双向电泳原理和方法 GE医疗.pdf

双向电泳原理和方法概述.1关于本手册.1双向电泳简介.1本手册中使用的符号.2A.第一向和第二向电泳的最佳系统.3B.采用平板电泳系统进行第一向和第二向电泳.5设备选择.6等电聚焦（IEF）系统的选择.6第二向电泳系统的选择.7垂直系统.8Multiphor电泳系统.8良好的实验室操作技术.9第 1 章 样本制备.111.0 一般策略.111.0.1 细胞破碎、避免蛋白水解、样本分级.111.0.2 蛋白质沉淀和去除干扰物质.111.0.3 样本制备的其他方面.121.0.4 样本制备的一般原则.131.1 细胞破碎的方法.141.1.1 温和的裂解方法.141.1.2 较强烈的裂解方法.151.1.3 采用样本研磨试剂盒处理较小的组织或细胞样本.151.1.4 蛋白来源“困难”的样本制备.161.2 防止蛋白质水解.171.2.1 采用蛋白酶抑制试剂盒进行蛋白酶抑制.181.3 蛋白裂解液的分级.181.4 蛋白质沉淀.191.4.1 采用 2D clean-up 试剂盒处理样本.201.4.2 离心沉淀的再溶解.231.5 除去污染物的其他方法.231.5.1 采用微型透析试剂盒进行脱盐处理.251.5.2 采用核酸酶试剂组清除样本中的核酸.281.5.3 采用白蛋白和 IgG清除试剂盒改善人血清样本双向电泳效果.281.6 样本制备溶液的组成.311.6.1 样本制备溶液的组成.311.6.2 样本制备溶液举例.311.7 蛋白质样本的定量.311.7.1 采用双向电泳蛋白定量试剂盒进行蛋白质测定.321.8 载样量.33目 录第 2 章 第一向等电聚焦（IEF）.352.0 概述.352.1 等电聚焦的背景知识.352.2 Immobiline DryStrip 凝胶.372.2.1 选择胶条长度.382.2.2 选择 pH 梯度.382.2.3 选择 IPG 缓冲液.402.2.4 估计蛋白质的等电点.402.3 采用 Ettan IPGphor 等电聚焦系统及其配件进行 IEF 电泳.402.3.1 Ettan IPGphor 控制软件.412.3.2 Ettan IPGphor 胶条槽.422.3.3 泡胀盘.422.3.4 Ettan IPGphor Manifold 胶条槽.422.3.5 注意事项.442.4 上样方法的选择.442.4.1 水化上样.442.4.2 采用 Manifold 胶条槽上样.442.4.3 纸桥上样.452.5 推荐载样量.452.6 Immobiline DryStrip 干胶条水化溶液.462.6.1 水化溶液的组成.462.6.2 使用 DeStreak 水化溶液.472.6.3 其他水化溶液的制备.502.7 采用不同的配件溶胀 Immobiline DryStrip 胶条.502.8 等电聚焦的指导原则 Ettan IPGphor系统.552.8.1 方案举例 Ettan IPGphor 等电聚焦系统.562.8.2 运行 Ettan IPGphor III 操作方案.562.8.3 Immobiline DryStrip胶条聚焦后的保存.592.9 问题解决.59第三章 第二向 SDS-PAGE垂直电泳系统.633.0 概述.633.1 平衡固相 pH 干胶条.633.1.1 平衡溶液成分.633.1.2 平衡固相 pH 干胶条.633.2 SDS-PAGE SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的背景.643.3 利用 Ettan DALT Large 垂直电泳系统进行电泳.653.3.1 使用预制凝胶进行电泳时 Ettan DALT系统的准备工作.663.3.2 将 DALT Gel 12.5 胶插入到 DALT预制胶模具中.683.3.3 平衡固相 pH 干胶条.693.3.4 将平衡后的固相 pH 干胶条应用于 SDS 胶.693.3.5 将凝胶插入到 Ettan DALT电泳设备中.703.3.6 对于 Ettan DALTsix 和 Ettan DALTtwelve 两个系统预制凝胶的电泳条件.713.3.7 准备实验室自制凝胶.723.3.8 使用实验室自制凝胶进行电泳时的 Ettan DALT电泳设备的准备.753.3.9 用实验室自制胶平衡固相 pH 干胶条.753.3.10 将固相 pH 干胶条加至实验室自制胶.753.3.11 