BNP和IL-6双标记时间分辨免疫荧光检测方法的建立及初步应用.pdf

实验与检验医学 2023 年 4 月第 41 卷第 2 期 Experimental and Laboratory Medicine,Apr.2023,Vol.41,No.2BNP 和 IL-6 双标记时间分辨免疫荧光检测方法的建立及初步应用李云鹏1，郝培远2，曹雪明2，闫兆月1，王恩锋1，代荣钦1*渊1.河南省人民医院中心 ICU 外科重症监护病房袁河南 郑州 450003曰2.华中阜外医院心内科袁河南 郑州 450000冤摘要:目的 研制一种脑钠肽渊BNP冤尧白细胞介素-6渊IL-6冤的双标记时间分辨免疫荧光分析方法渊TRFIA冤并对其性能进行初步评价遥方法 将抗 BNP 和 IL-6 单克隆抗体渊MAb冤作为包被抗体包被在 96 孔板袁用 Eu3+和 Sm3+分别标记另一配对抗体作为检测抗体袁建立双抗体夹心 TRFIA 分析法并制备成试剂盒遥 进行灵敏度尧准确度尧重复性尧特异性尧稳定性和临床样本比对等实验评价其检测性能遥 结果 制备的双标记时间分辨免疫荧光试剂盒对 BNP 检测的线性范围为 10 pg/mL耀5 000 pg/mL袁灵敏度为8.65 pg/mL袁对 IL-6 检测的线性范围为 1 pg/mL耀1 000 pg/mL袁灵敏度为 5.36 pg/mL遥BNP的回收率在 91.49%耀99.16%袁批内 CV 在 5.73%耀8.96%袁批间 CV 在 8.42%耀11.73%曰IL-6 的回收率在 93.95%耀111.50%袁批内 CV 在 7.32%耀10.07%袁批间 CV在 9.40%耀11.30%遥与血清中常见的脓毒血症检测指标均无明显的交叉反应遥试剂盒能够在 4益稳定保存半年袁37益稳定保存7 d遥 对临床样本的检测发现袁该方法参考区间 Cut-off 值 BNP院46.01 pg/mL袁IL-6院13.62 pg/mL曰检测结果与临床诊断结果一致袁准确性较好遥结论 建立的 BNP 和 IL-6 双标记 TRFIA 方法具有高灵敏度尧高特异性尧高准确率尧方便快捷等优点袁可作为预警脓毒症发生尧预测脓毒症病情程度及临床预后的一种新的实验室检测方法遥关键词:脓毒血症曰双抗体夹心曰双标记时间分辨免疫荧光分析中图分类号：R446.61文献标识码：A文章编号：1674-1129(2023)02-0127-05DOI院10.3969/j.issn.1674-1129.2023.02.002Establishment and preliminary application of BNP and IL-6 double-labeled time-resolved immunofluorescence detectionmethod LI Yunpeng1,HAO Peiyuan2,CAO Xueming2,YAN Zhaoyue1,WANG Enfeng1,DAI Rongqin1.1.Central ICU(Surgery In鄄tensive Care Unit),Henan Provincial Peoples Hospital,Henan,Zhengzhou,450003,China;2.Department of Cardiology,Central ChinaFuwai Hospital,Henan,Zhengzhou,450000,China.Abstract院Objective To develop a dual-labeled time-resolved fluoroimmunoassay(TRFIA)for the detection of brain natri鄄uretic peptide(BNP)and interleukin-6(IL-6)levels.Methods Anti-BNP and anti-IL-6 monoclonal antibodies(MAb)were usedas coating antibodies to coat 96-well plates,and Eu3+and Sm3+were used to label the other paired antibodies