m/z相同的母离子，降低假阳相同的母离子，降低假阳性率。性率。子离子扫描的作用是：子离子扫描的作用是：通过母离子碎片种类和强度的差异来区别通过母离子碎片种类和强度的差异来区别m/z相同的母离子相同的母离子 了解母离子的结构了解母离子的结构子离子扫描质谱图子离子扫描质谱图水飞蓟亭（peak2-b）ESI-MS和ESI-MS-MS检测结果显示，在负模式下的全扫描模式下的分子离子峰M-H-质荷比为481；二级质谱的碎片离子峰质荷比分别为：463，453，435，433，337，325，179，151，152，125。可知该化合物的分子量为482，化学结构中可能含有二氢黄酮醇基团。水飞蓟宁（上图）ESI-MS和ESI-MS-MS检测结果显示，在负模式下的全扫描模式下的分子离子峰M-H-质荷比为481；二级质谱的碎片离子峰质荷比分别为：463，453，301，179，151，152，125。可知该化合物的分子量为482，化学结构中可能含有二氢黄酮醇基团。仪器内部仪器内部Q1处于全扫描模式；处于全扫描模式；Q2碰撞室工作在碰撞碎裂碰撞室工作在碰撞碎裂模式；模式；Q3用用SIM监视感兴趣的碎片。监视感兴趣的碎片。用用MS1质量分析器扫描能丢失指定质谱碎片的母离子，质量分析器扫描能丢失指定质谱碎片的母离子，扫描静态MS1Collision CellMS2母离子扫描，母离子扫描，parent ion scan母离子扫描，母离子扫描，parent ion scan选择选择MS2中的某一子离子，中的某一子离子，在在MS1中测定所有产生其子离中测定所有产生其子离子的母离子。该方式能帮助追溯碎片离子的来源，能对产子的母离子。该方式能帮助追溯碎片离子的来源，能对产生某种特征碎片离子的一类化合物进行快速筛选。生某种特征碎片离子的一类化合物进行快速筛选。中性丢失扫描，中性丢失扫描，neutrual loss scanMS1和和MS2同时扫描，但同时扫描，但MS2与与MS1始终保持质量差始终保持质量差Am，最终的谱图将显示那些来自一级谱图中通过裂解丢失，最终的谱图将显示那些来自一级谱图中通过裂解丢失中性碎片中性碎片(Am)的离子。中性丢失谱最能反映化合物的特的离子。中性丢失谱最能反映化合物的特定官能团定官能团。这里的中性基团是指如脱水反应中的水分子一样的小分这里的中性基团是指如脱水反应中的水分子一样的小分子，它们在碰撞室内以碎片的方式掉下来，但是并不带子，它们在碰撞室内以碎片的方式掉下来，但是并不带电荷。电荷。仪器内部仪器内部Q1处于全扫描模式；处于全扫描模式；Q2碰撞室工作在碰撞碎裂碰撞室工作在碰撞碎裂模式；模式；Q3也处于全扫描模式。只是也处于全扫描模式。只是Q1在每一瞬间的在每一瞬间的m/z和和Q3当时的当时的m/z值之差是一个固定值，即中性碎片的值之差是一个固定值，即中性碎片的m。MS1质量分析器是静态，并且只监测指定的离子。质量分析器是静态，并且只监测指定的离子。静态 MS1 CollisionCell MS2选择离子记录选择离子记录(SIR，selected reaction monitoring）多反应监测（MRM）MRM(Multi-reactiion monitoring)是三重四极杆最强大的功能了！其他仪器的性能无法和三重四极杆MRM的选择性和高定量精度相比。这里的“反应”指的是通过Q1选择了母离子在Q2碰撞室内碎裂成碎片的过程。一种母离子变成碎片就包含了多个反应：化学反应：A=a+b+c通过Q1选择A，Q2碎裂A变为a、b、c，Q3测量a或b或c的强度，就可以知道A=a+b+c这一化学反应的强度，间接知道反应物A的强度。据此可以对A进行定量。由于通过Q1和Q2两重选择，可以限定母离子m/z和子离子m/z两个参数；而SIM只能固定一个m/z。母离子和子离子m/z相同的情况，大多属于具有同分异构体关系的样品，出现的概率较低，所以MRM的选择性极高。相比之下，SIM受到相似m/z离子干扰的机会大得多，其定量信噪比要低得多。MS1 CollisionCell MS2指定的母离子产生一指定的子离子，两个质量分析器都是静态的。静态静态多反应监测（MRM）LC/MS 实验方法开发聚合物结构方面研究聚异丁基琥珀酸酐水解后聚异叔丁基琥珀酰亚胺预聚物结构分析固化剂：异佛尔酮二胺(IPDA)：M+H+：171.0D-230聚醚胺N=37时M+H+：191.0、249.1、307.2、365.2、423.2M+Na+：213.0、271.0、329.1、387.1酚醛树脂苯酚和甲醛能够聚合生成1取代、二取代、三取代物，取代物之间又可以脱水缩合，形成低聚物一取代：M-H：123.1 二取代M-H-：153.0三取代M-H-：183.2一取代+二取代：M-H-：259.3一取代+三取代：M-H-：289.3二取代+三取代M-H-：319.2一取代+2*二取代：M-H-：395.2一取代+二取代+三取代：M-H-：425.1 一取代+2*三取代：M-H-：455.4烷基醇聚氧乙烯醚通式：CxH2x+1-O-（CH2CH2O）nHX11n411时M+H+：370.1、414.2、458.1、502.2、645.1、590.2、643.1、678.2烷基酚聚氧乙烯醚通式：RCxH2x+1二烷基酚聚氧乙烯醚通式：R1R2CxH2x+1X6n29时，M+H+：349.8、393.9、437.9、481.9、525.9、569.9、614.0、658.0M+Na+：371.9、415.8、459.9、503.9硬脂酸单乙醇胺M：327M+H+：328.4，M+Na+：350.4，2M+H+：655.6，2M+Na+：677.6天冬氨酸-亮氨酸-缬氨酸-脯氨酸-亮氨酸（DLVPL）M：555M+H+：556.1M+Na+：578.1M+K+：594.12M：11102M+H+：1111.42M+Na+：1133.42M+K+：1149.4M-H-：554.32M-：1109.6 这个峰没有减HM：440M+H+：441.12M+H+：881.4M-H-：439.3离子液体metholTomatojuice基质干扰用色谱柱将基质和分析物分离液相色谱图液质联用图液相和液质色谱图对比溶解样品的溶剂对色谱峰影响液质联用在合成中应用主产物：180.1副产物：168202253347原料：62选择离子方式进行检测FullscanSIR单通道选择离子色谱图由于质谱作为色谱检测器，可以降低对色谱的分离要求。由于质谱作为色谱检测器，可以降低对色谱的分离要求。在完全相同测试条件下，通过测定不同匹次样品可以进行工艺优化