将实验室自制胶插入到 Ettan DALT电泳设备中.753.3.12 用实验室自制胶的电泳条件.753.3.13 问题解决.763.4 利用其他垂直电泳设备进行电泳.763.4.1 准备 miniVE、SE 260和 SE 600 Rub 电泳系统的模具和凝胶夹层.763.4.2 准备用于 miniVE,SE 260和 SE 600 Ruby 电泳系统的实验室自制凝胶.763.4.3 准备用于电泳的 miniVE、SE 260和 SE 600 Ruby 系统.783.4.4 平衡固相 pH 干胶条.783.4.5 装入固相 pH 干胶条.793.4.6 将凝胶插入到 miniVE,SE 260和 SE 600 Ruby 系统.793.4.7 电泳条件.793.5 问题解决.80第四章 利用 Multiphor II 平板电泳系统进行第一向和第二向电泳.834.0 概述.834.1 利用 Multiphor II 电泳系统和固相 pH 干胶条套件进行第一向等电聚焦.834.1.1 固相 pH 干胶条水化-固相 pH 干胶条泡胀托盘.844.1.2 准备等电聚焦.854.1.3 杯上样.874.1.4 纸桥上样.884.1.5 Multiphor II 电泳系统等电聚焦的原则.894.1.6 方法举例.894.1.7 Multiphor II 电泳步骤.894.1.8 聚焦化的固相 pH 干胶条的保存.914.1.9 问题解决.924.2 利用 Multiphor II 电泳系统进行第二向 SDS-PAGE.934.2.1 ExcelGel 的准备.934.2.2 放置平衡好的固相 pH 干胶条.944.2.3 电泳条件.954.2.4 问题解决.96第五章 显影及结果分析.975.0 结果显影标记及染色.975.0.1 自动化处理及保存凝胶.985.1 印迹.995.2 结果分析.995.3 结果标准化.995.4 蛋白点的后续分析.1005.4.1 蛋白切点.1005.4.2 酶解蛋白并点至 MALDI-ToF MS 靶片上.1005.4.3 MALDI-ToF质谱.100第六章 2-D荧光差异凝胶电泳(2-D DIGE).1036.0 概述.1036.0 概述.1036.1 CyDye DIGE 染料.1046.1.1 CyDye DIGE 最小标记法染料.1046.1.2 用 CyDye DIGE 最小标记法染料标记蛋白.1056.2 用于稀少样品及制备凝胶标记的带有饱和标记染料的 CyDye DIGE 标记试剂盒.1066.3 Ettan DIGE 系统工作流程.1076.3.1 Ettan DIGE系统应用的实验设计.1086.3.2 Ettan DIGE系统的样品制备.1106.3.3 Ettan DIGE系统应用中用最小标记法染料标记样品.1116.3.4 蛋白样品的二向分离.1126.3.5 最小标记法和饱和标记的关键区别.1136.3.6 成像.1146.3.7 用 DeCyder 2-D 差异分析软件进行图像分析.1146.3.8 蛋白点的进一步分析.1156.4 2-D DIGE 的问题解决.115第七章 问题解决.117附录 I.121溶液.121A.双向电泳的样品制备溶液(含有尿素).121B.双向电泳的样品制备溶液(含有尿素和硫脲).121C.尿素水化储备溶液.122D.硫脲水化储备溶液.122E.SDS平衡缓冲液.123F.10 Laemmli SDS 凝胶缓冲液.123G.30%T,2.6%C单体储液.123H.4 分离胶缓冲液.123I溴酚蓝储备溶液.124J.10%SDS 溶液.124K.10%过硫酸铵溶液.124L.凝胶储存液.124M.1 Laemmli SDS 凝胶缓冲液.124N.琼脂糖密封液.125 Handbook 80-6429-60AC 1概述关于本手册本手册旨在介绍高分辨率双向（2-D）电泳的操作方法。本手册共分七章：第一章介绍样品制备和蛋白定量的方法。第二章具体介绍双向电泳中第一向的操作过程，重点介绍 EttanTM IPGphorTM 等电聚焦系统。第三章包括采用各种垂直凝胶电泳系统进行固相 pH 梯度（IPG）胶条的第二向电泳的一般方法。第四章介绍使用平板 Multiphor TM 电泳系统进行第一向和第二向电泳的方法。第五章讨论双向电泳结果的图像与分析。第六章介绍双向荧光差异凝胶电泳（2-D DIGE）的优势与使用技术。第七章描述双向凝胶电泳的常见问题与解决方法。