HPLC同时测定酱香型白酒酒糟中13种有机酸的分析研究.pdf

基金项目：贵州省科技计划项目 遵义市综合检验检测创新公共服务平台能力提升 黔科中引地20214008。DOI：10.13746/j.njkj.2022279HPLC同时测定酱香型白酒酒糟中13种有机酸的分析研究侯睿，向丽萍，张冰雪，任伟，张琴，骆书娜*（遵义市产品质量检验检测院，贵州 遵义 563099）摘要：有机酸对酱香型白酒的香气、味觉和口感有重要的影响，酱香型白酒显著特征表现为“酸高”。为进一步加强白酒中有机酸的品质控制，该研究建立了高效液相色谱(HPLC)法同时测定白酒酒糟中 13 种有机酸的方法，实现了多种有机酸之间有效分离。结果表明，该方法测定 13 种有机酸在0.0001580.0947 mg/mL范围内线性关系良好(R20.99)，峰面积重复性相对标准偏差(RSD)5%，加标回收率84.0%111.0%。采用该方法对同一企业不同车间七轮次酒酒糟进行检测，能准确测定出不同酒糟中13种有机酸的差异，该方法简单快捷、准确可靠，重现性好，证明该方法可用于实际生产中酱香型白酒酒糟中13种有机酸的含量检测。关键词：高效液相色谱法；有机酸含量；白酒酒糟中图分类号：TS262.3；TS261.7文献标识码：A文章编号：1001-9286（2023）08-0103-05Simultaneous Determination of 13 Organic Acids inFermented Grains of Jiangxiang Baijiu by HPLCHOU Rui,XIANG Liping,ZHANG Bingxue,REN Wei,ZHANG Qin and LUO Shuna*(Zunyi Product Quality Inspection and Testing Institute,Zunyi,Guizhou 563099,China)Abstract:Organic acids have important influence on the aroma,taste and flavor of Jiangxiang Baijiu,which is characterized by highacidity.In order to control the organic acid content in Baijiu,an HPLC method was established for simultaneous determination of 13organic acids in the fermented grains of Baijiu,and effective separation of multiple organic acids was realized.The linearity of themethod was good in the range of 0.000158 mg/mL to 0.0947 mg/mL(R20.99),the relative standard deviation(RSD)was less than5%,and the spiked recoveries were in the range of 84.0%to 111.0%.The method was used to test the fermented grains from differ-ent workshops of the same distillery,and their differences in organic acids could be accurately determined.The method is simple,fast,accurate and reliable,and has good reproducibility,which can be used for the detection of the 13 organic acids in the fermented grainsof Jiangxiang Baijiu in actual production.Key words:high performance liquid chromatography;organic acid content;fermented grains of Baijiu酱香型白酒酒糟中的风味物质含量很高，尤其有机酸类，总酸含量可达4%左右，而且其酸的组成丰富，口感协调，主要以乳酸为主1-2。酱香型白酒有机酸大部分是在酿酒发酵中产生的，调节白酒的香气结构，使得白酒具有酒体丰满度和酸爽感。所以，酱香型白酒的酿造过程也是一个对有机酸的利用和控制过程，对酒糟中有机酸的检测必不可少3-4。