DNA甲基化预测宫颈癌及癌前病变的研究进展.pdf

国际妇产科学杂志2023年6月第50卷第3期J Int Obstet Gynecol，June 2023，Vol.50，No.3DNA 甲基化预测宫颈癌及癌前病变的研究进展吴若兰，邱丽华【摘要】近年来随着早期筛查的普及，我国的宫颈癌发病率及死亡率均有所下降，细胞学检查及高危型人乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV）检测是目前常用的宫颈癌筛查手段，但二者均有局限性，细胞学检查可能导致疾病漏诊，而高危型HPV检测常导致过度诊疗，因此，探索一种新的宫颈癌筛查或分流手段十分必要。DNA甲基化是一种常见的表观遗传方式，随着DNA甲基化检测技术的发展，其在肿瘤诊疗领域发挥越来越大的作用。近年来发现许多甲基化基因可作为宫颈癌标志物，在宫颈癌筛查及分流方面具有应用前景，并且具有预测疾病转归、采样方便等优势，有利于宫颈癌的早期诊断及治疗。综述DNA甲基化在宫颈癌及宫颈癌前病变中的相关研究进展。【关键词】DNA甲基化；宫颈肿瘤；癌前状态；癌症早期检测；乳头状瘤病毒科Research Progress on DNA Methylation in Predicting Cervical Cancer and Precancerous LesionsWU Ruo-Lan,QIULi-hua.Department of Obstetrics and Gynecology,Shanghai Key Laboratory of Gynecologic Oncology,Ren Ji Hospital,Schoolof Medicine,Shanghai Jiao Tong University,Shanghai 200127,ChinaCorresponding author:QIU Li-hua,E-mail:【Abstract】In recent years,with the popularization of early screening,the incidence and mortality rate of cervical cancerin China have decreased.Cytological examination and high-risk human papilloma virus(HPV)test are common screeningmethods for cervical cancer at present,but they both have their limitations.Cytological examination may lead to misseddiagnosis,while high-risk HPV test may lead to over-diagnosis and over-treatment.Therefore,it is necessary to explore a newscreening or triage method for cervical cancer.DNA methylation is a common epigenetic modality.With the development ofDNA methylation detection technology,DNA methylation has played an increasingly important role in the field of oncologydiagnosis and treatment.In recent years,a large amount of DNA methylation genes has been found as markers of cervicalcancer,which have a promising application in cervical cancer screening and triage,and have the advantages of prognosisprediction and convenient sampling.DNA methylation is beneficial for the early diagnosis and treatment of cervical cancer.Thisarticle reviews the research progress of DNA methylation in cervical cancer and precancerous lesions.