涉及具体技术的故障排除方法请见相关章节。本手册介绍的操作程序使用Amersham Biosciences公司的产品，该公司现为GE Healthcare公司的一部分（下文均称 GE Healthcare）。备选设备及照片见表 1。产品订购信息见第 155 页。根据样本类型和研究性质的不同，本手册所介绍的操作步骤可能须调整或优化。双向电泳简介双向电泳是一种分析从细胞、组织或其他生物样本中提取的蛋白质混合物的有力手段，已得到广泛应用。这项技术利用蛋白质的两种特性，分两步将不同的蛋白质分离。第一向步骤为等电聚焦（IEF），即根据蛋白质的等电点（pI）差异将蛋白质分离。第二向步骤为十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），即利用蛋白质的分子量（Mr,相对分子量）差异将蛋白质分离。双向凝胶电泳结果中的每个斑点都对应着样本中的一种蛋白。因此，可将上千种不同的蛋白质分离开来，并得到每种蛋白质的等电点、表观分子量和含量等信息。双向电泳由OFarrel（1）在1975年首次建立。在最早的技术中，第一向分离使用的是含有载体两性电解质的聚丙烯酰胺管胶，详见第 43 页 2.1 节。自从双向电泳技术一产生，人们就认识到其作为一种生物化学分离技术的重要性，但这一技术得到广泛的应用还应归功于以下几个方面的改进：由于采用了固相pH梯度胶和Immobiline(tm)试剂（2），使第一向等电聚焦的分辨率和可重复性大大提高。基于这项技术，Grg及其同事们（3,4）开发出了目前所使用的双向电泳技术，用固相pH 梯度代替了载体两性电解质产生的pH梯度，并用带支持膜凝胶代替了管胶。关于此项技术的优越性详见第 45 页 2.2 节。双向荧光差异凝胶电泳（2-D DIGE）首先由 nl 等(5)于 1997 年提出，这项技术可更好地控制系统误差，使研究人员能够发现具有统计学意义的生物变异的蛋白质表达。双向电泳后的一系列自动化操控，如凝胶图像分析、斑点采集、胶内酶解、以及靶样本制备用于质谱测定等，大大增加了蛋白质分析与鉴定的能力。新的质谱技术的发展，使人们能够快速鉴定和描述极微量的多肽和蛋白质。现在的计算机和软件功能更强大，价格更低,可对高度复杂的双向电泳图像进行彻底的计算机分析。2 Handbook 80-6429-60AC现在人们已经掌握了大量生物体全部基因组数据，从而可以迅速识别编码双向电泳分离的蛋白质的基因。目前蛋白质序列信息正日新月异地增加，并在公共域名数据库中共享，一些组织，如人类蛋白质组组织（HUPO），正在推动各国间的合作，共同进行蛋白质组学研究。斑点图像数据库和基因组序列数据库均可以简单、直接地通过万维网访问，可分别用来比对双向电泳结果和分析序列信息。双向电泳技术在蛋白质组学领域里得到了大量的应用（6,7），利用该技术可对一种样本中的许多蛋白质同时进行系统化的分离、鉴定、定量。双向电泳在这一领域中的应用也正是因为其同时分离数千种蛋白质的无与伦比的能力，同时，该技术还可检测翻译后和翻译过程中的蛋白质修饰，这是无法通过基因组序列分析进行预测的。双向电泳技术的应用领域有蛋白质组分析、细胞鉴别、疾病标志物探测、治疗监测、新药发现、癌症研究、纯度检测、以及微量蛋白质纯化等。本手册所介绍的双向电泳操作，采用 GE Healthcare 公司所生产的预制 IPG胶条（Immobiline DryStrip 凝胶）。本手册中使用的符号此符号表示在特定情况下能够改善操作或提供推荐的一般性建议。此符号表示应视为强制性的建议，需要特别引起注意。此符号表示解决故障的建议，可用于分析和解决可能出现的困难。化学物质、缓冲液和设备实验操作方案 Handbook 80-6429-60AC 3表1.双向电泳的仪器选择A.第一向和第二向电泳的最佳系统使用 Ettan IPGphor 等电聚焦系统进行第一向 IEF胶条尺寸采用胶条宽度分离区长度表示Ettan IPGphor 等电聚焦系统和 Ettan IPGphor Manifold胶条槽或标准胶条槽注：Ettan IPGphor,Ettan IPGphor II 系统与Manifold胶条槽完全兼容，与本手册中所介绍的实验操作方案也完全兼容。选择因素：独特设计的Ettan IPGphor Manifold胶条槽可同时最多容纳12个IPG胶条，长度范围724 cm，适合等电聚焦和后续的平衡反应。可采用样品杯上样，改善蛋白质聚焦谱，尤其是使用碱性 IPG胶条时。