as detection antibod鄄ies to establish a double antibody sandwich TRFIA method.Sensitivity,accuracy,repeatability,specificity,stability and clinicalsample comparison experiments to evaluate its detection performance.Results The linear range of BNP was 10 pg/mL耀5 000 pg/mL,sensitivity was 8.65 pg/mL,and the linear range of IL-6 was 1 pg/mL耀1 000 pg/mL,sensitivity was 5.36 pg/mL.The recoveryrate of BNP was 91.49%耀99.16%,the intra-assay CV was 5.73%耀8.96%,the inter-assay CV was 8.42%耀11.73%;the recoveryrate of IL-6 was 93.95%耀111.50%,and the intra-assay CV was 7.32%耀10.07%,the inter-assay CV was 9.40%耀11.30%.There isno obvious cross-reaction with common serum interferents.The kit can be stored stably at 4毅C for half a year and at 37毅C for 7days.The clinical samples detection found that the reference interval(Cut-off value)of BNP was 46.01 pg/mL,and IL-6 was13.62pg/mL;the results were consistent with the clinical diagnosis results,indicating the accuracy of this TRFIA was good.ConclusionThe established BNP and IL-6 dual-labeled TRFIA method has the high sensitivity,high specificity,high accuracy and conve鄄nience,which can be used as a new laboratory test for early warning of sepsis,predicting the severity of sepsis and clinical prog鄄nosis.Key words院 Sepsis;Double antibody sandwich;Dual-labeled time-resolved fluoroimmunoassay基金项目：国家卫计委河南省联合共建项目，编号 SB201902033；河南省科技厅科技攻关项目，编号 182102310525作者简介：李云鹏，男，硕士研究生，主治医师，主要研究：方向重症医学。通讯作者：代荣钦 论 著 127窑窑实验与检验医学 2023 年 4 月第 41 卷第 2 期 Experimental and Laboratory Medicine,Apr.2023,Vol.41,No.2脓毒症是一系列伴随着宿主防御机制的感染性炎症反应综合征1袁是造成患者发生器官功能障碍甚至死亡的重要原因2遥 随着感染治疗和器官功能支持技术的不断进步袁 脓毒血症的预后效果有一定的改善袁 但如不尽早诊断并进行针对性的治疗袁 则可能发展为脓毒性休克和多功能障碍综合征袁其病死率高达 30%70%3-4遥 因此袁脓毒症的早期诊断极为重要遥 目前袁临床上除参照临床症状尧血流动力学和器官功能障碍参数等外袁 脓毒症特异性的标志物检测也是一种主要的实验室辅助检测方法遥脑钠肽渊BNP冤主要由心室肌细胞合成并分泌的一种神经激素袁 