乳酸是白酒中重要的呈香呈味物质，也是最重要的非挥发性有机酸之一，在酱香型白酒酿造过程中，大量生酸微生物代谢产生的酸参与调控酿酒科技2023年第8期（总第350期）LIQUOR-MAKING SCIENCE&TECHNOLOGY2023 No.8(Tol.350)103103酿酒科技2023年第8期（总第350期）LIQUOR-MAKING SCIENCE&TECHNOLOGY2023 No.8(Tol.350)微生物的分布趋势，导致酱香型白酒中的酸含量比较高，最常见的有乳酸、丁酸等5。目前，白酒酒糟有机酸的检测方法通常有气相色谱/质谱联用法(GC-MS)6、气相色谱法(GC)7、离子色谱法(ICP-MS)8、高效液相色谱法(HPLC)9、液相色谱/质谱联用法(HPLC-MS)10等。气相色谱法适用于挥发性高的脂肪酸检测，不适合热不稳定酸(如乳酸)的检测；液相(质)衍生技术可以实现乳酸等热不稳定酸的检测，但操作繁琐11-13；阴离子交换色谱法可实现白酒短、中链挥发酸和包括乳酸在内的难挥发酸的同时检测，但仪器专用、购置成本高14-15；高分辨液相质谱可实现酒中多种微量有机酸的检测，但仪器和检测成本昂贵16。液相色谱法成本相对较低，流动相常见易得，在白酒有机酸的检测中应用较多，已实现了对乙酸、乳酸及其他热不稳定酸的检测17-20。本试验通过HPLC建立酱香型白酒酒糟中有机酸一步分离方法，采用有机酸标准物质的保留时间定性，峰面积定量，为全面了解酱香型白酒酒糟中有机酸构成与含量变化如何影响酱香型白酒酒质，开展白酒酿造工艺的改进提供一定的依据。1材料与方法1.1材料、试剂及仪器样品：酱香型白酒酒糟样品(3个车间七轮次酒糟，取于遵义市茅台镇某酒厂)。试剂及耗材：苯丙二酸、柠檬酸、维生素C、戊二酸、琥珀酸、草酸、异戊酸、丙酸、丁酸、L-乳酸、苹果酸、奎宁酸、富马酸(标准品)，均购买自上海安谱世标准技术服务有限公司；甲醇(色谱纯)，德国默克公司；磷酸二氢钾(分析纯)，天津市科密欧化学试剂有限公司；盐酸(分析纯)，天津市科密欧化学试剂有限公司。仪器设备：AgiLent-1260 高效液相色谱仪(配备DAD检测器)；Waters T3 色谱柱(4.6 mm250 mm，5 m)；AB265-S电子天平(梅特勒-托利多有限公司)；KQ-600E超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；pH 计(上海精密科学仪器有限公司)；D-24UV超纯水系统(默克密理博)；旋转混匀仪(上海沪析实业有限公司)；离心机(德国SIGMA)。1.2试验方法1.2.1标准溶液配制（1）有机酸储备液配制。分别精确称取 0.1 g苹果酸、0.2 g维生素C、0.2 g戊二酸、0.2 g富马酸、0.2 g琥珀酸、0.2 g 苯丙二酸、0.1 g 柠檬酸、0.05 g乳酸、0.08 g丁酸、0.5 g丙酸、0.5 g异戊酸、0.2 g草酸、0.2 g奎宁酸于10 mL 容量瓶中，用流动相稀释溶解并定容，配制成 10 mg/mL苹果酸、20 mg/mL维生素 C、20 mg/mL 戊二酸、20 mg/mL 富马酸、20 mg/mL 琥珀酸、20 mg/mL 苯丙二酸、10 mg/mL柠 檬 酸、5.0 mg/mL 乳 酸、8.0 mg/mL 丁 酸、50 mg/mL丙酸、50 mg/mL异戊酸、20 mg/mL草酸、20 mg/mL奎宁酸标准储备液，04 冰箱储存。（2）有机酸标准溶液配制。准确移取适量13 种单标储备液混合于 10 mL 容量瓶中，将有机酸储备液按一定比例混合，流动相定容配制成 1.0 mg/mL的混合标准有机酸使用溶液，用流动相配制成不同浓度梯度的系列标准工作溶液。准确移取适量13种单标储备液于10 mL容量瓶中，分别配成1.0 mg/mL的标准使用单标溶液，单标溶液和混合标准溶液中同种类的有机酸浓度相同。04 储存。1.2.2色谱条件的选择色谱柱：Waters T3 色谱柱(4.6 mm250 mm,5 m)；检测波长：210 nm；流速：0.40 mL/min；进样量：10 L；流动相：KH2PO4缓冲溶液(20 mmol/L，pH2.6)和甲醇；柱温：25；梯度洗脱程序见表1，流动相A为KH2PO4缓冲溶液(20 mmol/L，pH2.6)，流动相B为甲醇。表1高效液相色谱梯度洗脱条件时间(min)010132530344068流动相A(%)100.0100.090.080.075.075.058.058.0流动相B(%)0.00.010.020.025.025.042.042.01041042结果与分析2.1色谱条件对有机酸组分分离效果的影响2.1.1流动相中KH2PO4溶液浓度的选择有机酸在酸性环境中比较稳定，容易被分离，参考色谱柱对 pH 值和盐浓度的耐受能力，选择pH2.6的条件下，KH2PO4溶液浓度分别为2 mmol/L、4mmol/L、8mmol/L、10mmol/L、20mmol/L、40mmol/L，其结果表明，在KH2PO4溶液浓度为20 mmol/L时维生素C和L-乳酸达到分离，在其他浓度时峰有重叠现象。