白藜芦醇_siRNA胶束复合物的载药和释药性能研究.pdf

1第35卷 第2期2023年VOL.35NO.22023菏 泽 医 学 专 科 学 校 学 报JOURNALOFHEZEMEDICALCOLLEGEDOI:10.3969/j.issn.1008-4118.2023.02.001*白藜芦醇/siRNA 胶束复合物的载药和释药性能研究贾莉，苗方，张卫敏，安芸，董晓辉，马兰（菏泽医学专科学校，山东 菏泽 274000）摘要：目的 研究 pH 和还原性双响应白藜芦醇/siRNA 胶束复合物（MCpH/RedoxRes-siRNA）的载药和释药性能。方法 采用紫外分光光度法和荧光分光光度法分别建立白藜芦醇（Resveratrol，Res）和 FAM-siRNA 体外分析方法，超速离心法和超滤离心法测定 MCpH/RedoxRes-siRNA 中药物的包封率（Encapsulation Efficiency，EE%）和载药量（Drug Loading，DL%），透析法测定 MCpH/RedoxRes-siRNA 中药物的释放性能。结果 Res 和 FAM-siRNA 的体外分析方法均符合方法学要求；MCpH/RedoxRes-siRNA中Res的EE%为（92.21.74）%、DL%为（9.721.63）%，FAM-siRNA 的EE%为（94.51.42）%；MCpH/RedoxRes-siRNA中Res释放具有pH敏感性，siRNA的释放呈现pH和还原环境依赖性，在pH 5.5和还原性环境中，Res 和 FAM-siRNA 释放较为迅速和完全。结论 MCpH/RedoxRes-siRNA 具有较好的Res 和 siRNA 载药性能和释放性能。关键词：胶束复合物；载药性能；释药性能中图分类号：R285 文献标识码：A 文章编号：1008-4118（2023）02-0001-04Study on drug loading and drug release properties of Resveratrol/siRNA micellar polyplexesJIA Li,MIAO Fang,ZHANG Weimin,AN Yun,DONG Xiaohui,MA Lan（Heze Medical College，Heze 274000，Shandong）Abstract:Objective To study the drug loading and drug release properties of pH and reducing double-responsive Resveratrol/siRNA micellar polyplexes(MCpH/RedoxRes-siRNA).Methods UV spectrophotometry and fluorescence spectrophotometry were established for Resveratrol(Res)and FAM-siRNA in vitro respectively.Encapsulation Efficiency(EE%)and Drug Loading(DL%)of Res and FAM-siRNA in MCpH/RedoxRes-siRNA were determined by ultrafiltration centrifugal method and ultrafiltration centrifugal method.The drug release properties in MCpH/RedoxRes-siRNA was detected by dialysis.Results The EE%of Res and DL were(92.21.74)%,(9.721.63)%in MCpH/RedoxRes-siRNA.The EE%of FAM-siRNA were(94.51.42)%.The release of Res in MCpH/RedoxRes-siRNA was pH-responsive,and the release of siRNA is pH and reducing environment dependent.In pH5.5 and reducing environment,the release of Res and FAM-siRNA is rapid and complete.Conclusion MCpH/RedoxRes-siRNA have good Res and siRNA delivery and release properties.Key words:Micellar polyplexes;Drug load property;Drug release property基金项目：山东省中医药科技项目(2021M204)基聚乙二醇-聚丙交酯-聚组氨酸-（二硫键合）-聚乙烯亚胺（mPEG-b-PLA-PHis-ss-OEI）共聚物，利用 OEI 与 siRNA 之间的静电作用力，制备并研究了单独包载 siRNA 的递送系统2。