【Keywords】DNA methylation;Uterine cervical neoplasms;Precancerous conditions;Early detection of cancer;Papillomaviridae（J Int Obstet Gynecol，2023，50：281-285）综 述 DOI:10.12280/gjfckx.20230135基金项目：国家自然科学基金（82072865）作者单位：200127上海交通大学医学院附属仁济医院妇产科，上海市妇科肿瘤重点实验室通信作者：邱丽华，E-mail：审校者目前，发展中国家宫颈癌的发病率及死亡率均远高于发达国家1。人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染是宫颈癌发生的主要原因，与全球超过99%的宫颈鳞状细胞癌病例相关2。近年来，随着HPV疫苗接种的开展及宫颈癌筛查的广泛施行，全球多数地区宫颈癌的发病率及死亡率均有所下降1。目前临床上主要采用细胞学及HPV检测进行宫颈癌筛查，然而这两种筛查方法仍然具有局限性。细胞学检查的敏感度较低，可能增加漏诊率；而HPV检测的敏感度高但特异度低，对于高危型HPV一过性感染的群体，尤其是30岁以下的年轻女性，HPV检测可能导致过高的阴道镜转诊率甚至过度治疗。因此，探索一种新的筛查或分流手段十分必要。癌症是一种由遗传异常引发和驱动的疾病，表观遗传途径在肿瘤的发生、发展过程中发挥至关重要的作用。DNA甲基化是常见的表观遗传调控方法，近年来已被发现可以作为宫颈癌等多种肿瘤的生物标志物3。CpG岛是长度约1 kb的富含CpG二核苷酸（60%70%）的DNA区域，通常位于基因的启动子或第一外显子区域，CpG岛的甲基化与基因的沉默密切相关，肿瘤抑制基因启动子区域CpG岛的高甲基化引起其转录沉默，参与癌症发生和进展过程4。近年来，随着焦磷酸测序和甲基化特异性聚281国际妇产科学杂志2023年6月第50卷第3期J Int Obstet Gynecol，June 2023，Vol.50，No.3合酶链反应（methylation-specific polymerase chainreaction，MSP）等DNA甲基化检测技术的发展，发现越来越多的甲基化基因具有作为宫颈癌生物标志物的潜能，其中部分甲基化基因在宫颈癌和癌前病变临床筛查及分流中的作用已得到研究及验证。1宿主细胞 DNA 甲基化与宫颈癌/癌前病变1.1配对盒家族基因 1（paired boxed gene 1，PAX1）PAX1是一种属于配对盒基因家族的转录因子。研究表明，PAX1在癌症的发生、发展中具有重要作用，能够在表皮生长因子（epidermal growthfactor，EGF）和白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）等致癌因子的刺激下抑制多种激酶的磷酸化，并且激活双特异性磷酸酶1/5/6（dual-specificity phosphatase1/5/6，DUSP1/5/6）等磷酸酶，抑制EGF/丝裂原激活的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路，从而抑制肿瘤的发生与发展5-6。一项纳入7项研究共1 055例正常或有宫颈病变女性的荟萃分析证明PAX1基因甲基化与宫颈上皮内瘤变1（cervical intraepithelial neoplasia 1，CIN1）向CIN2/3转化（OR=0.09，95%CI：0.040.19）及CIN2/3向宫颈癌转化（OR=0.16，95%CI：0.050.46）密切相关7，这意味着PAX1基因甲基化阳性时宫颈病变进展风险增加。另一项荟萃分析提示，甲基化PAX1诊断CIN2和正常宫颈样本的敏感度为66%，特异度为92%；诊断CIN3和正常宫颈样本的敏感度为77%，特异度为92%8。