脓毒血症患者体内大量炎症因子和内毒素会选择性刺激 BNP 的合成和释放遥因此袁 高水平的 BNP 往往预示着发生脓毒症的风险较高及其预后不佳5-6遥 白细胞介素-6渊IL-6冤是一种典型的炎症因子袁当患者被细菌感染时袁能更早地出现在血液中袁 是诊断患者早期细菌感染的一个主要指标7遥 临床研究发现袁脓毒症患者血清IL-6 水平显著升高袁 其检测有助于脓毒症患者的诊断和病情严重程度的判断8-9遥 此外袁有研究指出同时检测脓毒症患者血清中 IL-6 和 BNP 水平袁可更准确地反映脓毒症的严重程度及其预后情况10遥本实验的目的是建立一种 BNP 和 IL-6 双标记时间分辨免疫荧光检测方法渊Time-resolved fluoroim鄄munoassay袁TRFIA冤袁为脓毒症的快速尧精准诊断提供新的实验室手段遥1 材料和方法1.1 材料和仪器 配对抗 BNP MAb渊YD1018 和YD1036冤袁配对抗 IL-6 MAb渊YD3004 和 YD3012冤以及 BNP 和 IL-6 标准抗原均购自广州优迪生物科技股份有限公司曰96 孔板购自 Corning 公司曰铕渊Eu3+冤和钐渊Sm3+冤标记试剂盒尧全自动时间分辨荧光免疫分析检测仪 渊型号 Victor 1420冤 购自PerkinElmer 公司曰 牛血清白蛋白 渊BSA冤 购自Fitzgerald 公司曰Sephades-G50 填料购自 GE 公司遥1.2 临床血清样本 脓毒症患者阳性血清和健康志愿者血清来自河南省人民医院遥 纳入标准院临床确诊的脓毒症患者或健康志愿者遥 排除标准院有其他感染性疾病尧传染病尧心血管异常尧正在接受药物治疗等的样本遥 共有 70 例临床确诊的脓毒血症患者阳性血清样本和 100 份健康志愿者阴性血清样本纳入本次研究遥 所有参与者或监护人均签署了知情同意书遥1.3 固相包被抗体的制备 将包被抗体渊YD1018和 YD3004冤 用包被缓冲液稀释到适宜浓度袁100滋L/孔加入到 96 孔板中袁4益包被过夜袁 弃包被液袁加入封闭液袁250 滋L/孔袁37益封闭 2 h袁 弃掉封闭液袁用洗涤液洗涤 2 次袁真空冷冻干燥袁置于-20益保存备用遥 对包被抗体的包被浓度进行优化遥1.4 Eu3+和 Sm3+标记检测抗体及其纯化 使用Eu3+和 Sm3+标记试剂盒进行抗体标记袁标记步骤参考试剂盒说明书进行遥 将 0.5 mg BNP 检测抗体渊YD1036冤加入 Millipore 的带有滤膜的离心管中袁8 000 r/min 离心 10 min遥用标记缓冲液重复洗涤 6次遥 将 200 滋L 检测抗体与 50 滋g Eu3+标记试剂充分震荡混匀袁 室温下振荡过夜遥 标记完成后袁过Sephadex G-50 层析柱纯化袁洗脱液进行洗脱遥 用相同的方法对 IL-6 检测抗体渊YD3012冤进行 Sm3+标记遥1.5 标准品的制备 用标准品稀释液将 BNP 抗原配制成浓度为 0 pg/mL尧10 pg/mL尧100 pg/mL尧500pg/mL尧1 000 pg/mL尧5 000 pg/mL 的系列标准品溶液袁 将 IL-6 抗原配制成浓度为 0 pg/mL尧1 pg/mL尧10 pg/mL尧100 pg/mL尧500 pg/mL 和 1 000 pg/mL 的系列标准品溶液遥 长期渊-20益冤/短期渊一个月之内袁4益冤保存备用遥1.6 TRFIA 法检测步骤 向包被微孔板上依次加入适量体积的标准品或待测样品袁 再加入 200 滋L分析缓冲液袁 室温振动孵育 1 h袁 用洗涤液洗涤 4次后袁 加入适量体积的 Eu3+和 Sm3+标记的 BNP和 IL-6 抗体袁室温下孵育 1 h遥 洗涤液洗涤 6 次袁加入 200 滋L/孔增强液袁 振摇 5 min 后袁 在 Victor1420 荧光检测仪上检测荧光值遥 对待测样本加入量和 Eu3+/Sm3+标记抗体加入量进行优化遥1.7 TRFIA 方法检测性能评估1.7.1 绘制标准曲线 使用 野1.6冶 步骤中制备的BNP/IL-6 系列标准品袁进行 TRFIA 检测袁每个浓度测定 3 个复孔共测定 3 次袁绘制标准曲线袁并进行标准曲线的线性拟合袁计算相关系数遥 