Manifold胶条槽盘底采用导热氧化铝陶瓷制成，散热迅速，避免“热点”出现。程序控制电压、电流、温度和时间。通过控制软件以及个人电脑通过串行接口连接，可最多同时控制4套Ettan IPGphor 设备，每套设备独立跑胶。可最多存储、恢复、编辑10套实验操作方案（每套方案由 9 步构成）。使用垂直电泳系统进行第二向 SDS-PAGE电泳Ettan DALTsix 大型垂直电泳系统，最多可容纳 6 个 26 20cm 凝胶选择因素：电泳工作时间：4 小时至整夜模块化系统兼容带稳定缓冲系统的预制胶：Ettan DALT Gel12.5（25.5 19.6 cm，厚度 1 mm）大型凝胶支持最高分辨率和最大蛋白质载量中等通量（最多同时跑 6 块胶）最适合采用 18cm 和 24cm 的 IPG胶条跑 6 块胶时缓冲液量约为 5L图1 Ettan IPGphor 等电聚焦系统和Ettan IPGphor Manifold胶条槽图2 Ettan DALTsix 大型垂直电泳系统4 Handbook 80-6429-60ACEttan DALTtwelve 大型垂直电泳系统，最多可容纳12 个 26 20cm 凝胶选择因素：电泳工作时间：4 小时至整夜带高效珀尔帖（Peltier）温控的集成化系统兼容带稳定缓冲系统的预制胶：Ettan DALT Gel12.5（25.5 19.6 cm，厚度 1 mm）大型凝胶支持最高分辨率和最大蛋白质载量高通量（最多同时跑 12 块胶）最适合采用 18cm 和 24cm 的 IPG胶条跑 12 块胶时缓冲液量约为 10LminiVE 和 SE 260微型垂直电泳系统，可容纳 1 或 2 个 8 7 或 9.5 cm 凝胶选择因素：电泳速度快：12 小时最适合采用 7cm IPG胶条当需要快速分离或样本蛋白质谱相对简单时最适用图3 Ettan DALTtwelve 大型垂直电泳系统图4 miniVE 垂直电泳系统图5 SE 260 微型垂直电泳系统 Handbook 80-6429-60AC 5SE 600 Ruby标准垂直电泳系统，可容纳 1 至 4 个 14 16 cm 凝胶选择因素：电泳时间：25 小时中等分离效果（凝胶长 16cm）中等通量（使用分隔玻璃板最多可同时跑4块胶）最适合采用 11cm 或 13cm 的 IPG胶条可选择分隔玻璃板对7cmIPG胶条进行高通量第二向电泳（使用分隔玻璃板最多每次可跑8 根7cmIPG胶条）B.采用平板电泳系统进行第一向和第二向电泳使用 Multiphor 电泳系统和 Immobiline DryStrip干胶条套件（在溶胀盘中进行溶胀）进行第一向IEF选择因素：既可用于第一向分离也可用于二向分离，还可用于许多其他电泳技术使用 724cm 的 IPG胶条，IEF 分离通用注：需要EPS 3501 XL电源供电和MultiTemp(tm)恒温循环水浴冷却使用 Multiphor 电泳系统进行第二向 SDS-PAGE电泳可容纳 24.5 11/18cm 凝胶选择因素：可使用预制凝胶：ExcelGel(tm)SDS均质凝胶12.5(24.511 cm)和ExcelGel(tm)梯度凝胶XL1214（24.5 18cm）电泳速度相对较快：小于 4 小时高分辨率可使用各种长度的 IPG胶条。图6 SE 600 Ruby标准垂直电泳系统图7 Multiphor 电泳系统和 Immobiline DryStrip干胶条套件6 Handbook 80-6429-60AC双向电泳的实验步骤为：1.样本制备正确的样本制备对于良好的双向电泳结果是绝对重要的。2.Immobiline DryStrip 干胶条水化进行 IEF 之前，必须加入恰当的添加物，使 Immobiline DryStrip 干胶条溶胀。3.等电聚焦电泳（IEF）第一向 IEF 电泳在平板电泳系统中进行，电泳时采用超高电压和主动温度控制。4.Immobiline DryStrip 干胶条平衡将样本胶条在含有 SDS的平衡液中进行平衡处理，以便第二向分离。5.十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）样本胶条进行第二向 SDS-PAGE凝胶电泳。6.显影对第二向凝胶基质上的蛋白质斑点进行染色，使之显影。如果蛋白质经预先标记过，就可以通过放射自显影、或紫外线照射、或荧光显像的方法使蛋白质斑点显影。7.分析对样本双向电泳斑点结果进行分析。