Zhang等9研究发现，当阈值循环数（cycle threshold，Ct）临界值为37.95时（进行定量MSP后设定的临界阈值，大于该值时，认为PAX1基因甲基化阴性；小于等于该值时，认为PAX1基因甲基化阳性），PAX1诊断宫颈高级别鳞状上皮内病变（high-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL）及宫颈癌的特异度及敏感度分别为90%和75%，并且随着疾病进展，PAX1的甲基化水平也随之增加。1.2FAM19A4/miR124-2FAM19A4/miR124-2也是常见的宫颈DNA甲基化标志物。FAM19A4是一种经典的分泌蛋白，主要在中枢神经系统中表达并在脂多糖刺激的单核细胞和巨噬细胞中显著上调10。尽管其在宫颈癌进展中的具体机制尚不明确，但2013年Steenbergen等11利用甲基化特异性数字核型分析及半定量MSP发现FAM19A4的甲基化水平在宫颈疾病中显著升高。miR124-2是一种小的内源性非编码RNA分子，在宫颈癌细胞系SiHa、CaSki、HeLa及HPV16/18永生化角化细胞的晚期传代中均发生甲基化，可用于宫颈癌的诊断12。一项全球多中心横断面研究显示，FAM19A4/miR124-2甲基化分析能够检测出几乎所有宫颈癌，包括高危型HPV阴性的宫颈癌，甲基化阳性率为98.3%（95%CI：96.7%99.2%）13。除宫颈癌患者的筛查以外，FAM19A4/miR124-2在宫颈癌及癌前病变的分流中也具有重要意义。一项欧洲大型多中心研究显示，FAM19A4/miR124-2诊断宫颈病变的总体特异度为78.3%，诊断CIN3的敏感度为77%，对宫颈癌的阴性预测值高达99.9%；进一步研究显示，甲基化检测对于细胞学检查结果为无明确诊断意义的不典型鳞状细胞（atypical squamous cell of undetermined significance，ASC-US）和宫颈低级别鳞状上皮内病变（low-gradesquamousintraepitheliallesion，LSIL）的HPV阳性患者具有重要的鉴别意义，在该群体中甲基化阳性患者发生CIN3的绝对风险度明显高于甲基化阴性患者14。1.3DLX1、ITGA4、RXFP3、性别决定区 Y 框蛋白17（sex determining region of Y-box 17，SOX17）、锌指蛋白 671（zinc finger protein 671，ZNF671）和ASTN1 基因2014年Hansel等15通过包含237 000个探针的全基因组CpG岛微阵列实验检测宫颈癌中完全甲基化的DNA区域并筛选出100个CpG岛候选区域，再经过定量MSP验证，发现DLX1、ITGA4、RXFP3、SOX17和ZNF671共5个基因能够较好地区分肿瘤样本与正常样本。Schmitz等16基于此开发的由DLX1、ITGA4、RXFP3、SOX17、ZNF671和ASTN1共6个标记区域组成的实时MSP测定试剂盒GynTect，并通过纳入306例进行阴道镜检查女性的横断面研究发现，GynTect检测CIN3+病变的敏感度低于高危型HPV检测（67.7%vs.95.7%），特异度高于高危型HPV检测（82.6%vs.53.1%），提示其能够有效降低高危型HPV检测导致的高阴道镜转诊率。另一项纳入1 758例高危型HPV阳性女性的前瞻性队列研究显示，GynTect甲基化分流CIN2+的敏感度及特异度分别为83.0%和69.9%，可以使阴道镜转诊率降低67.2%17。Dippmann等18在一项纳入149份高危型HPV阳性宫颈样本的研究中比较了GynTect与QIAsure（基 于DNA甲 基 化 标 志 物FAM19A4/miR124-2）试剂盒对于高危型HPV阳性女性的分流能力，结果显示与QIAsure相比，GynTect检测CIN2+（56.7%vs.63.3%，P=0.424）和CIN3+（66.7%vs.78.6%，P=0.125）的敏感度略低，但检测CIN2+（87.6%vs.67.4%，P0.001）和CIN3+（84.1%vs.68.2%，P=0.002）的特异度较高，GynTect分选282国际妇产科学杂志2023年6月第50卷第3期J Int Obstet Gynecol，June 2023，Vol.50，No.3CIN2、CIN3及宫颈癌能够有效降低假阳性率及由此导致的过度治疗。