由于共聚物中具有疏水嵌段 PLA 和 PHis，可包载疏水性中药单体 Res 和 siRNA 形成胶束复合物 MCpH/抗肿瘤治疗中，利用纳米载体共递送药物可实现肿瘤多靶点精准靶向、高渗透性、快速高效的细胞摄取、降低毒副作用，达到协同抗癌作用1。然而，联合递送药物的载药和释药性能是共递送药物发挥抗肿瘤治疗作用的前提和关键。本研究前期成功合成了 pH 和还原性双响应功能的单甲氧2 第35卷 第2期2023年VOL.35NO.22023菏 泽 医 学 专 科 学 校 学 报JOURNALOFHEZEMEDICALCOLLEGERedoxRes-siRNA。本研究深入研究了 MCpH/RedoxRes-siRNA 的载药和释药性能，为其实现共递送药物应用于抗肿瘤治疗研究奠定了坚实的制剂基础。1仪器与试药DL-180 型超声仪（浙江省象山县石浦海天电子仪器厂）；超高速低温离心机（美国贝克曼公司）；FA 1104 电子天平（上海民桥精密科学仪器有限公司）；TDL-16B 台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；微量移液器（美国Thermo公司）；SPR-DT12A 药物溶出度仪（天津赛普瑞实验设备有限公司）；RE-52AA 旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；DF-101S 集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市英峪华仪器厂制造）。MCpH/RedoxRes-siRNA（实验室自制，批 号 20210103）；FAM-siRNA（上 海 吉玛 制 药 技 术 有 限 公 司，Sense strand5-3：UUCUCCGAACGUGUCACGUTT，5-3：ACGUGACACGUUCGGAGAATT)；白藜芦醇（纯度 99%，上海阿拉丁试剂有限公司），Amicon Ultra-4 超滤管（NMWL=50 kD）；透析袋（进口分装，上海绿鸟科技有限公司）；甲醇、乙腈、PBS 缓冲液等试剂（分析纯，国药化学试剂有限公司）。2方法2.1 Res 体外分析方法的建立3 配制一定浓度的Res、FAM-siRNA 和空白胶束的溶液，以甲醇为空白对照，于 200 800 nm 波长范围内扫描并绘制紫外-可见吸收光谱。Res 在 306 nm 波长处有最大吸收，FAM-siRNA 和空白胶束在此处均无吸收，因此确定 306 nm 为 Res 的检测波长。该方法专属性符合要求。取 Res 适量，精密称定后，配置成浓度约 1.0 mg/mL 的 Res 甲醇储备液。精密量取 Res 甲醇储备液溶液适量，加甲醇溶液配置成系列浓度的Res 标准溶液。紫外分光光度法（检测波长为 306 nm）测定系列浓度 Res 标准溶液的吸光度值 A，绘制吸光度值 A-浓度 C 标准曲线。取高、中、低浓度的 Res 标准溶液各 5 份，测定日内和日间精密度。取适量空白胶束和 FAM-siRNA 混合溶液，加入适量 Res 标准溶液，测定并计算回收率。上述实验均重复 3 次。2.2 FAM-siRNA 体外分析方法的建立4 取 1 OD FAM-siRNA 粉末加入 125 L DEPC 水溶液溶解，配 置 成 FAM-siRNA 储 备 液。取 适 量 的 FAM-siRNA 储备液，用 DEPC 水溶液分别配置系列浓度的FAM-siRNA标准溶液。采用荧光分光光度法，选择激发波长（Ex）为 480 nm、发射波长（Em）为 520 nm，测定各浓度 FAM-siRNA 标准溶液的荧光强度 F，并绘制荧光强度 F-浓度 C 标准曲线。取高、中、低浓度的 FAM-siRNA 标准溶液各 5份，测定日内和日间精密度。取适量空白胶束和Res 混合溶液，加入适量 FAM-siRNA 标准溶液，测定并计算回收率。上述实验均重复 3 次。2.3 Res 包封率和载药量测定 采用超速离心法分离 游 离 Res，测 定 MCpH/RedoxRes-siRNA 的包封率（EE%）和载药量(DL%)。取适量 MCpH/RedoxRes-siRNA 溶液，于 12 000 rpm 离心 10 min 后，取上清液，过 0.22 m 微孔滤膜。精密吸取该溶液 1.0 mL 置于 10 mL 容量瓶中，加甲醇定容后，按建立的“2.1 Res 体外分析方法”测定吸光度值 A，计算 Res 浓度，计算得 MCpH/RedoxRes-siRNA 中 Res 的 量。另 取 1.0 mL MCpH/RedoxRes-siRNA 溶 液，置 于 10 mL 容量瓶中，加入甲醇定容，测定吸光度值 A，带入标准曲线计算 Res 浓度，得 MCpH/RedoxRes-siRNA 中 Res 的总量，上述实验均重复 3 次。