设备选择等电聚焦（IEF）和 SDS-PAGE 凝胶电泳有多种实验方法与设备，表 1 列出了 GE Healthcare 公司所提供的设备，关于这些设备的详细操作信息请参阅设备用户手册，关于设备的其他信息和本公司的其他产品信息，请参阅GE Healthcare BioDirectory，或登陆 。等电聚焦（IEF）系统的选择GE Healthcare 公司提供两种可进行第一向电泳的系统：Ettan IPGphor 等电聚焦系统和 Multiphor 电泳系统。这两种系统均可以通过升级配件而进一步改善 IEF 电泳性能。Ettan IPGphor等电聚焦系统（图1）是一种IEF电泳专用系统，电泳在Immobiline DryStrip干胶条上进行，该系统已经过升级，操作简单，可轻松完成第一向电泳分离。Ettan IPGphor等电聚焦系统的一贯特点是高速，可重复性好，高通量。该系统配备了高安全性的高压电源（根据所使用的 DryStrip干胶条的不同，最高可提供10 000V电压）和珀耳帖（Peltier）固相温度控制装置（1530），程序控制参数包括水化温度和时间、等电聚焦的温度和最大电流，以及每次电泳分离中各步骤的时间及电压模式。除了 IEF 电泳仪以外，该系统的关键配件还包括Manifold胶条槽，标准胶条槽和溶胀盘。另外，该系统整合的Ettan IPGphor控制软件可更好地操控IEF电泳，并可最多同时控制4套Ettan IPGphor电泳仪，每一套可设定不同的跑胶参数。这些配件将在 2.3 节中详细介绍。如果样本较多地集中在高端和低端 pH 梯度，或者在较窄的 pH 梯度内分离大量蛋白质，应使用Ettan IPGphor Manifold胶条槽和7、11、13、18 或24 cm 的Immobiline DryStrip 干胶条，上样可采用样品杯、溶胀盘、或纸桥，详见 2.32.5 节。Multiphor电泳系统（图 7）具有多种功能，可进行几种不同的电泳。对于双向电泳，它既可用于第一向 IEF电泳，也可用于第二向SDS-PAGE电泳。干胶条进行溶胀时既可以含有样本，也可以不含样 Handbook 80-6429-60AC 7本，溶胀在溶胀盘内进行。溶胀后，胶条被转移到电泳仪上进行第一向等电聚焦（IEF）。本系统由 Multiphor 电泳系统和 Immobiline DryStrip 干胶条套件组成，可用杯上样和纸桥上样的方式把样品加到已溶胀的胶条上。该系统可容纳最多 12 条同样长度的溶胀胶条进行任何方式的 IEF 电泳。该系统由 EPS 3501 XL 电源单独供电，并由 MultiTemp 恒温循环水浴进行温度控制。表2列出了采用Ettan IPGphor等电聚焦系统和Multiphor电泳系统进行第一向IEF电泳的主要区别。表 2.等电聚焦系统选择最大电压所需附加设备等电聚焦时间*Ettan IPGphor10 000V相应长度的胶条槽236 h或 Manifold 胶条槽联合溶胀盘Multiphor3500V溶胀盘；272 hImmobiline DryStrip 干胶条套件；EPS 3501 XL电源；MultiTemp 恒温循环水浴最佳的聚焦时间依 Immobiline DryStrip 干胶条长度、pH 值范围以及样品特性的不同而有较大波动。对于类似的样本分离，采用Ettan IPGphor等电聚焦系统比采用Multiphor电泳系统至少可快2 倍。出于安全考虑，不推荐采用更高电压。关于Ettan IPGphor等电聚焦系统和Multiphor电泳系统上样方法的选择分别见2.4 节和4.1.34.1.4节。第二向电泳系统的选择第二向电泳分离既可以在垂直设备上进行也能在平板设备上进行。表3列出了可进行第二向电泳的设备以及所用凝胶的尺寸和 Immobiline DryStrip 干胶条的长度，进一步讨论详见下文。关于垂直系统与平板系统的比较优势，详见参考文献 8。表 3.