目前国内首个获批的宫颈癌甲基化 检 测 试 剂 盒 即 是 基 于DLX1、ITGA4、RXFP3、SOX17、ZNF671和ASTN1这6个基因的甲基化检测技术，向睿等19的研究证明，该多基因甲基化检测试剂盒鉴别HSIL及宫颈癌患者的准确度可达97.5%，且与金标准病理学结果的诊断一致性极强（Kappa=0.938，P0.001）。此外，该试剂盒检测CIN3+的受试者工作特征曲线下面积也高于细胞学检查及HPV分型联合细胞学检查（分别为0.890、0.591和0.565），其诊断CIN3+的阳性预测值可达90.6%20。黄革21的研究证明，该多基因甲基化检测试剂盒分流高危型HPV的效果优于细胞学检查，且基因甲基化组合的评分能够帮助判断病变的严重程度；多基因甲基化检测宫颈HSIL在不同年龄群体中也有不同的表现，相较年龄35岁的群体，年龄35岁的年轻女性对多基因甲基化检测的敏感度更低（61.5%vs.83.7%），特异度更高（100%vs.88.2%），而年轻女性往往更容易发生HPV的一过性感染及病变的自发消退，多基因甲基化检测或许能够有助于减少年轻女性的阴道镜转诊，减轻患者的经济及身心负担。此外，这也提示甲基化阳性的HSIL患者进展为恶性肿瘤的风险更高，这将为临床筛选癌变高风险人群并进行积极治疗提供切实可行的依据。此外，还有其他甲基化基因被认为可以作为潜在的宫颈癌标志物。Salta等22发现，MAL/miR124-2基因甲基化检测高危型HPV阳性女性HSIL+病变的敏感度为55.56%，特异度为79.78%。Su等23发现ZNF582基因分流高危型HPV阳性女性CIN3+病变的敏感度与细胞学检查相似（83.2%vs.80.6%），特异度高于细胞学检查（93.1%vs.58.5%，P0.001）。SOX1基因亦可作为宫颈癌潜在标志物，一项纳入17项研究共3 491例正常或宫颈病变女性的荟萃分析提示，SOX1基因甲基化鉴别CIN3+的总体敏感度为75%，总体特异度为71%，受试者工作特征曲线下面积为0.8424。Chujan等25发现在无宫颈病变、LSIL及HSIL+患者的宫颈细胞样本中细胞周期蛋白A1（cyclin A1，CCNA1）启动子的甲基化频率分别为0、5.88%及83.33%，表明CCNA1甲基化水平会随着宫颈病变严重程度的增加而升高。另有研究证明，CCNA1检测CIN2+病变的敏感度为19.7%，特异度为99.5%，准确度可达82.14%26。对于细胞学检查结果为ASC-US的患者，CCNA1甲基化检测分流诊断CIN2+患者的特异度为99.3%，阳性似然比达28.427。以上研究均证实DNA甲基化检测在宫颈病变筛查及分流中的意义，尽管还缺乏更多大型多中心的临床研究支持这些标志基因甲基化的作用，但其在宫颈癌防治中的前景可观。2DNA 甲基化检测宫颈病变的优势与不足细胞学检查运用于宫颈癌筛查已达数十年，且在降低宫颈癌发病率及死亡率方面发挥了较大作用，但其仍具有局限性。细胞学检查依赖于检验医师的个人经验，在对ASC-US及不能排除高级别鳞状上皮内病变的不典型鳞状细胞（atypical squamouscell-cannot exclude HSIL，ASC-H）等不明确的细胞学异常的判断上具有一定的主观性28，可重复性方面有所欠缺。而DNA甲基化标志物性质稳定，可重复性高，结果更为客观。目前也有越来越多的宫颈筛查以高危型HPV检测为主，尽管高危型HPV检测敏感度较高，但其无法区分一过性感染和长期感染，其低特异度及低阴性预测值的特性会导致过高的阴道镜转诊率，从而进一步引起过度的阴道镜下有创活检，既导致医疗资源的浪费，同时也引发过度诊疗方面的问题。而DNA甲基化检测则是在寻求宫颈癌筛查敏感度及特异度平衡的情况下提出的新解决策略。除了在宫颈癌筛查及分流方面具有优势外，DNA甲基化检测能够帮助判断宫颈病变患者疾病的转归，从而更好地指导临床医生对疾病的诊治。De Strooper等29对1 040例HPV阳性女性进行细胞学检查或甲基化检测并进行长达14年的随访，结果显示在三轮筛查（于初始、5年后和10年后分别进行筛查）后，初始时FAM19A4/miR124-2甲基化阳性女性的校正累积宫颈癌发病率高于细胞学阳性女性（5.5%vs.4.1%），且甲基化阴性女性的累积发病率低于细胞学阴性女性（1.7%vs.2.4%）。