以浓度为0 pg/mL 的 BNP/IL-6 标准品为样本袁 将其平行测定的 20 次荧光值均值加上 2 倍的标准差 渊mean+2SD冤代入标准曲线方程袁计算本方法检测血清中BNP/IL-6 的灵敏度遥1.7.2 准确度和精密度实验 将 BNP 和 IL-6 标准品分别用阴性血清稀释为高尧中和低 3 个浓度袁每个浓度各设 3 个复孔重复检测 10 次袁 计算高尧中128窑窑实验与检验医学 2023 年 4 月第 41 卷第 2 期 Experimental and Laboratory Medicine,Apr.2023,Vol.41,No.2和低 3 个浓度标准品测定的均数尧标准差尧变异系数渊CV冤以及回收率渊回收率%=测定浓度/加标浓度伊100%冤1.7.3 特异性实验 用本研究建立的 TRFIA 方法同时检测血清中常见的干扰物质院PCT 标准品渊100ng/mL冤尧hs-CRP 标准品渊100 滋g/mL冤尧TNF-琢 标准品渊100 ng/mL冤尧人血清白蛋白渊100 ng/mL冤尧纤维蛋白原渊100 ng/mL冤和基质金属蛋白酶-9渊100 ng/mL冤袁比较检测结果袁进行特异性实验遥1.7.4 稳定性实验本研究制备的 TRFIA 试剂盒置于 4益冰箱 6 个月和 37益 7 d袁 对试剂盒的物理外观袁剂量-反应曲线的线性尧灵敏度尧准确度尧特异性等指标进行测定袁具体检测方法同上遥1.7.5 BNP 和 IL-6 参考区间的确定 收集 100 份健康志愿者的血清袁 采用本方法分别测定血清中BNP 和 IL-6 的浓度袁分析正态分布袁确定 95%CI袁计算 BNP 和 IL-6 的参考值范围上下限袁 确定本TRFIA 法检测 BNP 和 IL-6 的参考值范围遥1.8 临床样本对比检测 取 70 例临床确诊的脓毒血症患者阳性血清样本袁15 份健康志愿者阴性血清样本袁采用本研究建立的 TRFIA 方法进行检测袁对检测结果进行对比分析袁 以测试本 TRFIA 法的临床检测效果遥1.9 统计学分析 采用 SPSS 17.0 软件进行统计分析袁 结果以 mean 依 SD 表示袁Graph Pad Prism 5 软件计算标准曲线方程遥2 结果2.1 TRFIA 最佳反应条件的确定 本研究建立的双抗体夹心 TRFIA 分析法袁经过对各参数的优化袁确定了 TRFIA 反应的最佳条件院BNP 和 IL-6 包被抗体的浓度分别为 4 滋g/mL 和 5 滋g/mL袁100 滋L/孔曰反应体系为 50 滋L 标准品或待测样品+200 滋L/孔 Eu3+渊或 Sm3+冤-标记抗体遥 因此袁TRFIA 最佳反应步骤为院 向包被微孔板上依次加入 50 滋L 的标准品或待测样品袁 再加入 200 滋L 分析缓冲液袁室温振动孵育 1 h袁用洗涤液洗涤 4 次后袁加入 200滋L Eu3+和 Sm3+标记的 BNP 和 IL-6 抗体袁室温下孵育 1 h遥 洗涤液洗涤 6 次袁 加入 200 滋L/孔增强液袁振摇 5 min 后袁在 Victor 1420 荧光检测仪上检测荧光值遥2.2 标准曲线及其灵敏度结果 以 BNP 和 IL-6 标准品系列浓度为横坐标袁 其对应的荧光值的对数值为纵坐标袁BNP 方程为 Y=0.4117x+2.8774袁R2=0.9962袁线性范围为 10 pg/mL耀5000 pg/mL 曰IL-6方程为 Y=0.4016x+3.1385袁R2=0.9915袁 线性范围为 1 pg/mL耀1 000 pg/mL遥 平行测定 10 次浓度空白参考标准品的荧光值袁 计算得出本 TRFIA 法对BNP 的检测灵敏度为 8.65 pg/mL袁对 IL-6 的检测灵敏度为 5.36 pg/mL遥 见图 1遥2.3 准确度和重复性试验结果 准确度和重复性实验结果袁3 个水平 BNP 的回收率在 91.49%耀99.16%袁 批内 CV 在 5.73%耀8.96%袁 批间 CV 在8.42%耀11.73%遥 3 个水平 IL-6 的回收率在 93.95%耀111.50%袁批内 CV 在 7.32%耀10.07%袁批间 CV 在9.40%耀11.30%遥 见表 1遥2.4 特异性试验结果 采用本研究制备的 