第二向电泳系统及其 Immobiline DryStrip 干胶条和预制凝胶板的选择凝胶大致尺寸凝胶数量凝胶厚度IPG 胶条长度总分离时间（宽长cm）（mm）（cm）（h:m）垂直系统：Ettan DALTsix*26 20161，1.518，244:006:30EttanDALTtwelve*26 201121，1.518，245:007:00miniVE 或SE 2608 9.5121，1.571:30SE 600 Ruby14 1614 1，1.5113:005:0016 1614 1，1.5133:005:0016 814 1，1.5133:004:00平板系统：Multiphor ExcelGel 2-DHomogeneous 12.5*24.5 1110.5各种长度1:45ExcelGel Gradient XL 12-14*24.5 1810.5各种长度3:20*适用多个较短的 Immobiline DryStrip干胶条（2 个 11cm胶条或 3 个 7cm 胶条）须使用 1cm 宽的垫片如使用分配板，可同时跑 4 块胶联合使用较短的玻璃板（8cm）和分配板，可同时进行 8 个小面积电泳分离8 Handbook 80-6429-60AC垂直系统垂直系统使用方便，能同时进行多块胶的分离。垂直系统所用的第二向凝胶既可以是1mm 厚也可以是1.5mm厚。Ettan DALTsix（图 2）可用于中等通量的高分辨率第二向凝胶电泳，最多可同时跑 6 块胶。该系统可容纳18或24cm长的Immobiline DryStrip干胶条，可使用预制或实验室制备的大面积Ettan DALT凝胶。内置循环泵能推动缓冲液循环流动，以调节温度（与 MultiTemp恒温循环水浴配合使用）。为了得到最佳的分辨率、可重复性和样品通量，建议使用Ettan DALTtwelve系统（图3）。采用预制的带支持膜Ettan DALT大面积凝胶，方便易用，该系统能够容纳18cm或24cm长的Immobiline DryStrip干胶条（包括分子量标记），最多能同时跑12块凝胶。该系统整合了珀尔帖（Peltier）温控装置和缓冲液循环泵，能保证精确而稳定的温度环境。使用Ettan DALTtwelve灌胶模具能同时灌制最多14块1 mm厚的凝胶。若需要尽快得出结果，建议采用微型凝胶电泳系统 miniVE（图 4）或 SE-260（图 5）系统，通常能够在 12 小时内完成第二向电泳分离。在需要快速了解蛋白质组成情况或样本中蛋白质谱相对比较简单时，最佳的办法是采用微型凝胶进行第二向电泳分离。如需要提高样本通量和分辨率，建议采用标准规格的SE600 Ruby垂直电泳系统（图6）。该系统能够同时容纳4块16cm长的凝胶，内置的热量交换器（与MultiTemp 恒温循环水浴配合使用）冷却能力强，确保了实验的高度可重复性。使用 14cm 宽凝胶时标准垫片宽度为 2cm。如果需要利用 13cm 长的Immobiline DryStrip干胶条两端的额外空间用于分子量标记，可选用1cm宽的垫片，进行16cm宽的凝胶电泳。如果需要制备1416cm宽、8cm 长的凝胶，可选用较短的8cm 夹子、短板和垫片，这些较短的凝胶适于同时快速地对数个 7cm 长的 Immobiline DryStrip 胶条进行第二向电泳分析。Multiphor 电泳系统Multiphor平板电泳系统（图7）分辨率高，分离速度相对较快，可使用大面积凝胶。预制的ExcelGel产品可提供方便易用的凝胶和缓冲胶条。Immobiline DryStrip胶条的蛋白含量可能会超过较薄的水平第二向凝胶的容量，因此在进行微量制备时，最好采用较厚的垂直第二向凝胶。如果第一向电泳使用的 Immobiline DryStrip 胶条 pH 值范围为 69、611 或 711，不建议使用Multiphor电泳系统进行第二向电泳。Handbook 80-6429-60AC 9良好的实验室操作技术在操作Immobiline DryStrip干胶条、SDS-聚丙烯酰胺凝胶、ExcelGel缓冲胶条以及任何接触这些物质的仪器设备时，务必戴上手套。使用手套能减少因蛋白质污染而产生的杂点和条带。凡是接触凝胶或样本的器件，都要用玻璃器皿专用去污剂清洗，并用蒸馏水冲洗。当采用高敏感度质谱分析进行斑点鉴定和描述时，这一点特别重要。对于标准胶条槽和Manifold胶条槽，可选用一种特殊清洁剂(见第 2 章)。一定要使用最高级别纯度的试剂以及所能得到的最纯净的水。在双向电泳操作过程中所用的一些化学物质如丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、TEMED、硫脲、DTT、碘乙酰胺和DeStreak 试剂等，具有很强的毒性。例如，丙烯酰胺单体是一种神经性毒素，且有可能致癌。请阅读生产商安全数据表(MSDS)，该表详细介绍了实验室中所有化学物质的性质及注意事项，请在开始本手册中所介绍的实验操作之前，阅读该表。