该团队进一步研究了30岁及以上HPV阳性女性的CIN3+发病风险，结果显示在该群体中，FAM19A4/miR124-2甲基化阴性和细胞学阴性具有相似的长期CIN3+低风险（16.3%vs.15.6%），而甲基化阳性女性CIN3+累积发病率达39.8%，有必要立即转诊阴道镜30。Kremer等31的前瞻性研究也提示DNA甲基化对于宫颈疾病的发展具有一定的预测性，初始FAM19A4/miR124-2甲基化阴性的CIN2/3女性的宫颈病变临床消退率显著高于FAM19A4/miR124-2甲基化阳性的CIN2/3女性（74.7%vs.51.4%，P=0.013）；且当细胞学检查结果为ASC-US/LSIL或HPV16为阴性时，FAM19A4/miR124-2甲基化阴性的CIN2/3女性病283国际妇产科学杂志2023年6月第50卷第3期J Int Obstet Gynecol，June 2023，Vol.50，No.3变消退率最高，分别为88.4%和85.1%，这意味着甲基化检测与细胞学检查或HPV检测相结合可以帮助识别临床消退可能性较高的CIN2/3女性，或许有助于指导对该类女性尤其是具有生育需求女性的观望治疗。另一项多中心回顾性研究也得出相似结论，年轻女性中FAM19A4/miR124-2甲基化阴性的CIN2/3病变与高HPV E4蛋白及低P16ink4a或Ki-67表达相关，意味着更高的宫颈病变消退率32。以上研究提示在年轻的CIN2/3患者中推广DNA甲基化检测或能有效避免过度治疗，这可能是细胞学检查及HPV检测所欠缺的。DNA甲基化检测还能够减少对各种类型宫颈癌的漏诊率。尽管宫颈鳞状细胞癌仍然是最常见的病理类型，但宫颈癌还包括腺癌、腺鳞癌、小细胞癌和透明细胞癌等病理分型，由于这些病理类型较为罕见且形态学特征较为多样化，进行细胞学检查的病理医师可能由于个人经验不足等原因产生漏诊。而对于这些罕见组织学类型的宫颈癌，DNA甲基化的检出率可达98.3%13。另外，DNA甲基化检测可弥补高危型HPV检测无法筛查出的HPV阴性宫颈癌的不足，减少漏诊33。DNA甲基化检测还具有便于采样的优势。甲基化检测可以直接取宫颈脱落细胞样本，定量MSP仅需少量样本中的DNA片段即可进行甲基化定量检测。Schmitz等34的研究证明，采用液体细胞学培养基中的宫颈刮片样本进行GynTect甲基化检测诊断HSIL+病变仍然具有较好的特异度（98.0%）及敏感度（59.7%），表明GynTect甲基化检测时无需额外取样。此外，对血浆样本进行基因甲基化检测也具有一定的临床意义35。另有研究显示尿液样本中甲基化基因标志物ASCL1联合LHX8对CIN3+检测的受试者工作特征曲线下面积可达0.8436，或许同样有望成为宫颈癌筛查和分流的手段。相较于宫颈刮片的取样形式，尿液样本能够更轻松无创地取得，更易被筛查人群接受37，从而进一步减少由于未进行宫颈筛查延误治疗而导致的恶性病变。DNA甲基化检测目前尚未成为宫颈癌筛查的常规分流手段。一方面，目前我国仍然缺乏宫颈癌甲基化检测的大规模多中心临床研究，同时仍需要更多临床试验在诸多宫颈癌甲基化检测基因中甄别具有较优敏感度及特异度的基因。另一方面，甲基化检测费用较高，尽管目前各项研究中甲基化检测主要作为宫颈癌筛查异常基础上的分流手段，但进一步优化甲基化检测技术、降低检测费用仍然十分必要，有利于其临床运用的推广。3结语近年来，越来越多的研究证明基因甲基化具有宫颈癌筛查及分流手段的应用前景，发现PAX1、FAM19A4/miR124-2甲基化检测和GynTect试剂盒在宫颈癌及癌前病变的筛查和分流中具有良好的特异度及敏感度，有望作为宫颈癌筛查HPV检测及细胞学检查的分流手段，有助于降低漏诊率以及优化阴道镜转诊。更为重要的是，这些基因甲基化检测能够辅助判断患者宫颈病变转归，指导临床医师调整进一步诊治方案。然而，目前国内尚缺乏大规模的基因甲基化临床研究，未来仍需进行更多多中心大型临床研究进行验证。此外，目前发现的甲基化基因标志物多来源于对欧美人群的研究，进一步探索适用于中国女性群体宫颈癌筛查及分流的甲基化基因十分必要。参考文献1Sung 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