2.1.2流动相中甲醇含量的选择在流动相KH2PO4溶液浓度为20 mmol/L时，改变流动相B甲醇的比例，进行梯度洗脱，随着甲醇的比例上升，会导致磷酸盐的析出而造成色谱柱堵塞，故梯度洗脱的终点设置为42%。设置梯度洗脱方式3种，对有机酸分离度较为明显，梯度洗脱见表2。其中梯度洗脱1效果最佳，其他两种洗脱方式会造成色谱峰大部分重叠，在4555 min时会出现基线突然飘高的情况。2.1.3流速的选择在流动相KH2PO4溶液浓度为20 mmol/L，梯度洗脱方式为 1 时，设置流速分别为 0.38 mL/min、0.40 mL/min、0.42 mL/min，由实验可知，0.40 mL/min流速最佳，0.38 mL/min流速过慢，导致维生素C峰有拖尾的现象，影响L-乳酸的出峰情况，0.42 mL/min流速过快，导致丁酸与苯丙二酸峰完全重叠，鉴于二者情况，选择0.40 mL/min的流速。2.2有机酸标准曲线建立使用0.025.0 mg/mL不同浓度梯度的系列标准工作溶液，按1.2方法进行HPLC检测。有机酸单标确定各有机酸的分离时间，13种有机酸HPLC图见图1。进行线性回归方程计算，13种有机酸标准曲线相关系数均大于0.99，取信噪比S/N=3和S/N=10时对应分析物的浓度作为检出限和定量限，表2高效液相色谱梯度洗脱条件线性梯度洗脱1时间(min)010132530344068流动相A(%)10010090.080.075.075.058.058.0流动相B(%)0.00.010.020.025.025.042.042.0线性梯度洗脱2时间(min)081220304050流动相A(%)10010092.085.080.070.058.0流动相B(%)0.00.08.015.020.030.042.0线性梯度洗脱3时间(min)010122025354555流动相A(%)10010087.080.075.065.058.058.0流动相B(%)0.00.013.020.025.035.042.042.0图113种有机酸HPLC图侯睿，向丽萍，张冰雪，任伟，张琴，骆书娜 HPLC同时测定酱香型白酒酒糟中13种有机酸的分析研究105105酿酒科技2023年第8期（总第350期）LIQUOR-MAKING SCIENCE&TECHNOLOGY2023 No.8(Tol.350)结果如表3所示。2.3加标回收试验称取酒糟样品作为空白基质，加入适量有机酸标液，同样品进行前处理，1.2 色谱条件 HPLC 检测，加 标 回 收 结 果 见 表 4，回 收 率 在 84.0%111.0%。2.4重复性与精密度试验取13种有机酸混合标准溶液10.0 L，按照1.2色谱条件进行HPLC检测，连续上样6次，通过分析有机酸的峰面积，计算峰面积的相对平均偏差(RSD)来评价方法的重复性与精密度，峰面积重复性相对标准偏差(RSD)5%，重复性和精密度较好，有机酸混合标准溶液的重复性与精密度见表5。2.5不同车间第七轮次酱香型白酒酒糟有机酸检测称取酒糟样品5.0 g，加入60%乙醇溶液10 mL，涡旋混匀 20 min，在 25 下超声波振荡提取60 min，将浸出液以9000 r/min离心10 min，取上清液，用 0.45 m 尼龙膜过滤后按照 1.2 色谱条件HPLC检测，结果见表6。对三个车间酒糟进行准确定量和比较分析，由表6数据可知，在酱香型白酒生产工艺一样的情况下，三个车间七轮次酒糟的有机酸含量和种类都具有差异性，而且几个车间有机酸的含量各不相同，车间3乳酸含量明显比车间1和车间2高，总的有机酸含量也比较高。在酱香型白酒中，酸度大了，会影响发酵，发酵不好，也会使总酸含量增加，造成出酒率降低。酱香型白酒中乳酸含量是比较高的，表313种有机酸类的标准曲线线性、检出限、定量限化合物奎宁酸维生素C乳酸柠檬酸富马酸苹果酸丙酸戊二酸草酸琥珀酸丁酸苯丙二酸异戊酸RT(min)7.98810.34512.20220.52922.76826.07529.48130.82731.55736.20246.91147.50464.882标准曲线Y=1651.8377X-91.4950Y=25120.4183X-718.0239Y=6973.0266X-115.7334Y=47.0527X-10.4559Y=182.2722X+6.2245Y=37.8662X-7.7063Y=103.4694X-25.8398Y=3019.7884X+25.9029Y=125.9705X-14.8021Y=70.9503X-3.4435Y=125.9705X-14.8021Y=94.4634X-17.3715Y=94.4634X-17.3715相关系数R0.990550.995520.999020.991400.998580.992600.992400.994820.990730.996640.997170.991920.99416检出限(mg/mL)0.03430.01710.03270.04350.0001580.09470.09460