处理有害化学物质时，在所有的实验中一般均须戴双层乳胶手套。称量有害物质时，应在通风橱中进行，并戴一次性防尘面罩。另外还须遵守操作与处置化学物质的当地法规与规定。10 Handbook 80-6429-60AC Handbook 80-6429-60AC 11第 1 章 样本制备1.0一般策略要得到良好的双向电泳结果，适当的样本制备是绝对重要的。由于蛋白质样本的类型和来源各不相同，最佳的样本制备方法必须通过经验决定。若能使样本中的蛋白质完全溶解、分离、变性、还原，那是最理想的。对于双向荧光差异凝胶电泳（2-D DIGE），样本制备方面有一些特殊之处，请参见 6.3.2 节。在设计某种样本制备方案时，必须对双向电泳最终要达到怎样的结果有清晰的把握。是要尽可能地分离更多的蛋白质，还是仅仅想看到样本中感兴趣的那部分蛋白质？到底哪一个目标更重要？是样本的完全分离还是获得清晰而可重复的蛋白质谱？样本制备过程中，增加步骤能提高电泳最终结果的质量，但同时也能导致一些蛋白选择性的丢失。所以必须充分考虑提高样本质量和样本的完全分离之间的相互关系，权衡利弊。要想在复杂的蛋白质混和物中辨别出特定的蛋白，必须使那些感兴趣的蛋白质在电泳条件下完全裂解。裂解不同种类的蛋白质样本应采用不同的处理和条件：一些蛋白质在天然条件下与膜、核酸及其他蛋白质形成复合物；一些蛋白质形成各种非特异性的集合体；一些蛋白质一旦离开其正常环境就会发生沉淀。裂解的效果取决于细胞破碎的方法、蛋白质浓缩和裂解的方法、去污剂的选择以及样本溶液的组成。在处理某种样本的时候，如果这些步骤中的任何一步没有充分完成，分离就可能不完全或失败，并且一些信息也可能丢失。1.0.1 细胞破碎、避免蛋白水解、样本分级为了对细胞内蛋白作全面分析，必须有效地破碎细胞。细胞破碎方法的选择，依赖于样本是来源于细胞悬液、实体组织还是其他生物材料，以及是否要分析细胞内所有蛋白质或仅仅是细胞内的一部分蛋白质。关于温和的细胞裂解方法和强烈的细胞裂解方法将在1.1.1节和1.1.2节中分别介绍。第1.1.3节介绍了采用样本研磨试剂盒（Sample Grinding Kit）研磨细胞的实验操作方案。在细胞破碎过程中，蛋白酶也可能被释放出来。样本中的蛋白质一旦被水解，将极大地增加双向电泳结果分析的难度，因此，在细胞破碎和随后的制备过程中，应防止样本中的蛋白质被水解。第1.2节将讨论蛋白酶的抑制方法，第 1.2.1 节介绍了蛋白酶抑制剂混合物（Protease Inhibitor Mix）的实验操作方案。如果只对组织或细胞中的一部分蛋白感兴趣，在样品制备过程中可以采取样本分级的方法。如果想要分析的蛋白质来源于某一亚细胞单位（如细胞核、线粒体、质膜等），可以在蛋白质裂解之前采取差速离心或其他方法将感兴趣的细胞器纯化。还可以在双向电泳前，将样本在不同的提取条件下利用溶解性的不同进行样本分级（实验条件参见参考文献 913）。1.0.2 蛋白质沉淀和去除干扰物质在全细胞裂解液中，各种蛋白质的浓度范围差异很大，并呈动态变化，这种情况下，高丰度蛋白质就有可能掩盖低丰度但我们又感兴趣的蛋白质。有效的蛋白质组学分析自然既包括将高丰度蛋白质分离，还包括富集低丰度蛋白质以达到可以检测到的水平。通过这种处理，可以提高样本分析的分辨率，使双向电泳图像不至于过分拥挤，简化结果分析与解释，增加发现新的具有诊断或治疗价值蛋白质的机会。沉淀样本中的蛋白质和去除干扰物质并非必须的步骤。是否采用这两个步骤依赖于样本的特性和实验的目的。沉淀既可用来浓缩样本，也能用于分离蛋白质中可能的干扰物，沉淀的实验操作将在1.4节中介绍。第 1.4.1 节介绍了采用 2D clean-up 试剂盒（2-D Clean-Up Kit）进行样本清洁的实验操作方案。12 Handbook 80-6429-60AC第1.5节讨论了如果各种污染物（盐类、小离子分子、人血清白蛋白和IgG、离子型去污剂、核酸、多聚糖、脂类及酚类化合物等）未能及时清除会对双向电泳结果产生哪些影响，该小节还讨论了样本去除杂质的技术。具体实验操作方案包括采用微透析试剂盒（mini Dialysis Kit）进行脱盐（第1.5.1节）、采用核酶混合物（Nuclease Mix）去除核酸（第1.5.2节）、还有采用白蛋白和IgG清除试剂盒（Albuminand IgG Removal Kit）消除因人血清白蛋白和 IgG 存在而引起的问题（第 1.5.3 节）。