TRFIA试剂盒检测血清中常见的干扰物质渊PCT尧hs-CRP尧图 1 BNP 和 IL-6 标准曲线Intra-array(n=10)Inter-array(n=10)NamesBNPIL-6Samplesconcentration(pg/mL)502002 00010100500mean SD(pg/mL)49.582.84185.6216.641 889.92115.2411.021.1196.259.26486.3435.61Recovery(%)99.1692.8194.49110.2096.2597.27CV(%)5.738.966.1010.079.627.32mean SD(pg/mL)47.253.98182.9720.211 878.55220.4611.151.0793.9510.62485.2945.62Recovery(%)94.591.4993.93111.5093.9597.058CV(%)8.4211.0411.739.6011.309.40表 1 BNP 和 IL-6 TRFIA 试剂盒准确度和重复性结果129窑窑实验与检验医学 2023 年 4 月第 41 卷第 2 期 Experimental and Laboratory Medicine,Apr.2023,Vol.41,No.2TNF-琢尧人血清白蛋白尧纤维蛋白原和基质金属蛋白酶-9冤遥 高浓度的干扰物质的检测值均小于 BNP和 IL-6 的参考区间 渊Cut-off 值冤袁 结果判定为阴性遥 见表 2遥2.5 稳定性试验结果 将本研究制备的 BNP 和IL-6 TRFIA 试剂盒置于 4益 6 个月和 37益 7 d袁观察试剂盒的外观袁并测定其准确度尧重复性和特异性等指标遥 结果显示袁 试剂盒置 4益保存 6 个月袁37益保存 7 d袁 参考 BNP 和 IL-6 标准品的各点荧光值并未随着条件的改变而发生明显变化袁 试剂盒检测性能无明显改变遥 表明该 TRFIA 方法制备的试剂盒稳定性较好遥2.6 BNP 和 IL-6 参考区间 收集 100 份健康志愿者的血清袁 采用本方法分别测定血清中 BNP 和IL-6 的浓度遥对计算获得的 BNP 和 IL-6 浓度使用SPSS 19.0 进行正态性检验袁 发现其浓度呈正态分布袁因此采用 95豫CI 范围计算 Cut-off 值渊Cut-off=mean+1.64SD冤遥 100 份健康志愿者血清中 BNP 平均浓度为 32.15 pg/mL袁SD 为 8.45袁计算得到 Cut-off值为 46.01 pg/mL袁IL-6 平均浓度为 8.45 pg/mL袁SD为 3.15袁计算得到 Cut-off 值为 13.62 pg/mL遥2.7 临床样本对比检测结果 采用该 TRFIA 试剂盒对 70 例临床确诊的脓毒血症患者阳性血清样本袁15 份健康志愿者阴性血清样本进行检测遥 结果发现袁70 例阳性血清样本的 BNP 和 IL-6 检测值均大于其 Cut-off 值袁提示该类样本为脓毒症阳性曰15 例阴性血清样本的 BNP 和 IL-6 检测值均小于其 Cut-off 值袁提示该类样本为脓毒症阴性遥3 讨论脓毒症是重症监护病房渊ICU冤患者中常见的危重疾病袁临床表现是高热尧低温尧胸痛尧寒战尧意识障碍尧咳嗽尧少尿尧少痛等症状袁如不能及时治疗袁可能造成多器官相关功能障碍综合征袁进而危及生命遥 同时袁 脓毒症在儿科临床中发病率也较高袁可继发心尧肝尧肾多种器官病变袁近年来已经成为儿科重症监护室中主要造成危重患儿死亡的因素11-12遥 在临床上袁可采用血清 IL-6尧降钙素原渊PCT冤尧超敏 C-反应蛋白渊hs-CRP冤等炎症因子水平检验袁 为脓毒症疾病程度及临床预后评估提供重要参考13-14遥 常用的检测方法渊比如 ELISA 法袁PCR 法尧化学发光法等冤具有各自的优点和缺陷袁因此选择一种灵敏度高尧特异性强尧准确率高尧简便快捷的检测方法袁是临床检测成败的第一步遥时间分辨荧光免疫分析(Time-resolvedfluo鄄roimmunoassay袁TRFIA)是一种新兴的超灵敏检测方法袁 采用镧系元素如 Eu3+尧Sm3+等作为标记物放大信号强度袁 