DB15T+3185-2023山药根尖染色体制片和核型分析技术规程.pdf

ICS 65.020.01 CCS B 01 15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 31852023 山药根尖染色体制片和核型分析技术规程 Technical rules for chromosome preparation and karyotype analysis in root tip of yam 2023-10-30 发布 2023-11-30 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发 布 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由内蒙古自治区农牧厅提出。本文件由内蒙古自治区农业标准化技术委员会（SAM/TC 20）归口。本文件起草单位：内蒙古农业大学、内蒙古自治区农牧业科学院、鄂尔多斯市农牧业科学研究院、巴彦淖尔市农牧业科学研究院所。本文件主要起草人：霍秀文、张艳芳、郭树春、菅志亮、刘小燕、张晓蒙、张勇、邵盈、赵令敏、乔慧蕾、邢丽南、葛明然、黄小龙。山药根尖染色体制片和核型分析技术规程 1 范围 本文规定了山药根尖染色体制片的试剂溶液配制、制片方法以及核型分析方法。本文件适用于山药根尖染色体玻片制备和核型分析。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。DB15/T 2788 向日葵根尖染色体制片和核型分析技术规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。着丝粒 centromere 染色体主缢痕部位的染色质，是染色体中将两条姐妹染色单体结合起来的区域。核型 karyotype 染色体组在有丝分裂中期的表型，是染色体数目、大小、形态特征的总和。随体 satellite 位于染色体末端的、圆形或圆柱形的染色体片段，通过次缢痕与染色体主要部分相连，主要由异染色质组成，含高度重复的 DNA 序列，不具有常染色质的功能活性。染色体核型分析 chromosome karyotyping 以分裂中期染色体为研究对象，根据染色体的长度、着丝粒位置、长短臂比例、随体的有无等特征，对染色体进行分组、比较、排队、配对，并进行形态分析的过程。4 试剂配制 本文件用到的试剂参见附录 A 中表 A.3。5 染色体标本的制备 样本的获取 选择打破休眠的山药块茎或者零余子，播种于装有育苗基质的营养钵中，在温度 24 2，湿度 60%，光照强度 3000 lx 的培养室中培养生根。预处理 剪取0.5 cm1 cm的根尖材料自来水冲洗后，置于8-羟基喹啉预处理液中14 处理1 h。固定 将预处理的根尖蒸馏水冲洗后放入卡诺固定液中4 固定24 h。前低渗 将固定后的根尖蒸馏水冲洗后置于0.075 mol/L氯化钾溶液中，室温处理30 min。解离 将低渗处理后的根尖蒸馏水冲洗后置于0.25 mol/L的盐酸溶液37 水浴12 min。再蒸馏水冲洗10 min后用乙酸-乙酸钠缓冲液浸泡4 min，用3%纤维素酶和0.1%果胶酶酶解液37 水浴18 min。后低渗 室温条件下蒸馏水后低渗处理30 min以上。染色压片 将处理后的根尖置于干净的载玻片，滴改良卡宝品红染液染色2 min。盖上盖玻片轻压。镜检及图像采集 在100倍的显微镜下观察中期分裂相，对染色体充分分散的分裂相进行拍照。6 染色体核型分析 分析方法 取30个以上中期分裂相进行染色体计数。选择背景清晰、染色体形态清晰的5个细胞进行染色体长度的测量，用于核型分析。核型分析方法等见附录B，核型分类依据Stebbins的标准划分见附录B中表B.3。测量 图像相关指标测量使用光学显微图像处理，测量方法参见附录A。Excel 计算 对每个细胞分别计算每条染色体的臂比和绝对长度总长，并列出着丝粒位置类别。同源染色体配对及排列 按染色体形态大小和着丝粒位置进行染色体配对，方法见附录B。核型模式图绘制 分析方法按照DB15/T 2788的规定。使用VideoTesT-Karyo染色体分析软件进行染色体核型图的制作，运用Microsoft office Excel制作核型模式图；结果见附录B。A A 附录A （资料性）染色体长度测量步骤及本技术规程用到的试剂和配置方法 A.1 染色体长度测量步骤 A.1.1 扫描修整图像 用 OLYMPUS BX 51 显微镜观察染色体制片，在 100物镜下对染色体充分分散的中期分裂相进行拍照。