其中：Wtotal 是制备时加入 Res 的量，WRes和 Wcopolymer 分别为胶束复合物中 Res 和共聚物材料的量。2.4 FAM-siRNA 包封率测定 采用超滤离心法测定MCpH/RedoxRes-siRNA中siRNA的包封率。精密吸取 1.0 mL MCpH/RedoxRes-siRNA，加至3第35卷 第2期2023年VOL.35NO.22023菏 泽 医 学 专 科 学 校 学 报JOURNALOFHEZEMEDICALCOLLEGEAmicon Ultra-4 超滤管（NMWL=30 kD）中，于6 000 rpm 离心 10 min。精密吸取 0.5 mL 管套中所得的滤液，用DEPC水定容至10 mL，按建立的“2.2 FAM-siRNA 体外分析方法”，测定荧光强度 F，并代入标准曲线中计算游离 FAM-siRNA 浓度。按下述公式计算FAM-siRNA包封率（Encapsulation Efficiency，EE%）。上述实验均重复 3 次。其中：ntotal 为加入 FAM-siRNA 总量，nfree为未包裹入胶束复合物 FAM-siRNA 量。2.5 不同 pH 及还原条件下胶束复合物的药物触发 释 放 行 为5 取 MCpH/RedoxRes-siRNA 溶液 2.0 mL，置于截留分子量为 30 000 的透析袋中。采用溶出度测定仪，将透析袋固定在桨上，分别置于 pH 7.4、pH 5.5、pH 7.4+20 mM DTT 和pH 5.5+20 mM DTT 的透析介质中（PBS 缓冲溶液，200 mL，370.5），设置转速 1 000 rpm，按照事先设定的时间点取样，同时补充相同温度和体积的新鲜透析介质。按照 Res 体外分析方法和 FAM-siRNA 体外分析方法测定样品中 Res 和FAM siRNA 的含量，计算 24 h 药物累计释放量，并绘制累计释放曲线，上述实验均重复 3 次。2.6 统计学处理 采用 Excel 软件对数据进行处理和统计学分析，数据均用xs表示。3结果3.1 Res 体外分析方法的建立 Res 的体外分析标准曲线方程为 A=0.124C+0.0622，R2=0.9995，符合分析要求。测定高、中、低浓度的 Res 溶液的日内的相对标准偏差，分别为（1.030.21）%、（4.95 1.06）%、（10.05 1.11）%；日间的相对标准偏差，分别为（1.050.09）%、（5.01 0.05）%、（10.09 1.22）%，日内和日间的精密度均良好，符合方法学要求。取适量空白胶束和 FAM-siRNA混合溶液，加入适量 Res 标准溶液，测定回收率为（99.51.75）%，符合方法学要求。3.2 FAM-siRNA 体外分析方法的建立 FAM-siRNA 的体外分析标准曲线方程为 F=1083.7C-328.59，R2=0.9999，符合分析要求。测定高、中、低浓度的 FAM-siRNA 溶液的日内的相对标准偏差，分别为（1.310.12）%、（5.350.87）%、（13.400.98）%；日间的相对标准偏差，分别为（1.320.25）%、（5.360.95）%、（13.301.20）%，日内和日间的精密度均良好，符合方法学要求。取适量空白胶束和 Res 混合溶液，加入适量 FAM-siRNA 标准溶液，测定回收率为（99.51.23）%，符合方法学要求。3.3 胶束复合物的包封率和载药量 采用超速离心法测定 MCpH/RedoxRes-siRNA 中 Res 包封率和载药量分别为（92.21.74）%、（9.721.63）%。采用超滤离心法测定 MCpH/RedoxRes-siRNA 的siRNA 包封率为（94.51.42）%。3.4 胶束复合物的释药性能 MCpH/RedoxRes-siRNA 中 Res 在不同 pH 及还原性条件下的累计释放曲线如图 1A 所示，pH7.4 生理条件下，无明显的凸释现象，释放曲线平缓。随着 pH 降低至 5.5，Res 释放速度明显增加，2 h 的累计释放量即达到 了（43.84.23）%，表 明 MCpH/RedoxRes-siRNA 的 Res 释放具有 pH 敏感性，pH 降低，释放速度和累积释放量均显著增加。而 DTT 还原性条件对胶束复合物中 Res 的释放几乎无影响。MCpH/RedoxRes-siRNA 中 siRNA 在 不 同pH 及还原性条件下的释放行为如图 1B 所示。与Res 释放行为不同，siRNA 的释放呈现 pH 和还原环境依赖性。在 pH 5.5+DTT 环境中，siRNA 累积释放量为（82.56.04）%。与正常生理环境（pH 7.4）相比，溶酶体环境（pH 5.5+20mM DTT）可显著提高 MCpH/RedoxRes-siRNA 中 siRNA 的累积释放。