其灵敏度和准确性明显高于ELISA袁特异性又明显高于常规 PCR15遥 TRFIA 因其显著的优点袁发展迅速袁已广泛地应用于各种疾病标志物尧病毒尧细菌尧有毒添加物尧激素等快速定量检测16-17遥 本研究袁结合单一标志物检测准确性较差袁 而同时检测多指标可大大提高检测准确性的现状18袁采用双标记渊Eu3+和 Sm3+冤法建立了一种 BNP/IL-6 双标记时间分辨免疫荧光试剂盒袁实现 BNP 和 IL-6 的同时检测袁 充分发挥了 TRFIA法灵敏度高尧特异性强等优点袁以及双标记检测准确性高的优点遥本研究利用 Eu3+标记抗 BNP MAb 和 Sm3+标记抗 IL-6 MAb袁 采用双抗体夹心法建立 BNP/IL-6 双标记时间分辨免疫荧光试剂盒袁 能够同时对人血清中的 BNP 和 IL-进行检测遥 经过对试剂盒各性能进行评估袁结果显示袁BNP 检测的线性范围为 10 pg/mL耀5 000 pg/mL袁 灵敏度为 8.65 pg/mL袁IL-6 检测的线性范围为 1 pg/mL耀1 000 pg/mL袁灵敏度为 5.36 pg/mL袁线性范围宽袁灵敏度高曰BNP 的回收率在 91.49%耀99.16%袁 批内 CV 在5.73%耀8.96%袁批间 CV 在 8.42%耀11.73%曰IL-6 的回收率在 93.95%耀111.50%袁 批内 CV 在 7.32%耀10.07%袁批间 CV 在 9.40%耀11.30%袁准确度和重复性较高曰 与其它常见的脓毒血症检测指标均无明显的交叉反应袁特异性好曰试剂盒能够在 4益稳定测量指标测量值(pg/mL)BNPIL-6BNPIL-6BNPIL-6BNPIL-6BNPIL-6BNPIL-622.935.6217.866.8530.077.1431.258.2511.736.5414.966.46结果阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性干扰物/干扰物浓度PCT(100 ng/mL)hs-CRP(100g/mL)TNF-(100 ng/mL)人血清白蛋白(100 ng/mL)纤维蛋白原(100 ng/mL)基质金属蛋白酶-9(100 ng/mL)表 2 TRFIA 试剂盒的特异性实验结果130窑窑实验与检验医学 2023 年 4 月第 41 卷第 2 期 Experimental and Laboratory Medicine,Apr.2023,Vol.41,No.2保存半年袁37益稳定保存 7 d袁稳定性好曰对于临床样本袁 该方法参考区间 cut-off 值 BNP 为 46.01 pg/mL袁IL-6 为 13.62 pg/mL袁表明当利用本 TRFIA 试剂盒检测得到的 BNP 浓度值大于 46.01 pg/mL袁IL-6 浓度值大于 13.62 pg/mL袁该样本可能为脓毒症阳性遥 此外袁70 例阳性尧15 例阴性血清样本的TRFIA 的检测结果与临床诊断结果一致袁 说明该检测方法准确度较高遥综上所述袁本研究建立的 BNP/IL-6 双标记时间分辨免疫荧光试剂盒具有高灵敏度尧高特异性尧高准确性等优势袁 能够实现 BNP 和 IL-6 的同时尧快速检测袁可作为预警脓毒症发生尧预测脓毒症病情程度及临床预后的一种新的实验室检测方法遥参考文献1van der Poll T,Opal SM.Host-pathogen interactions in sepsisJ.Lancet Infect Dis,2008,8(1):32-43.2郭皓,王海燕,祁红辉,等.重症脓毒症患者外周血单核细胞膜结合 CD14 受体的表达与预后关系J.临床荟萃,2010,25(11):946-948.3韩宇,高传玉,秦秉玉,等.抗凝治疗对脓毒症凝血和炎症指标的影响及其意义J.中华危重病急救医学,2015,27(2):102-105.4吴钦良,嵇金陵,张小云.血清降钙素原动态检测对脓毒血症诊断和预后的应用价值分析J.临床血液学杂志(输血与检验),2018,31(6):12-14.5马焕先,史宪杰,梁雨荣,等.乳酸清除率及 BNP 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