.1130.001010.09070.05450.000320.01142定量限(mg/mL)0.1140.05710.1090.1450.005250.3160.3150.3780.00340.3020.1820.001050.0381表4加标回收率试验结果待测组分奎宁酸维生素C乳酸柠檬酸富马酸苹果酸丙酸戊二酸草酸琥珀酸丁酸苯丙二酸异戊酸样品含量(mg/mL)0.20120.14520.15610.56320.01430.56320.59510.74120.32140.75620.24120.02190.1563加标量(mg/mL)0.20.20.20.20.051.00.51.00.21.00.50.051.0测定有机酸量(mg/mL)0.42320.32450.33450.73120.06211.42101.04851.65420.53011.62530.69450.07321.1452实际加标量(mg/mL)0.2220.17930.17840.16800.04780.85780.45340.91300.20870.86910.45330.05130.9889回收率(%)111.089.789.284.095.685.890.791.3104.486.990.7102.698.9106106但是乳酸含量也不能过高，高了可能会影响产量，乳酸含量过低会影响酒质，车间3的酒质和产酒量都是这几个车间中最差的。因此，在酱香型白酒发酵过程中，可以通过检测酒糟中有机酸的含量，进一步加强和优化白酒中有机酸的品质控制，生产出更加优质的酱香型白酒。3结论利用高效液相色谱法（HPLC）建立酱香型白酒酒糟有机酸定性定量的方法，实现了13种有机酸的有效分离，该方法处理简单，流动相为常见的甲醇和水，方法快速高效，且样品检测方法精密度、重复性、回收率实验基本符合要求。本方法可以用于检测酒糟有机酸的含量，进一步加强和优化白酒中有机酸的品质控制，生产出更加优质的酱香型白酒，为开展白酒酿造工艺的改进提供一定的技术支撑。参考文献：1左上春,杨海泉,邹伟.白酒酒糟资源化利用研究进展J.食品工业,2016,37(1)：246-249.2郝俊光,柯峰,梁振荣,等.液相法测定米香型白酒发酵液中18种有机酸J.食品工业科技,2021,42(19)：283-290.3杨会,范文来,徐岩.基于BSTFA衍生化法白酒不挥发有机酸研究J.食品与发酵工业,2017,43(5)：192-197.4张建林,穆文斌,李加运,等.利用HPLC测定白酒中乳酸的研究J.酿酒,2003(2)：14-15.5张方,张宿义,苏占元,等.有机酸对浓香型白酒品质及其酿造过程影响的研究进展J.酿酒科技,2016(1)：94-97.6江思瑶,宋昊,陈晨,等.白酒酒糟中有机酸的分离提取及香气成分分析J.食品工业科技,2019,40(17)：206-211.7龙霄,吕鑫,朱文旭,等.应用高产酯酿酒酵母丢糟加粮再发酵生产高档清香型白酒的研究J.酿酒科技,2017(10)：28-30.8孙鹏飞,张福艳,吴海静,等.衡水老白干酒中产酸微生物的分离鉴定及性能研究J.中国酿造,2016,35(3)：36-40.9周小兵.白酒酒糟发酵生产丁二酸D.无锡：江南大学,2013.10廖勤俭,王小琴,周韩玲,等.高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱法鉴别白酒中的羧酸J.酿酒科技,2019(12)：77-81.11HUFNAGEL 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of表513种有机酸的峰面积重复性与精密度化合物奎宁酸维生素C乳酸柠檬酸富马酸苹果酸丙酸戊二酸草酸琥珀酸丁酸苯丙二酸异戊酸峰面积11416.98011330.348663.4503253.45255.7543455.46411.51030.40637.950763.91842.41245.0381933.342峰面积21437.24711950.142674.8373325.67758.1703356.41212.25030.80537.750747.99143.48344.4051950.471峰面积31456.59211177.336681.8943432.87357.6603514.21311.16829.80139.067720.27841.36045.3111996.929峰面积41488.67111274.888672.8253307.58156.3773414.21011.22430.77638.190735.90642.27247.4521997.554峰面积51422.62511132.387725.6843465.75456.0673445.45211.33430.48839.628726.00242.24342.2701967.637峰面积61424.79710864.177729.4133336.66956.7183433.78511.05029.42638.789725.19742.82643.6411990.182RSD(%)4.153.212.391.661.513.801.831.882.261.663.901.363.00表6不同车间第七轮次酱香型白酒酒糟有机酸含量(mg/mL)编号车间1车间2车间3乳酸5.707.4627.5丙酸NDND1.78草酸0.290.740.66丁酸0.213.140.33苯丙二酸0.020.310.04异戊酸22.424.526.6注：ND表示未检出。