对河南铁棍山药材料取 40 个中期分裂相进行染色体计数。选择背景清晰、染色体形态清晰的 5 个细胞进行拍照，图像采集使用奥特光学显微图像处理系统 OPTPro 2008v2.0 完成。A.1.2 整理同源染色体并测量 选择染色体形态清晰的 5 个细胞进行染色体长度的测量。按染色体形态大小和着丝粒位置进行染色体配对。使用软件中“图像测量”菜单里“直线”或“曲线”测量工具测量染色体长臂、短臂及随体的绝对长度。对每个细胞分别计算每条染色体的臂比和绝对长度总长，并列出着丝粒位置类别，由此进行同源染色体的配对。对每个细胞配对后计算每对同源染色体的长臂、短臂平均值，得到这个细胞的长臂值、短臂值。对细胞的长臂值、短臂值再对应地求平均值。得到该材料的长臂值、短臂值。由该材料的长短臂值，计算染色体总长并做记录，由此进行染色体排序。各指标的测量使用奥特光学显微图像处理系统 OPTPro2008v 2.0 完成。核型不对称系数的计算按照 ARANO 的方法，即核型不对称系数=长臂总长/全组染色体总长。相对长度指数(indexof relative length)按照 KUO 的方法计算并对染色体进行分类，即 IRL=染色体长度/全组染色体平均长度。A.2 染色体参数计算 按染色体形态大小和着丝粒位置进行染色体配对，并根据染色体臂长计算出染色体绝对长度、相对长度和臂比等核型参数。使用 VideoTesT-Karyo 染色体分析软件进行染色体核型图的制作，运用Microsoft office Excel 制作核型模式图。A.3 试剂及配置方法 试剂及配置方法见表 A.1。表A.1 试剂及配置方法 试剂名称 配制方法 0.002 mol/L 8-羟基喹啉 称取 0.29 g 8-羟基喹啉，先加入少许乙醇溶解，然后用蒸馏水定容至 1000 mL。对二氯苯饱和水溶液 称取 15 g 对二氯苯，60 蒸馏水中搅拌溶解，定容至 1000 mL，静置 1 h 取上清，室温储存备用。0.01%秋水仙素溶液 称取 0.1 g 秋水仙素，先用少许乙醇溶解，用蒸馏水定容至 1000 mL。0.075 mol/L 氯化钾溶液 称氯化钾 5.59 g，蒸馏水溶解，定容至 1000 mL。1 mol/L 盐酸 量取 83 mL36%38%的浓盐酸，加蒸馏水定容至 1000 mL。乙酸-乙酸钠缓冲溶液(pH=4.75)溶液 A：量取冰醋酸 1.5 mL，定容至 250 mL，制成 0.1 mol/L 醋酸溶液；溶液 B：称取醋酸钠 2.05 g，溶解后定容至 250 mL，制成 0.1 mol/L 醋酸钠溶液；使用时等体积混合，4冷藏备用。酶解液 酶解液含 3%纤维素酶和 0.1%果胶酶。取 3 g 纤维素酶（Cellulose Onozuka R-10）和0.1 g 果胶酶（Pectolyase Y-23），分别加入少量的乙酸-乙酸钠缓冲液，待溶解后定容至 100 mL。表A.1 试剂及配置方法（续）试剂名称 配制方法 改良卡宝品红染液 原液 A：3 g 碱性品红，溶于 100 mL 70%酒精中（可长期保存）。原液 B：取 10 mL 原液 A 加入 5%苯酚水溶液 90 mL（棕色瓶中保存，限两周内使用）。染色液母液：55 mL 原液 B 加冰醋酸和 6 mL 37%甲醛。改良卡宝品红染液：10 mL 染色液母液加 45%乙酸 90 mL，最后加山梨醇 1.8 g，室温下放置两周后待用。B B 附录B （规范性）着丝粒位置 B.1 着丝粒位置见表 B.1。表B.1 着丝粒位置 臂比 着丝粒位置 符号 1.00 正中部着丝粒 M 1.01-1.70 中部着丝粒 m 1.71-3.00 近中部着丝粒 sm 3.01-7.00 近端部着丝粒 st 7.01 以上 端部着丝粒 t B.2 染色体长度类型见表 B.2。表B.2 染色体长度类型 绝对长度（m）长度类型 符号 1 微小型染色体 S 1-4 小型染色体 M1 4-10 中等染色体 M2 10-30 大染色体 L B.3 染色体核型分类标准见表 B.3。表B.3 染色体核型分类标准 染色体长度比(L/S)臂比2:1 的染色体的百分比 0.0 0.01-0.5 0.51-0.99 1.00 4：1 1C 2C 3C 4C B.4 染色体核型分析参数见表 B.4。表B.4 染色体核型分析参数 序号 绝对长度（m）染色体长度(m)相对长度(%)相对长度系数 臂比 染色体类型 着丝点类型 长臂 短臂 全长 1 2 注：具随体(或次缢痕)的染色体(sat)用“*”标记 B.5 染色体分裂相及染色体模式见图 B.1。图B.1 染色体分裂相及染色体模式图