一般来说，样本制备越简单越好，举例来说，低蛋白质浓度高盐浓度的样本可用冻干的方法脱盐然后浓缩，或采用TCA 和预冷的丙酮进行沉淀，再用水化溶液将其再溶。一些情况下，用水化溶液简单地对样本进行稀释就足够了。若蛋白质浓缩存在问题或干扰物质的问题不能克服，就须使用蛋白质沉淀和除杂技术。1.0.3 样本制备的其他方面样本溶液的成份对双向电泳极为重要，因为用于第一向电泳的裂解处理必须既不影响蛋白质的pI值，也不能使样本溶液具有高导电性。通常地，样本制备过程会使用高浓度尿素（或联合使用尿素和硫脲）和一种或多种去污剂。样本溶液的组成将在第 1.6 节中讨论。对所制备的样本中的蛋白质精确定量使比较困难的，因为用于制备和裂解样本的许多试剂（如促溶剂、载体两性电解质、去污剂、还原剂等）都与普通的蛋白质检测相排斥，第1.7节将讨论这一问题，第1.7.1 节介绍采用双向电泳蛋白定量试剂盒（2-D Quant Kit）来解决这个问题的实验操作方案。上述的各种GE Healthcare公司的样本制备试剂盒既可简化制备操作过程又可提升样本的质量，这对于良好的电泳结果是十分重要的。表 4 总结了这些试剂盒，详细内容参见相应章节。表 4 样本制备试剂盒 Handbook 80-6429-60AC 131.0.4 样本制备的一般原则样本制备方案应尽可能简单，以避免蛋白质的丢失。附加样本处理步骤能提高双向电泳最终结果的质量，但是有可能以选择性蛋白质丢失为代价。通过文献检索了解是否有其他人已经制定了类似的方案，网络上的讨论组也可能提供有益的帮助，如登录 。进行细胞或组织破碎时，必须最小限度地减少蛋白质水解和其他形式的蛋白降解。有可能的话，在尽可能低的温度下进行细胞破碎，并尽量减少破碎过程中热量的产生。理想情况是，细胞破碎应当直接在含有蛋白酶抑制剂的强变性溶液中进行。尽可能保持样本的质量，应在等电聚焦之前新鲜制备，或将样本分批保存在-40以下的环境中。不要使样本反复冰冻和融化。通过超离心方法除去所有颗粒物，必须清除所有固体颗粒和油滴，因为他们能堵塞凝胶的孔隙。为了防止蛋白质的修饰，不要在加入尿素后加热样本。如果样本中存在尿素，溶液温度不能超过37。温度上升会使尿素水解为异氰酸酯，异氰酸酯能通过氨基甲酰化作用（carbamylation）对蛋白质进行修饰，造成人为的“斑点串（charge trains）”。本章描述双向电泳样本制备的方法，电泳采用 GE Healthcare 公司的预制 Immobiline DryStrip 干胶条。关于 Immobiline DryStrip 干胶条的最佳蛋白含量将在第 2.5 节讨论。其他关于 ImmobilineDryStrip干胶条和IEF和双向电泳设备的信息，参见第2章和第3章。关于Immobiline DryStrip干胶条样本制备的进一步详细技术，参见参考文献 1416。14 Handbook 80-6429-60AC1.1细胞破碎的方法表5和表6列出了一些标准的机械和化学的破碎方法。细胞破碎必须在低温下进行，可能的话应将样本放在冰块上并且使用预冷的溶液。在细胞破碎过程中蛋白酶有可能被释放出来，因此，无论采用本节所介绍的那种方法，都须防止蛋白质样本被水解。通常采取的方法是，直接将样本置于强变性裂解液中破碎，这样能使蛋白水解酶迅速失活，并且也能抑制其他一些能修饰蛋白质的酶的活性。细胞破碎往往在合适的能裂解特定蛋白质的裂解液中进行（见参考文献 17 和 18 关于组织破碎和细胞裂解的一般信息）。1.1.1 温和的裂解方法如果所感兴趣的样本是由易于裂解的细胞组成的（如组织培养细胞、血细胞以及一些微生物等），一般采用温和的细胞裂解方法来破碎样本。当只有一种特定的亚细胞成分需要分析时，也可以用温和的裂解方法。例如，选择反应的条件，只释放胞质蛋白，或通过差速离心的方法得到完整的线粒体或其他细胞器。有时，这些方法需要联合使用（如酶处理后再渗透裂解，或在去污剂存在的条件下冻融）。表5 中总结了各种温和的裂解方法。表 5.温和的裂解方法 Handbook 80-6429-60AC 151.1.2 较强烈的裂解方法如果细胞不容易破碎，可以采用这类方法，如实体组织中的细胞，或具有坚硬细胞壁的细胞。较强烈的裂解方法能彻底的破碎细胞，但是必须要避免在此过程中所产生热量和泡沫。表6总结了这些较强烈的裂解方法。表 6.较强烈的裂解方法1.1.3 采用样本研磨试剂盒处理较小的组织或细胞样本样本研磨试剂盒用于破碎细胞或组织样本。其采用一种研磨树脂和研磨杵来破碎细胞、提取蛋白质。细胞内的细胞器