100806040200Res cumulatlve release(%)0 10 20Time(h)ApH7.4 pH7.4+DTT pH5.5 pH5.5+DTT 4 第35卷 第2期2023年VOL.35NO.22023菏 泽 医 学 专 科 学 校 学 报JOURNALOFHEZEMEDICALCOLLEGE4讨论4.1 MCpH/RedoxRes-siRNA 的载药性能 Res是目前抗肿瘤治疗中极具前景的中药单体，具有抗菌、抗氧化、免疫调节、抗衰老、抗肿瘤等多种药理活性。由于白藜芦醇口服生物利用度和在水中的溶解度均较低，限制其药物的应用6。本研究构建的 MCpH/RedoxRes-siRNA 具有 mPEG为亲水性外壳，PLA-PHis 为疏水性内核的球形结构。疏水性药物 Res 可以通过疏水作用包载于胶束内核结构，包封率和载药量均较高。siRNA 本身非常不稳定，在血液中会被核酸酶降解，另外，siRNA 结构中含有多个磷酸酯键而带有大量的负电荷，很难进入到带负电的细胞膜之内2。胶束复合物结构中的 PEI 嵌段具有多个亚胺正电荷，可与 siRNA 通过静电作用结合，将 siRNA 包裹至胶束内部，包封率较高。4.2 MCpH/RedoxRes-siRNA 的释药性能 胶束复合物用于抗肿瘤药物递送，具有靶向性高、生物利用度高等独特优势7。胶束复合物将药物递送至肿瘤细胞的溶酶体内，药物只有在肿瘤细胞的溶酶体环境(pH 4.55.5，还原性)中快速释放，才能发挥其抗肿瘤治疗作用。MCpH/RedoxRes-siRNA 结构中的 PHis 嵌段具有 pH 敏感性。在酸性环境中，组氨酸结构质子化造成 PHis 嵌段其由疏水-亲水转变，PHis 嵌段由疏水性胶束内核向亲水性胶束外壳迁移8，胶束内核结构紊乱，原来由疏水作用力包载至胶束内核的Res，快速释放。与此同时，与聚组氨酸嵌段相连的二硫键暴露，还原性环境致使其断裂，实现 siRNA 触发释放。5结论本研究建立了紫外可见分光光度法测定 Res和荧光分光光度法测定 FAM-siRNA 的体外分析方法，并测定了 MCpH/RedoxRes-siRNA 的包载性能。研究结果显示 MCpH/RedoxRes-siRNA 包载性能良好，可用于 Res 和 siRNA 的联合递送。MCpH/RedoxRes-siRNA 中 Res 和 siRNA 释放行为结果表明，在正常生理条件下，MCpH/RedoxRes-siRNA 能够稳定包载 Res 和 siRNA，释放速度较慢，而在肿瘤细胞溶酶体环境（酸性，还原性）中，MCpH/RedoxRes-siRNA 能 够 快 速 响应低 pH 和还原性环境，均可以快速释放 Res 和siRNA，MCpH/RedoxRes-siRNA 具有良好的释放性能。本研究为 MCpH/RedoxRes-siRNA 用于抗肿瘤治疗，提供了坚实的制剂学基础。参考文献：1 裴希为,冯强,王坚成.和厚朴酚与 siRNA 共递送的阳离子脂质体研究 J.中国药学杂志,2015,50(18):1613-1618.2 王琪,朱嘉,贾莉,等.pH/氧化还原双敏感聚合物的合成与siRNA 复合胶束的制剂学性质 J.沈阳药科大学学报,2019,36(7):570-579.3 郑湘娟,余淑娴,徐晓芳,等.紫外分光光度法测定虎杖中白藜芦醇的含量 J.时珍国医国药,2008(8):1881-1882.4 李锴森,王如东,彭玮,等.核黄素修饰的脂质复合纳米粒共递送 CXCR4 siRNA 和阿霉素治疗高转移性癌症（英文）J.Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences,2021,30(3):189-205.5 GAO Yan,JIA Li,WANG Qi,et al.pH/Redox Dual-Responsive Polyplex with Effective EndosomalEscape for Codelivery of siRNA and Doxorubicin against DrugResistant Cancer CellsJ.ACS Applied materials&interfaces,2019,11:16296-16310.6 王卉,赵海霞,张晓君,等.白藜芦醇 pH 敏感共聚物胶束的制备与大鼠体内药动学 J.沈阳药科大学学报,2016,33(5):339-344,350.7 白文静,夏春玉,李曼,等.共递送 IR-780 及 18-甘草次酸的还原敏感胶束型纳米粒的构建及其抗肿瘤效果评价 J.药学学报,2022,57(1):211-221,278.8 贾莉,高岩,马晶晶,等.载阿霉素 pH 敏感复合胶束的制备及体内药动学 J.沈阳药科大学学报,2020,37(11):12-18.收稿日期：2023-02-13图 1MCpH/RedoxRes-siRNA 胶束复合物中 Res 和siRNA 在pH7.4、pH5.5、pH7.4+20mMDTT 和pH5.5+20mMDTT 条件下的累计释放曲线（n=3）100806040200siRNA cumulatlve release(%)0 10 20Time(h)BpH7.4 pH7.4+DTT pH5.5 pH5.5+DTT