（下转第111页）侯睿，向丽萍，张冰雪，任伟，张琴，骆书娜 HPLC同时测定酱香型白酒酒糟中13种有机酸的分析研究107107倍成50%vol乙醇溶液，分别使用优化前和优化后的方法，开展6次酒精度分析，测试了分析的准确度（回收率），试验结果分别见表3和表4。对密度瓶法测定白酒酒精度的分析方法优化、细化前后准确度进行分析，方法优化、细化前的回收率（准确度）在99.4%100.5%之间，方法优化、细化后的回收率（准确度）在 99.8%100.2%之间，回收率得到了提升，准确率得到了提高。实验证明优化后的方法完全能满足白酒酒精度分析，特别是出口酒酒精度分析要求。3结论采用蒸馏仪代替全玻璃蒸馏器，对容量瓶法测定酒精度分析方法的一些环节进行细化、优化和严格控制，提高了分析结果的准确性和精密度，提升了酒精度分析检测和质控把关能力，特别是出口美国和加拿大的酒类企业，能够更好地满足出口酒酒精度分析的把关要求，为产品更好地走向世界作出应有的努力和贡献。参考文献：1中国轻工业联合会.白酒工业术语：GB/T 151092021S.北京：中国标准出版社,2021.2JIN G Y,ZHU Y,XU Y.Mystery behind Chinese liquorfermentationJ.Trend food sci technol,2017,63：18-28.3JIAW,FAN Z B,DUA,et al.Recent advances in Baijiuanalysis by chromatography based technology:a reviewJ.Food chem,2020,324：126899.4LI Z F,WANG N,RAGHAVAN G S V,et al.Volatilesevaluation and dielectric properties measurements ofChinese spirits for quality assessmentJ.Food Bioprocesstechnol,2011,4：247-253.5国家卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准 酒中乙醇浓度的测定：GB 5009.2252016S.北京：中国标准出版社,2017.表3优化、细化前回收率结果n1次2次3次4次5次6次实测酒度(%vol)49.8249.6850.0950.2449.8149.92回收率(%)99.699.4100.2100.599.699.9表4优化、细化后回收率结果n1次2次3次4次5次6次实测酒度(%vol)49.9250.0349.9749.9450.0849.96回收率(%)99.8100.1100.099.9100.2100.0chromatographyA,1996,736(1/2)：351-357.14沈怡方.白酒生产技术全书M.北京：中国轻工业出版社,2011：768-769.15王银辉,沈小梅,马雷,等.高效液相色谱-四级杆串联质谱仪(UPLC-MS/MS)同时测定白酒中7种有机酸的分析研究J.酿酒,2016,43(1)：43-45.16潘丙珍,刘青,庞世琦,等.离子色谱法测定酒中的有机酸和无机阴离子J.现代食品科技,2013,29(4)：876-880.17李维青.浓香型白酒与乳酸菌、乳酸、乳酸乙酯J.酿酒,2010,39(3)：90-93.18国家卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准 食品中有机酸的测定：GB 5009.1572016S.北京：中国标准出版社,2017.19BORING C B,PORUTHOOR S K,DASGUPTAP K.Wet effluent parallel plate diffusion denuder coupledcapillary ion chromatograph for the determination ofatmospheric trace gasesJ.Talanta,1999,48(3)：675-684.20成林,成坚,王琴,等.原辅料对粮食酿造酒质量影响的研究进展J.酿酒科技,2020(9)：97-107.（上接第107页）欢迎订阅酿酒科技何世兴，杨果，时源，赵玲，刘莹，张婷 密度瓶法测定白酒酒精度的分析方法优化研究111111